荧光染料选择和数据分析.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,荧光染料的选择及数据分析,张新梅,From BD Biosciences,荧光染料的选择,什么是流式细胞仪,在流动的状态中检测颗粒性物质各种物理及生物特征的一种仪器；,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,流式细胞仪原理,检测信号,散射光信号,前向散射光信号(,FSC),侧向散射光信号(,SSC),荧光信号,流式细胞仪原理,散射光信号,当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（,FSC）。,与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（,SSC）。,流式细胞仪原理,前向角散射光信号（,FSC）,FSC,反映细胞大小，一般来说，细胞越大，前向角散射光信号越强；,FSC,信号与细胞的折射率有关；,可用于表示细胞的凋亡；,区分死/活细胞时，可用于设门；,流式细胞仪原理,侧向角散射光信号（,SSC）,SSC,信号主要反映了细胞的内部结构，内部结构越复杂，,SSC,信号越强；,流式细胞仪原理,FSC,和,SSC,信号用于检测并显示细胞的物理学特征,中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,Side Scatter,Forward Scatter,0,200,400,600,800,1000,0,200,400,600,800,1000,流式细胞仪原理,荧光信号,当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。,流式细胞仪原理,流式细胞仪原理,流式细胞仪特点及检测标本,特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；,可检测的样本种类多样,(1),外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞,(2),New!,血清、血浆、培养上清、细胞裂解液,荧光染料选择的必要性,多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的发现及抗体标记物的发展,但抗体组合选择非常复杂，如果随意选择荧光素搭配的抗体，不可能得到合适的结果。,在荧光染料的选择上多一点考虑，就可避免重复实验和错误的结果。,流式细胞仪原理,荧光信号,激发波长,荧光素,发射波长,了解你的仪器,基本要求,-,了解你的仪器,试剂的选择从了解你的仪器的配置开始,激光（激发光源）：是否可以激发待选的荧光素,检测器：是否有足够的检测器来检测所要用的荧光抗体组合,光路设计：影响特别染料的检测效率,滤片：宽滤片提高检测能力，但也会检测到更多干扰光,荧光染料,488nm,激光激发的染料,荧光染料,633nm,激光激发的染料,(APC),595 nm and 633 nm EXCITED DYES,荧光染料,UV,激光激发的染料,荧光染料,常见荧光染料的发射波长,了解荧光素的性质,了解荧光素的相对荧光强度,荧光素,/,单抗结合物的亮度,每种荧光素的相对荧光强度不同,Cascade Blue,APC-Cy7,FITC,PE-Cy7,Texas Red,PE,PE-Cy5,APC,0,2,4,6,8,10,0.28,0.95,1.0,1.4,2.8,4.6,6.2,9.2,Relative Brightness,Positive/negative,Positive/autofluorescence,CD8 fluorescence of CD3+cells,Data:Dr.Mario Roederer,Stanford Univ.,了解荧光素的相对荧光强度,各种荧光素在,BD LSRII,流式细胞仪上的染色指数,了解荧光素的相对荧光强度,每种荧光素的相对荧光强度不同,对一个既定的单抗来讲，因为结合的荧光素不同，阳性,/,阴性细胞的,S/N,比值可相差,4-6,倍,FITC,PE,Cy-Chrome,Cy7-PE,TexasRed,APC,PharRed,Cascade Blue,1,10,100,1,10,100,Fluorescence Intensity,Relative Number of Cells,1,10,100,1,10,100,Data:Dr.Mario Roederer;,Stanford University,Neg Control,Positive(CD8-X),了解荧光素的相对荧光强度,每种荧光素的相对荧光强度不同,不同仪器的激光及滤片组合不同，荧光素的相对荧光强度也不同,0.1,1,10,100,0.1,1,10,100,0.1,1,10,100,0.1,1,10,100,0.1,1,10,100,0.1,1,10,100,1000,FITC,PE,Cy-Chrome,PerCP,PharRed,APC,Vantage,89,222,136,20,562,104,Calibur,109,359,209,150,239,27,了解荧光素的相对荧光强度,F/P,比值,抗体上荧光素分子的多少（,F/P,）也会影响相对的荧光强度。,FITC,和,PerCP,的结合物通常一个抗体分子上结合几个（,2-9,个，依抗体而定）荧光素分子。,APC,和,PE,与抗体结合一般是,1,：,1,。,复合染料,PE-CY7,和,APC-CY7,一般一个,PE/APC,分子结合多个,CY7,分子，一个,PE/APC,分子与抗体,1,：,1,结合,与之相反的是，复合染料,PerCP-CY5.5,，,PerCP,与,CY5.5,的比例是,1,：,1,因为荧光素结合的化学因素的关系，,IgM,抗体一般与小分子的荧光素联结，如,FITC,、,Texas-Red,、,CY3,、,CY5,。,复合荧光染料,-Tandem dye,Isolated donor,Donor distance too great,Donor distance correct,复合荧光染料,被激发的,Donor,荧光素将能量转移给受者,acceptor,需要满足条件,:,Donor,的发射波长与,acceptor,的激发波长有重叠,Donor,和,Acceptor,分子之间的距离不能太远,(,100A),复合荧光染料,Fluorescence Resonance Energy Transfer,Intensity,Wavelength,Absorbance,DONOR,Absorbance,Fluorescence,Fluorescence,ACCEPTOR,Molecule 1,Molecule 2,荧光染料,多色分析,荧光素的选择原则,选择荧光素需要考虑,抗原的密度,高表达的抗原可选择几乎所有的荧光素,低密度表达的抗原需要可提供较高,S/N,比值的荧光素如,PE/APC,选择荧光素需要考虑,自发荧光,每种细胞群都有不同水平的自发荧光,所有的荧光通道均可观察到自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。,对自发荧光较强的细胞，选择发射波长长的荧光素（如,APC,）可得到较好的,S/N,比值。,对自发荧光比较弱的细胞，发射波长长的荧光素对,S/N,提高没有明显的改善。可选用,FITC,。,选择荧光素需考虑,非特异结合,许多荧光抗体可产生低水平的非特异结合，使阴性细胞群的荧光超出自发荧光。,非特异结合由下列因素引起,单克隆抗体的同型抗体：一些,IgG,同型抗体可能与一些细胞上的,Fc,受体结合,所用的荧光素,羰花青染料（如,CY3,、,CY5,、,CY5.5,、,CY7,）和,Tex-Red,直标的抗体及一些复合染料标记的抗体在标记某些亚群的细胞时有时会提高结合率。,对,CY5,来说，是因为该染料与低亲和力,FC,受体的极低亲和力相互作用。这也是复合染料,PE-CY5,的特性。,选择荧光素需考虑,复合染料：小心信号衰退,复合染料因为光、固定剂或温度升高会致信号衰退，使复合染料在上一级染料处发光。该种现象从一小部分亚群开始，导致,APC,或,PE,染色细胞群假阳性。,减少样本暴露于光、高温或固定剂，可很大程度上避免这一问题。,选择染料时要考虑：复合染料的信号衰退会不会降低,APC,或,PE,的灵敏度。如果是，就要选择另外的试剂搭配。,如果样本需要固定，要选择稳定的固定剂，可有效阻止复合染料的信号衰退。,BD,：,338036,选择荧光素需考虑,仪器配置的差异，多色分析不可能全选“最亮”的荧光素，但对于特定的一款仪器，可以根据荧光的强弱列出可选的染料,亮度的判断：就是荧光染料的灵敏度，区分背景和弱阳性信号的能力,影响背景的因素有检测器的电子噪音、细胞自发荧光、来自其他检测器的信号干扰，这些因素也增加了阴性荧光峰的宽度（标准差）,灵敏度好的标准是染色指数：,D,W,，,D,指的是阳性峰与阴性峰的平均荧光强度的差；,W,是阴性峰的,2SD,。,选择荧光素需考虑,荧光信号之间的干扰，会增加信号检测背景,荧光信号强细胞群体的,SD,比荧光信号弱的细胞群体大。,多色分析时，一种荧光素（如,FITC,）的光会漏入相邻的荧光素（如,PE,）的检测器。漏入的光越多，需要补偿的越多，对分辨率的影响越大。尤其是弱表达的信号。,选择荧光素需考虑,多色荧光信号之间的干扰选择荧光素需考虑,多色荧光信号之间的干扰,IFN,APC+CD8 APC-CY7+CD4 PE+IL-2 PE-CY7,选择荧光素需考虑,多色荧光信号之间的干扰,IFN,APC+CD4 PE+IL-2 PE-CY7,选择荧光素需考虑,多色荧光信号之间的干扰,选择荧光素需考虑,多色荧光信号之间的干扰,选择荧光素需考虑,多色荧光信号之间的干扰,选择荧光素需考虑,尽量减少荧光信号之间的干扰,检测的颜色越多，面临的荧光信号之间的干扰越多,选择试剂组合时尽可能降低荧光发射波长之间的重叠,组合荧光素选择,常见的,6,、,8,、,10,色荧光染料组合,设立对照，以证实试剂组合有效,真实性对照（,fidelity control,）：单一的荧光抗体染色与试剂组合染色结果比较，以确保试剂组合中的其它试剂不影响结果。,减去一个荧光对照（,Fluorescence-minus-one control,FMO,）：除去一个荧光抗体，将其他所有试剂组合在一起。,荧光素选择原则,上述原则可能相互冲突，但要取得平衡以得到最佳结果。,原则,1,：选择适合仪器配置的最“亮”的荧光染料,原则,2,：选择光谱重叠最少的荧光素,原则,3,：为最“暗”的抗体选择最“亮”的荧光素，反之亦然,原则,4,：尽量避免“亮”细胞群的光漏入对灵敏度要求高的细胞群的检测器中,原则,5,：采取步骤，避免复合染料信号衰退，考虑到可能对结果造成的影响。,数据分析,数据分析,检测指标,阳性百分率（%）,绝对计数（个/,L,）,平均荧光强度（,MFI）,数据分析,直方图和点图,数据分析,设门,用来限定感兴趣的细胞群；,FSC vs SSC,点图是传统上用于设门的图；,分析淋巴细胞群时，,CD45 vs SSC,点图设门更优于,FSC vs SSC,点图设门；,数据分析,设门-确定要分析的目的细胞群,数据分析,设门,Side Scatter,Forward Scatter,0,200,400,600,800,1000,0,200,400,600,800,1000,R1,数据分析,设门,10,0,10,1,10,2,10,3,10,4,SSC-Height,R1,CD3-PE,10,0,10,1,10,2,10,3,10,4,10,0,10,1,10,2,10,3,10,4,Anti-HLA-DR FITC,Gated on R1,10,0,10,1,10,2,10,3,10,4,CD25-PE,数据分析,对照样本,检测样本,数据分析,直方图统计表,数据分析,检测样本,数据分析,对照样本,检测样本,数据分析,点图统计表,数据分析,对照样本,数据分析,数据分析,数据分析时遇到的问题,阳性峰与阴性峰分界明显,根据阴性对照设阳性和阴性界限,允许假阳性率一般少于2%,可记录阳性百分比和平均荧光强度,图1,数据分析时遇到的问题,对照管直方图左侧与检测管重叠，但检测管直方图右侧有肩峰,在两曲线分离处设一界限；,从阳性曲线减去阴性曲线所致假阳性的百分比；,可记录阳性百分比（近似值）和平均荧光强度，或弱阳性,图2,数据分析时遇到的问题,对照管与检测管直方图形状相同，但检测管直方图右移,此结果不可设界限,可记录平均荧光强度,排除非特异染色,调整抗体滴度确认,图3,数据分析时遇到的问题,组合图形,需要设界限，设在阳性管弱阳性返回基线处；,界限右侧为强阳性，可报百分比；,弱阳性的分析见上述原则3,图4,数据分析时遇到的问题,阳性细胞群与阴性细胞群分群明显，且位于所在象限内,以阴性对照设界线，允许其它三象限内假阳性率小于2%；,可记录阳性百分比，强阳性或平均荧光强度,图5,数据分析时遇到的问题,阳性群与阴性群区分明显，但阳性群部分跨两象限,单阳性部分使用图5原则,双阳性部分，根据细胞群走向，使用图7/图8原则,图6,数据分析时遇到的问题,阳性群左侧与对照平行，右侧跨越两象限,根据细胞群的分布趋势，界限应设在阴/阳性分离处；,阳性标本的百分率减去假阳性；,可记录阳性百分率（近似值），弱阳性或平均荧光强度,图7,数据分析时遇到的问题,阳性群体与对照一致且部分重叠，但向阳性象限平移,与直方图单色分析原则一致；,不可记录阳性百分比；可记录平均荧光强度,图8,数据分析时遇到的问题,阳性群体与对照一致，但向45,0,角方向平移,分析原则与图7/图8相同；,需要注意这种情况多是非特异结合,图9,BD,生物科学部,BD Immunocytometry System(BDIS)-,广州流式科技有限公司代理,流式细胞仪 (020-85510004),流式抗体:人相关抗体,BD Pharmingen(BD PMG)-,基因公司代理,CBA,(020-85524840),ELISPOT,DimerX,IMag,PhosFlow,ELISA,PowerBlot,Flow Cytometry reagent,RPA,BD Discover Labware,BD pathway(,活细胞工作站),谢谢大家！,