荧光定量PCR技术原理与结果分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光定量PCR技术原理与结果分析,罗喜鹏,1,一、含义,二、优越性,三、应用,四、定量方法,五、荧光材料,六、结果分析,2,一、含义,实时荧光定量PCR技术,(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,3,二、优越性,特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。,敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml，对数期分析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量较为准确，标本不需稀释。,重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。,自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。,4,三、应用,用于核酸的定量如RNA、DNA的定量,用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA变异分析，溶解曲线分析等。,5,四、,定量方法,1.标准曲线法的绝对定量,2.标准曲线法的相对定量,3.比较CT法的相对定量,6,五、,荧光材料,荧光探针和荧光染料,SYBR green I,水解探针TaqMan,分子信标,杂交探针,7,SYBR green I,未结合的SYBR green I,8,水解探针TaqMan,荧光素,淬灭剂,与目标序列互补,FAM,TET,JOE,HEX,VIC,TAMRA,DABCYL,9,探针与目标序列配对时,，,发生,荧光共振能量转移,(FRET),光,能量转移,Taq,游离的探针,荧光基团,淬灭剂,延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号,Taq,发出荧光,光,另一波长的荧光,10,分子信标,荧光基团,茎由互补配对的序列组成,环与目标序列互补,淬灭剂,茎,(5-7bp),环,（15-30bp）,FAM,Texas Red,11,探针杂交到DNA模板,光,发出荧光,DNA 模板,淬灭剂,茎,环,光,淬灭,12,杂交探针,5,5,5,发出荧光,5,5,5,5,13,六、结果分析,基线（Baseline）,指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。,光域值threshold的设定,一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。,14,CT值,表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。,15,基线期,指数期,线性期,平台期,荧光阈值线,CT值,16,融解曲线分析,融解温度TM,17,18,非特异扩增产物,目的基因产物,19,比较CT法的相对定量表达差异计算,假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出,目的基因的量,=2,-Ct,C,t,=(C,t,目的基因,-C,t,管家基因,),实验组,-(C,t,目的基因,-C,t,管家基因,),对照,2,-,Ct,表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,20,