凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,凝胶过滤层析法分离血红蛋白,化学生物学试验,药学院 化学生物学教研室,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第1页,1.,试验目标,初步了解凝胶过滤层析法简单原理及应用,初步掌握应用凝胶过滤法分离蛋白质,1,2,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第2页,2.,试验原理,层析法是利用混合物中各组分物理经学性质差异（如吸附力、溶解度、分子形状、大小和极性等），使各组分以不一样程度分布在两相中，从而使各组分以不一样速度随流动相向前流动而到达分离目标。层析法可分为各种类型，包含分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等。,层析法,分配层析,离子交换层析,凝胶过滤层析,亲和层析,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第3页,2.,试验原理,1,待分离混合物（A、B）随流动相经过固定相,因为理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）能力不一样，在两相中分配（含量对比）不一样,与固定相相互作用力越弱组分，随流动相移动时受到阻滞作用小，移动速度快,分步搜集流出液，可得到样品中所含各单一组分，从而到达将各组分分离目标,2,3,4,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第4页,凝胶过滤层析，主要依据混合物中分子大小及形状不一样，在经过凝胶（固定相）时，分子扩散速率各异而到达分离目标。凝胶颗粒含有多孔性网状结构，小分子能够进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速率慢（阻滞作用大）；而大分子则被排除在外，沿凝胶间空隙随（流动相）流动，流动短而移动速率快（阻滞作用小），比小分子物质先流出层析床，所以凝胶过滤层析又称为排阻层析，分子筛层析，凝胶过滤法操作简例，且操作条件温和，不易引发生物样品变性失活，分离效果好，故广泛应用于蛋白质、酶、核酸分离提纯（包含脱盐、浓盐及分子量测定等）,2.,试验原理,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第5页,本试验经过,sephadexG50,层析柱，以蒸馏水为流动相，分离血红蛋白（红色，分子量约,64,500,）与二硝基氟苯,-,鱼精蛋白（鱼精蛋白与二硝基氟苯结合后为黄色，分子量为,2,000-12,000,）混合物，从颜色不一样即可观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。,2.,试验原理,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第6页,3.,试验用具,试剂,（,1,）交联葡聚糖,G-50,（,2,）二硝基氟苯,（,3,）鱼精蛋白,（,4,）,0.9%NaCl,（,5,）,10%,碳酸氢钠,（,6,）,95%,乙醇,仪器,（,1,）锥形瓶,（,2,）层析柱（,1cm25cm,玻璃柱）（,3,）铁架台,（,4,）弹簧夹,（,5,）细橡皮管（长,2cm,）（,6,）量筒,7,）小烧杯,100ml,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第7页,4.,操作步骤,1、凝胶准备：,取sephadex G-50 3g置于锥形瓶中，加蒸馏水90ml，于沸水浴中煮沸2小时(或放于水中浸泡6小时)，充分膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。,2、装柱：,关闭下口，向玻璃柱内加入蒸馏水达柱总长度约1/3处，把膨胀好糊状凝胶边搅拌、边自柱顶端沿管内壁缓缓加入柱中至柱顶部，待柱底部凝胶沉积至1-2cm时，开启柱底部出水口，并控制一定流速，使柱中凝胶一直处于溶液中。再慢慢地继续加入凝胶，直至凝胶体积至柱顶2.5cm左右，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度最少8cm。最终放入略小于层析柱内径圆形小滤纸片，以防未来加样时凝胶被冲起。,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第8页,4.,操作步骤,3、平衡：,用10ml左右蒸馏水流洗整个柱床。操作过程中严防出现气泡和分层，如床面不平，可用玻璃棒轻轻搅动表面，是凝胶重新自然沉降。整个过程中勿使液面低于床面，以免气体进入，使柱床干裂。,4、加样：,待柱床面以下蒸馏水流出，且刚好与床面相切时(切不可使床面完全暴露于空气中)，关闭下口。用滴管取血红蛋白及鱼精蛋白混合液（血红蛋白稀释液3滴加DNP-鱼精蛋白溶液3滴），十分小心地并缓缓沿内壁加入(注意切勿破坏柱床面)，打开柱底部出口，使样品进入床内，至床面重新露出时，先加入少许蒸馏水，冲洗床面1-2次，然后再加入足量蒸馏水。,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第9页,4.,操作步骤,5、洗脱和标定：,用试管搜集洗脱液体。调整流速使液体均匀流出（约1ml/min），同时统计以下数据：起始、红始、红终、黄始、黄终、终止(1.5倍柱体积)。观察血红蛋白与鱼精蛋白洗脱次序并统计试验现象(注意洗脱过程中随时添加蒸馏水，以免干柱)。,6、清洗：,待全部色带流出层析柱后，继续加入蒸馏水并加紧流速，清洗层析柱至凝胶洁净呈白色为止。,7、凝胶回收：,将清洗洁净sephadex G-50凝胶回收至回收容器中。,8、结果处理：,观察统计试验现象并加以分析。,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第10页,5.,注意事项,胶膨胀必须彻底，不然会影响层析均一性，甚至有使柱破裂危险。,装柱前加入,1cm,洗脱液，检验柱子。,凝胶装柱过程中严防出现气泡和分层，要使液面高于床面，以免气体进入柱床，影响液体在柱内流动与最终血红蛋白及核黄素混合物质分离效果。,凝胶装柱要一次完成。装凝胶烧杯不能清洗。（看似脏东西都是凝胶）。,柱中凝胶一定要浸没在洗脱液中。,加样一定要极其小心而迟缓，以免凝胶被冲起，造成层析结果不佳。上样时滴管末端一定要靠近凝胶柱表面,(1cm),、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。样品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。,搜集要及时，不能等红褐色物质流出之后再搜集,(13,滴,/,管,),。流速不可太快,(,约,10,滴,/min),。,层析前及层析中要绝对防止干柱现象。一直保持柱内液面高于凝胶表面，不然水分挥发，凝胶变干。也要预防液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内流动，造成分离效果变坏，不得不重新装柱。,洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第11页,6,.,思索题,在向凝胶柱加入样品时，为何必须保持胶面平整？上样体积为何不能太大？,请解释为何在洗脱样品时，流速不能太快或者太慢？,某样品中含有,1 mg A,蛋白（,Mr 10,000Da,），,1 mg B,蛋白（,Mr 30,000Da,），,4 mg C,蛋白（,Mr 60,000Da,），,1 mg D,蛋白（,Mr 90,000Da,），,1 mg E,蛋白（,Mr 120,000Da,），采取,Sephadex G75,（排阻上下限为,3,000-70,000Da,）凝胶柱层析，请指出各蛋白洗脱次序。,凝胶过滤层析法分离血红蛋白专家讲座,第12页,