基因诊断专题知识讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,基因诊断专题知识讲座,基因诊断专题知识讲座,第1页,人类疾病原因,内因：,基因结构改变（,基因突变,）,点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增,基因结构多态性,基因表示异常,外因：,病原体侵入,基因诊断专题知识讲座,第2页,对于疾病诊疗依据：,临床表现,试验室诊疗技术：,细胞学检验,生物化学代谢产物和酶活性改变检验,免疫学检验,基因诊疗,基因诊断专题知识讲座,第3页,一、基因诊疗概述,(,一,),基因诊疗,概念与特点二,),基因诊疗,基础原理,与,临床意义,基因诊断专题知识讲座,第4页,(,一,),基因诊疗概念与特点,1,概念：,指利用分子生物学技术，从,DNA,或,RNA,水平检测,基因存在、分析基因结构变异和表示状态，,对,疾病,作出诊疗方法和过程。,基因诊疗以,DNA,和,RNA,为诊疗材料，,DNA,诊疗,RNA,诊疗,基因诊断专题知识讲座,第5页,2,基因诊疗特点：,（,1,）直接检测基因，属病因诊疗，,针对性强；,（,2,）特异性强、灵敏度高：,因为基因诊疗采取核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术；,（,3,）适用范围广：,其应用范围已从原先局限遗传性疾病扩充到感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等领域。,基因诊断专题知识讲座,第6页,基因诊疗评价,特异性,灵敏度,重复性,快速,经济,基因诊断专题知识讲座,第7页,(,二,),基因诊疗基础原理与临床意义,1,基础原理：,经过检测,致病基因（包含内源基因与外源基因）,存在、量多少，结构改变是否及表示水平是否正常，以确定被检验者是否存在基因水平异常改变，以此作为疾病确诊依据。,2,临床意义,:,对有表型出现疾病作出,明确诊疗,早期快速诊疗,确定个体对疾病易感性,疾病分期分型、疗效监测、预后判断等,基因诊断专题知识讲座,第8页,二、基因诊疗常见技术与方法,(,一,),基因诊疗常见技术,(,二,),基因诊疗基础方法,基因诊断专题知识讲座,第9页,一,),基因诊疗常见技术,核酸分子杂交,PCR,（聚合酶链式反应）,限制性酶切分析,SSCP,（单链构象多态性分析）,DNA,测序,DNA,芯片技术,基因诊断专题知识讲座,第10页,基因诊疗技术分类,1、Molecular hybridization：,Southern,Northern,dot blot,2、PCR,3、DNA,测序,4、,DNA,芯片技术,基因诊断专题知识讲座,第11页,1.,核酸分子杂交,Molecular hybridization,Southern blot,DNA,Northern blot,RNA,Dot blot,，,I,n,S,itu,H,ybridization,基因诊断专题知识讲座,第12页,核酸杂交基础原理：,利用核酸变性和复性理论：（1）双链,DNA,分子在一些理化原因作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（2）含有互补碱基序列异源核酸单链之间一样可按碱基互补配对标准经过氢键结合为双链。,基因诊断专题知识讲座,第13页,核酸分子杂交流程示意图,待测核酸制备,滤膜上核酸,固化,杂 交,去除未参加杂交探针,检 测 杂 交 信 号,制备探针核酸片段,探 针 标 记,加入标识核酸探针,基因诊断专题知识讲座,第14页,探针种类,DNA,探针:基因组,DNA,探针;基因探针,cDNA,探针:当前应用最广泛,寡核苷酸,探针,(Oligonucleotide probes),RNA,探针:,基因诊断专题知识讲座,第15页,不一样探针在应用中有各自特点,但最主要是探针序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择。,对致病性微生物应选取其最保守、最特异序列；对突变基因检测，应用含有突变位点序列或待测基因编码序列。,基因诊断专题知识讲座,第16页,探针标识物,放射性标识物,32,P,，,35,S,，,125,I,，,3,H,非放射性标识物,生物素，地高辛，荧光素，酶，金属,基因诊断专题知识讲座,第17页,Southern blot,N,N T T N T T,基因诊断专题知识讲座,第18页,1、Southern blot,：,用于,DNA,检测，不但能检测出特异,DNA,片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。,2、Northern blot,：,杂交用于,RNA,检测，能对组织细胞中总,RNA,或,mRNA,进行定性和定量分析。,3、dot blot,：,既可检测,DNA,也或检测,RNA，,用于基因组中特定基因及其表示定性和定量分析。缺点：特异性较低，不能判定所分析基因分子量。,4、原位杂交,：,在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位,。,基因诊断专题知识讲座,第19页,PCR,是在试管内利用,DNA,聚合酶催化反应重复进行同一段,DNA,片段合成过程,（二）,PCR,技术是基因诊疗一个,基础,技术,基因诊断专题知识讲座,第20页,PCR,技术优点,特异性强,灵敏度高,操作简单、省时,对待检原始材料质量要求低,高效率基因扩增技术,基因诊断专题知识讲座,第21页,1、直接采取,PCR,技术进行基因诊疗,经过,PCR,技术扩增特异性基因，能够确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关体内基因缺失或基因突变,基因诊断专题知识讲座,第22页,2、采取,PCR,产物限制性片段长度多态性分析,（PCRRFLP）,基因突变造成基因碱基组成和次序发生改变，会在基因结构中产生新限制性内切酶位点或使原有限制性内切酶位点消失。所以，突变基因经对应限制性内切酶水解后，其电泳条带数量和大小就会发生改变，依据这些改变能够判断突变是否存在。即限制性片段长度多态性技术。,PCRRFLP,就是利用,PCR,技术先将包含待测位点,DNA,片段扩增出来，然后用识别该位点限制性内切酶水解，依据限制性片段数量和长度作出诊疗。,基因诊断专题知识讲座,第23页,3、采取,PCR,结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术,等位基因特异性寡核苷酸探针技术（,ASO）,原理：,针对已知突变位点基因，能够分别针对已知突变位点序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针中央，这么在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全互补探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基与靶序列不匹配探针则被洗脱。,基因诊断专题知识讲座,第24页,PCR/ASO,则是采取,PCR,扩增受检者基因目标片段，并与对应,ASO,探针杂交，假如受检者,DNA,扩增产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表示受检者不存在突变基因；假如只有突变探针能够杂交，说明突变基因为纯合子；假如二者都存在，则说明突变基因为杂合子。,采取,PCR,结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术,基因诊断专题知识讲座,第25页,/,/,S,S,/,S,正常探针,突变探针,基因诊断专题知识讲座,第26页,4、,PCR,产物反相点杂交分析技术,此项技术与,PCR/ASO技术原理完全相同，只是杂交时采取是反相杂交。是将探针固定在膜上成为固定相，用,PCR,产物作为液体相，进行杂交试验。,基因诊断专题知识讲座,第27页,单链构象多态性（,SSCP）,分析是一个基于单链,DNA,构象差异来检测点突变方法。,DNA,经变性形成单链后，在中性条件下单链,DNA,会因其分子内碱基之间相互作用，形成一定立体构象。相同长度单链,DNA,会因分子内碱基组成或排列次序不一样，形成构象就不一样，这么就形成了单链构象多态性。对长度相同而构象不一样单链,DNA,在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现出不一样迁移率。,5、采取,PCR,产物单链构象多态性分析进行基因诊疗,基因诊断专题知识讲座第28页,PCR-SSCP,技术就是利用,PCR,扩增目标基因片段，经过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸改变会造成,DNA,片段构象改变，其迁移率也会改变，从而检测基因突变。,基因诊断专题知识讲座,第29页,基因诊断专题知识讲座,第30页,该技术是先制备浓度从低到高变性剂凝胶，然后将待测分析,PCR,扩增产物进行电泳，到,DNA,电泳到变性剂浓度能使,DNA,发生变性位置时，,DNA,双链分开，因为不一样,DNA,片段碱基组成不一样，所以在凝胶中泳动发生变性位置不一样，迁移率也不一样，所以能够将相同长度但碱基组成不一样,DNA,片段分开，从而能检测出基因突变。,6、采取,PCR,结合变性梯度凝胶电泳技术,基因诊断专题知识讲座,第31页,DNA,甲基化是表观遗传学主要组成个别，在维持正常细胞功效、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着主要作用，是当前新研究热点之一。,如在普通正常细胞中，基因调控区,C,P,G,岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往展现甲基化状态。所以,DNA,甲基化研究是一热点。,7、甲基化特异性,PCR,技术,基因诊断专题知识讲座,第32页,将,DNA,先用亚硫酸盐处理，这么未甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化不变，随即行引物特异性,PCR。,在,MS-PCR,中设计两对引物，一对为甲基化特异性引物（,primer），,一对为非甲基化引物（,primer），,进行特异性扩增，只有结合完全甲基化或非甲基化特异性引物片段才能扩增出产物，最终能够确定研究,DNA,片段部位甲基化情况。,甲基化特异性,PCR,技术（,MS-PCR,）,基因诊断专题知识讲座,第33页,基因诊断专题知识讲座,第34页,以上介绍基于,PCR,扩增技术建立基因诊疗技术，只能提供定性结果，即有没有突变。但对基因表示异常疾病，上述方法无法满足需要，还需要研究其基因表示量上改变分析，故还可利用,PCR,定量分析基因表示。,PCR,定量分析方法有：,梯度（系列）稀释法、,极限稀释法、非竞争性对照法、竞争抑制法、,荧光定量,PCR,8、采取,PCR,技术进行靶核酸定量分析,基因诊断专题知识讲座,第35页,PCR,扩增有限性-平台期及平台,效应（,plateau effect）,PCR,扩增平台效应,基因诊断专题知识讲座,第36页,梯度（系列）稀释法：,在扩增检测待测样本同时，扩增一系列稀释已知标准（通常为质粒,DNA）,假如在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增待测样本中,PCR,模板相对量.,必须在扩增,指数期,进行,优点：简单，可作粗糙定量分析。,缺点：不准确，影响原因多。,基因诊断专题知识讲座,第37页,首先将原始模板进行梯度稀释;,然后对该稀释系列进行,PCR,扩增测定;,最低阳性样本被认为含有与一已知标准稀释系列中最终阳性样本中相同量,PCR,模板,基础依据：,PCR,扩增有效起始模板分子数为10,4,10,6,个,改良方法：极限稀释分析,基因诊断专题知识讲座,第38页,基因诊断专题知识讲座,第39页,非竞争性对照基因定量法,该定量法是靶基因与参考基因同时扩增。即在一样反应条件下，在一个试管内同时扩增来自同一,DNA,一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们,mRNA)。,经过比较两种序列扩增产物电泳带颜色强度对靶基因定量。,基因诊断专题知识讲座,第40页,竞争,PCR,与前述方法相同，即靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参考标准通常是一段人工合成模板而不是内源性基因。竞争PCR,必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，含有相同引物结合位点，其扩增产物能经过电泳或高效液相色谱(,HPLC),等方法区分开来。,将竞争模板作系列稀释后，加入到恒量样品,DNA,进行,PCR，,经过分离和分析竞争模板与样品,DNA,产量，对样品,DNA,进行定量分析。,竞争性,PCR：,基因诊断专题知识讲座,第41页,3.DNA,sequencing,DNA,序列测定是最直接、最准确基因诊疗技术,基因诊断专题知识讲座,第42页,例：四色荧光自动测序分析结果,基因诊断专题知识讲座,第43页,基因诊断专题知识讲座,第44页,4.DNA,芯片技术,DNA chips or microarray,基因诊断专题知识讲座,第45页,指在固相支持物上,原位合成寡核苷酸,或者直接将,大量探针以显微打印方式有序地固化,于支持物表面，然后与标识样品杂交，经过对杂交检测分析，得出样品遗传信息（基因序列及表示信息）,因为在制备过程中利用了,计算机芯片,制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常见,硅芯片,作为固相支持物，所以称为,DNA,芯片技术,DNA,芯片技术概念,基因诊断专题知识讲座,第46页,DNA,芯片技术原理,大规模集成固相杂交,基础原理是核酸分子杂交，即依据,DNA,双链碱基互补配对、变性和复性原理,以大量已知序列寡核苷酸、,cDNA,或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后经过定性、定量分析得出待测样品基因序列及表示信息,基因诊断专题知识讲座,第47页,第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略,人类疾病各种多样，致病原因不一样，所以在基因诊疗上也有不一样路径和策略。,1、对致病基因已经找到、发生机制清楚疾病，能够经过直接检测致病基因进行基因诊疗。,如：病原微生物感染：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及与疾病相关机体内源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。,基因诊断专题知识讲座,第48页,2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组特定区域疾病，能够经过检测致病基因联锁遗传标识进行基因诊疗。,如：用限制性内切酶位点作为遗传标识，利用该遗传标识与相邻基因在遗传过程中分离几率很低，经常一起遗传，形成连锁特点，建立了染色体基因连锁图，依据基因连锁图，经过分析连锁基因遗传标识，可判断致病基因存在可能性。,第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略,基因诊断专题知识讲座,第49页,3、对多原因、多基因疾病，能够经过检测表型克隆基因进行基因诊疗。,第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略,如高血压、冠心病、肿瘤、精神病、本身免疫性疾病，因为疾病发生原因复杂，包括多基因、多原因。所以可采取表型克隆方法来分析诊疗。,原理：从分析正常和异常基因组采取差异显示等技术找到正常人和疾病患者之间差异序列，进行克隆。依据克隆一组基因差异序列制作对应探针，用制备这一组探针检测相关疾病方法。,基因诊断专题知识讲座,第50页,第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略,4、对一些因基因表示异常出现疾病，可经过基因表示定量分析进行基因诊疗。,对与基因表示异常出现疾病，能够在转录水平上对该基因表示,mRNA,量进行分析，作出诊疗。,基因诊断专题知识讲座,第51页,第三节 基因诊疗应用前景,1.杂交基础上,RFLP,分析（20世纪80年代,）,2.,PCR,及其衍生技术,3.基因芯片技术,基因诊疗发展历史,基因诊断专题知识讲座,第52页,第三节 基因诊疗应用前景,1.理论,2.技术,3.伦理,基因诊疗过程中存在问题,基因诊断专题知识讲座,第53页,遗传病基因诊疗是在基因水平上对核酸碱基序列突变检测，从遗传物质分子水平上揭示疾病发生原因和分子机制。,遗传病诊疗分为产前检验、症状前诊疗和症状后诊疗。遗传病基因诊疗是进行产前检验和症状前诊疗唯一选择，也是遗传病预防最为有效伎俩。,第四节、基因诊疗技术检测遗传病,基因诊断专题知识讲座,第54页,基因诊疗技术路径：,直接分析致病基因分子结构及表示是否异常直接诊疗路径；,利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析间接诊疗路径。,第四节 遗传病基因诊疗,基因诊断专题知识讲座,第55页,第四节 遗传病基因诊疗,直接诊疗：检测已知致病基因,必要条件,被检基因突变类型与疾病发病有直接因果关系：,被检基因正常分子结构已被确定；,被检基因突变位点固定而且已知。,基因诊断专题知识讲座,第56页,1.点突变：,（1）造成特异性限制性内切酶位点改变,直接诊疗：检测已知致病基因,基因诊断专题知识讲座,第57页,血红蛋白病能够由血红蛋白结构或合成异常所致遗传性疾病。前者称为异常血红蛋白病，后者称为地中海贫血。,针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是因为,珠蛋白,基因第6位密码子,GAG,突变成,GTG，,造成蛋白结构异常。对此,遗传病基因诊疗可采取,PCR-,限制性内切酶分析技术。,镰状红细胞贫血,HBS-Beta,株蛋白基因突变：,基因诊断专题知识讲座,第58页,5,3,正常基因5,3,突变基因,1.15,kb,1.35,kb,镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析,PCR-RE,分析,Mst,II,CCTG,A,GG-CCTG,T,GG,基因诊断专题知识讲座,第59页,+,0.2,kb,1.15,kb,1.35,kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析,基因诊断专题知识讲座,第60页,1.点突变：（2）无限制性酶切位点改变,直接诊疗：检测已知致病基因,PCR-ASO,斑点杂交或反向斑点杂交等技术。,PCR-ASO,斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。,基因诊断专题知识讲座,第61页,地中海性贫血基因诊疗（,PCR-ASO）,已知突变,Gene,部位和性质，合成寡和苷酸探针，,32,P,标识，进行,Southern Blot,杂交/斑点杂交。,Normal,Gene Probe,与正常,杂交,Mutation,S,Gene Probe,与异常,S,杂交,基因诊断专题知识讲座,第62页,/,/,S,S,/,S,正常探针,突变探针,基因诊断专题知识讲座,第63页,1、,Gene,缺失遗传病诊疗,1）,地贫,Gene,诊疗,基因不一样程度缺失引发不一样类型,地贫，,基因缺失14个。正常,Gene,组用,BamHI,切割，可得到14,kb,片段，而缺失一个,Gene,时可得到10,kb,片段。,BamHI,BamHI,2,1,2,10,kb,14,kb,probe,基因诊断专题知识讲座,第64页,以,Gene,为探针，,Southern blot,方法检测,/-/-/-/-,正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14,kb,10,kb,基因诊断专题知识讲座,第65页,直接诊疗：检测已知致病基因,在,DNA,序列上有较长一段序列重新排布。包含大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引发更大范围内染色体结构上改变从而影响多个基因功效，即染色体突变或畸变，包含染色体易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等,2.基因重排缺失：核酸分子探针杂交与,PCR,基因诊断专题知识讲座,第66页,（1）,Southern,印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，经过设计一系列对应于缺失区域核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号,（2）多重,PCR，1988,年,Chamberlain,等采取多重,PCR,技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因多个基因座,直接诊疗：检测已知致病基因,基因诊断专题知识讲座,第67页,杜氏肌营养不良症基因诊疗,DMD,是一个严重致死性疾病（,XR），,临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。,病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。,Gene,定位,Xp21，Gene 2300kb,79,个,Exon，cDNA,全长13974,bp编码3685,Aa，,分子量427,kD。,DMD,最主要遗传缺点是外显子缺失，约占60%70%。,基因诊断专题知识讲座,第68页,1.,DNA Marker 2.,阳性对照,3.,孕妇,1.,DNA Marker 2.,阳性对照,3.,孕妇,4.,胎儿,5.,阴性对照,4.,胎儿,5.,阴性对照,采取多重,PCR,法扩增该基因多个外显子,基因诊断专题知识讲座,第69页,3.基因表示异常,mRNA,相对定量分析,mRNA,长度分析,直接诊疗：检测已知致病基因,基因诊断专题知识讲座,第70页,二、,遗传病,间接诊疗,当,致病基因,即使已知，但其,异常性质未知,时，或疾病,Gene,本身还未知时，主要经过,Gene,和,遗传标识,连锁分析,间接地,作出诊疗。,连锁分析基于,遗传标识,与,Gene,在染色体上连锁，经过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代取得某种,遗传标识,与,疾病,关系，间接推断受检,子代是否取得带有致病基因染色体,，间接地判断并做出诊疗。,遗传标识（限制性片段长度多态性、微卫星,DNA,序列、单核苷酸多态性等）,基因诊断专题知识讲座,第71页,1,Southern blot,-RFLP,诊疗(,PKU),PAH,基因两侧有,Msp1,酶切位点,用该酶消化可产生23,kb、19kb,两种等位片段，以,PAHcDNA,为探针与,PKU,家系组员外周血,DNA,杂交间接基因诊疗,基因诊断专题知识讲座,第72页,患者为19,kb,片段纯合子,说明患者缺点,PAH,基因与19,kb,片段连锁,其父、母亲缺点,PAH,基因与19,kb,片段连锁，其23,kb,片段与正常,PAH,基因连锁。,II2,为,23,kb,和19,kb,片段杂合子，为表型正常致病基因携带者。,间接基因诊疗,基因诊断专题知识讲座,第73页,成年型多囊肾病,基因诊疗,例：成年型多囊肾病,APKD，AD，,临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终造成肾功效衰竭和尿毒症。,APKD,Gene,定位16,p13.3，,但致病基因还未克隆，基因产物生化性质和疾病发病机理也还未说明，但已证实,APKD Gene,与,珠蛋白基因3端附近一段小卫星,DNA,序列（3,HVR）,紧密连锁，所以，能够经过,RFLP,连锁分析进行诊疗。,基因诊断专题知识讲座,第74页,以3,HVR,为探针，与,PvuII,酶切后家系相关组员基因组,DNA,进行,Southern Blot,基因组,DNA,PvuII,酶切,DNA,片段,变性,转膜,探针,变性,杂交,结果分析,间接基因诊疗,基因诊断专题知识讲座,第75页,结 果,1 2,1 2 3 4 5,57,kb,34kb,23kb,基因诊断专题知识讲座,第76页,结果分析,患者（,I1、II1,和,II2）,有3.4,kb,片段,说明致病基因与3.4,kb,片段连锁,并按孟德尔方式遗传.,II5,不含3.4,kb,片段,产前诊疗正常.,基因诊断专题知识讲座,第77页,遗传疾病基因诊疗方法,基因异常 方法 探针、引物或限制酶,基因组,DNA,印迹杂交 缺失基因探针,基因缺失,PCR,扩增 引物包含缺失或在缺失部位内,RFLP,分析 突变造成其切点消失限制酶,点突变,ASO,杂交 正常和异常,ASO,探针,PCR,产物多态性分析（,SSCP）,引,引物包含突变部位,基因未知,与,疾病连锁多态性分析 与疾病连锁多态位点,探针或引物,基因诊断专题知识讲座,第78页,肿瘤基因诊疗,肿瘤发生包括多个基因、各种原因；发生过程呈多阶段性其发生发展机制十分复杂，同时不一样肿瘤发生机制也不相同，所以在肿瘤基因诊疗时，无法采取统一策略。,基因诊断专题知识讲座,第79页,策略一、经过检测肿瘤染色体异位,及融合基因诊疗,淋巴造血系统肿瘤中,染色体异位和重排发生较为普遍.,临床上出现炎症性淋巴结肿大与淋巴瘤肿大判定:,在淋巴瘤细胞中，,T,细胞受体（,TCR）,基因和,IgH,基因发生重排，原来相隔数百个碱基,IgH,基因和,TCR,基因,V,区和,J,区基因就会靠近在一起，而炎症增生性细胞内就不会发生基因重排，故经过,PCR,扩增能够判定之。,基因诊断专题知识讲座,第80页,策略二、经过检测癌基因和抑癌基因诊疗肿瘤,癌基因激活及抑癌基因失活与肿瘤发生发展关系亲密。多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到癌基因与抑癌基因突变。用基因诊疗方法：定量,PCR、,印迹技术、,PCR-SSCP,等检测。,如,ras,癌基因，其激活分子机制主要是点突变，所以可经过,PCR-ASO、PCR-SSCP,等方法。,P53,基因是抑癌基因，在肿瘤组织中其常发生突变而失活。所以可经过,PCR-SSCP、DNA,测序分析等，可检测,P53,基因突变。,基因诊断专题知识讲座,第81页,策略三、经过检测肿瘤相关病毒诊疗肿瘤,鼻咽癌,Burkitt,淋巴瘤,肝癌,宫颈癌,EB,病毒,HBV、HCV,人类乳头瘤病毒,HPV,基因诊断专题知识讲座,第82页,策略四、检测肿瘤标识物基因或,mRNA,诊疗肿瘤,肿瘤标识物是肿瘤组织中产生与肿瘤发生发展过程相关物质。如肿瘤抗原、激素、酶等。,所以经过特异肿瘤标识物基因检测，能够帮助对肿瘤诊疗。,肝癌甲胎蛋白（,AFP）,结肠癌癌胚抗原（,CEA）,基因诊断专题知识讲座,第83页,基因诊疗在感染性疾病中应用,定性或定量检测致病微生物核酸,，,已经用于病毒、细菌和寄生虫感染,诊疗。,动态、定量地检测病原体核酸能,对,疗效判断和病情预后,提供客观依,据。,基因诊断专题知识讲座,第84页,SARS,相关冠状病毒分子诊疗,4月，香港研究者,Peiris,等报,告了50 例,SARS,病人临床表现和,病毒学研究结果证实新冠状病毒,可能是,SARS,致病原因。,（,Lancet,361:9365),其它试验室陆续得出相同结论。,基因诊断专题知识讲座,第85页,基因诊断专题知识讲座,第86页,基因诊断专题知识讲座,第87页,4月，德国汉堡,Bernhard-,Nocht,热带医学研究所学者,Drosten,等用随机扩增技术，取得长度为,300,bp,核苷酸序列。,依据这段序列，建立了检测新冠状,病毒常规和实时定量,PCR,技术。（,.org,on April 10,）,基因诊断专题知识讲座,第88页,1.血清学方法：,ELISA（IgM/IgA）,方法能够可靠地检出出现临床症状20天后,SARS,病人血清中病毒抗体。一些病人在14-21天时，已经能够检测到抗体。,2.,细胞培养方法：利用,VERO,细胞来检测,SARS,病人呼吸道分泌物和血液样品，阳性结果则表示,SARS,病人感染了冠状病毒。,3.,分子生物学方法：主要是利用,PCR,方法对血液、粪便、呼吸道分泌物、痰液、唾液和漱口液等临床样本核酸提取物进行体外扩增后，进行定性与定量分析。,检测方法,基因诊断专题知识讲座,第89页,讨 论,疾病早期即可取得阳性结果（早,于血清转换期）。,特异性较高（,SARS,患者中阳性,率约为80%，对照中阴性率约为,98%100%,）。,现有方法敏感性较差，阴性结果,不能排除病毒感染。,基因诊断专题知识讲座,第90页,讨 论,痰液中病毒,RNA,浓度极高，说明病毒从呼吸道,排放是主要传输路径。,血清中检测到极低浓度病毒,RNA，,提醒病毒,复制不但发生于呼吸道。,病人恢复晚期粪便中存在病毒,RNA，,说明粪,便可能也是一个传输路径。,鼻、咽拭子中含有病毒,RNA,显著少于痰液，,提醒不适合作为标本（有可能漏检）。,基因诊断专题知识讲座,第91页,SARS,相关冠状病毒分子诊疗中必须注意问题,必须在规范基因扩增试验室中进行。,应采取必要质控规程，包含阳性对照,和阴性对照。,阳性结果时必须对原始样本重复检验或,者扩增基因另一个片段或在另一个实,验室对同一样本进行检测。,基因诊断专题知识讲座,第92页,