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07线粒体与过氧化物酶体第七章.线粒体与过氧化物酶体细胞的生存需要两个基本的要素：构成细胞结构的化学元件和能量。生物从食物中获取能量，根据对氧的需要情况分为两种类型：厌氧的，即 不需要氧；好氧的，即需要氧的参与。在真核生物中，需氧的能量转化过 程与线粒体有关，并且伴随着一系列的化学反应；而在原核生物中，能量 转化与细胞质膜相关。1850年发现的一种细胞器，1898年命名。是细胞内氧化磷酸化和形 成ATP的主要场所（图7-l）o过氧化物酶体是细胞内另一个需要氧的细胞器，不过过氧化物酶体需 要氧不是用于ATP的合成而是用于有毒物质的氧化，对线粒体具有氧调节作用。图7-1线粒体结构及功能示意图7.1 线粒体的形态结构线粒体是能够在光学显微镜进行观察的显微结构，它具有渗透性，在 低渗溶液中会膨胀，而在高渗溶液中能够收缩。7.1.1 线粒体的发现与功能研究人们对线粒体的研究有一个多世纪的历史。1850年，德国生物学家Rudolph K?lliker第一个发现线粒体，并推 测：这种颗粒是由半透性的膜包被的。1898年对线粒体进行命名。1900年，Leonor Michaelis用染料Janus green对肝细胞进行染色，发现细胞消耗氧之后，线粒体的颜色逐渐消失了，从而提示线粒体具有氧 化还原反应的作用。后又经过几十年的研究，逐步证明了线粒体具有Krebs循环、电子传 递、氧化磷酸化的作用，从而证明了线粒体是真核生物进行能量转换的主要 部位。从线粒体的发现和功能鉴定的简史中，你有何体会？(答案)答:1850年，德国生物学家Rudolph K?lliker第一个发现在肌细胞的细 胞质中存在着一种规则排列的颗粒，并且从肌细胞中分离到这些颗粒。发 现将分离的颗粒放置在水中能够膨胀，为此推测：这种颗粒是由半透性的 膜包被的。1898年，有人首次将这种颗粒命名为线粒体，意思是“类似线状的颗 粒”(thread-like granule),并很快被大家所接受。1900年，Leonor Michaelis在线粒体的功能研究方面取得了突破性的 进展。他用染料Janus green对肝细胞进行染色，这种染料将线粒体染成绿 色。当细胞消耗氧之后，线粒体的颜色逐渐消失了，当时已经了解这种颜 色的变化是颜料的氧化还原状态改变的结果，从而提示线粒体具有氧化还 原反应的功能。1913年，Otto Warburg从细胞匀浆质中分离了线粒体，并发现它能够 消耗氧。但是，这些发现当时并没有引起生物学家足够的重视，因为人们 普遍认为线粒体的作用主要是参与分化细胞遗传特性的转变。人们真正注意线粒体在能量代谢中的作用是分离纯化方法的发展和 线粒体独立功能的研究。在20世纪40年代早期，Arbert Claude开创了细 胞组分分离技术，能够将线粒体与其他细胞组分分开。但他所用是盐法,而盐会破坏线粒体的作用，所以用这种方法分离的线粒体看不到有关Krebs 循环以及呼吸链的成份。1948 年,George Hogeboom Walter Schneider 和 George Palade 等终 于分离到具有生物活性的线粒体，他们采用的分离介质是蔗糖而不是盐,因此不会破坏线粒体。分离方法上的突破，使得Eugene Kenedy和Albert Lehninger 证明了线粒体具有Krebs循环、电子传递、氧化磷酸化的作用，从而证明了线 粒体是真核生物进行能量转换的细胞器。体会是四点:关于膜结构的推测；功能的推测;方法的发展；方法的革新。）7.1.2 线粒体的形态结构 线粒体的形态和分布 大小：线粒体的形状多种多样，一般呈线状（图7-2）,也有粒状或短线状。图7-2电子显微镜观察的蝙蝠胰腺细胞线粒体 数量：在不同类型的细胞中线粒体的数目相差很大，但在同一类型的细胞 中数目相对稳定。有些细胞中只有一个线粒体，有些则有几十、几百、甚 至几千个线粒体。分布在多数细胞中，线粒体均匀分布在整个细胞质中，但在某些些细胞中，线粒体的分布是不均一的。线粒体较多分布在需要ATP的部位(如肌细胞和精细胞，图7-3);或较 为集中分布在有较多氧化反应底物的区域，如脂肪滴(图7-4),因为脂肪滴 中有许多要被氧化的脂肪。图7-3肌细胞和精子的尾部聚集较多的线粒体，以提供能量图7-4线粒体包围着脂肪滴，内有大量要被氧化的脂肪 存在方式线粒体在细胞中并非都是单个存在的，有时可形成由几个线粒体构成 的网络结构，有些线粒体具有分支，可以相互交错在一起。如通过相差显微 镜检查完整的肝细胞，发现线粒体并非是单个存在的,而是以交织的网络状 态存在(图7-5)o图7-5细胞中线粒体分支交织连接而成的网状二维结构7.2 线粒体的结构与化学组成7.2.1 线粒体的结构线粒体由内、外两层彼此平行和高度特化的膜包围而成，内外膜都 是典型的单位膜。线粒体外膜(outer membrane)起界膜作用，线粒体内膜(inner membrane)向内皱折形成崎(cristae),崎上有一些颗粒朝向线粒体基 质，这些颗粒称为F1颗粒(Fl particle),似把手状。线粒体的外膜和内膜将 线粒体分成两个不同的区室:一个是膜间间隙(intermembrane space),是两 个膜之间的空隙;另一个是线粒体基质（matrix）,它是由内膜包裹的空间（图 7-6）o图7-6线粒体结构模式图7.2.2 线粒体膜通透性很早就认识到线粒体的膜具有半透性，通过对半透性的研究导致线粒 体各组分分离方法的建立。线粒体通透性研究将线粒体放在100 mM蔗糖溶液中，蔗糖穿过外膜进入线粒体的膜间 间隙；然后将线粒体取出测定线粒体内部蔗糖的平均浓度，结果只有50 mM,比环境中蔗糖的浓度低。据此推测:线粒体外膜对蔗糖是通透的，而 内膜对蔗糖是不通透的（图7-7）o图7-7线粒体通透性测定左:将线粒体置于含有100 mM的蔗糖溶液中；中:蔗糖穿过线粒体外 膜，达到平衡;右:将线粒体从蔗糖溶液中取出，测定线粒体中蔗糖的浓度。如果测得线粒体的蔗糖平均浓度是50 mM,就可以推测:100mM的蔗糖仅 仅穿过了线粒体外膜，而线粒体中有一半流动的液体在线粒体基质，由于 内膜对蔗糖不通透，所以测得的线粒体平均浓度只有50 mMo线粒体各组分的分离由于线粒体外膜的通透性比内膜高，利用这一性质，Donal Parsons和 他的同事最先建立了分离线粒体内膜、外膜及其他组分的方法（图7-8）,图7-8线粒体组分的分离首先将线粒体置于低渗溶液中使外膜破裂，此时线粒体内膜和基质（线 粒体质）仍结合在一起，通过离心可将线粒体质分离。用去垢剂毛地黄皂甘 处理线粒体质，破坏线粒体内膜，释放线粒体基质，破裂的内膜重新闭合 形成小泡，其表面有F1颗粒。请根据线粒体外膜比内膜通透性高这一特性，设计分离线粒体各组份 的方法（答案）答：将线粒体放在低渗溶液或者去垢剂毛地黄皂昔（digitonin）中直到 线粒体外膜裂开，随着外膜的破裂，膜间隙中的物质释放到溶液中，此时线 粒体内膜和基质仍结合在一起（称为线粒体质），通过离心可将线粒体质分离o 用去垢剂Lubrol进一步处理线粒体质，破坏线粒体内膜，释放线粒体基质，破裂的内膜重新闭合形成小泡，其表面有F1颗粒。实验中要通过离心分离各组分，并要借助电子显微镜观察将内膜和外 膜区分开来：分离的外膜看起来象空的囊，而内膜会形成小泡，内膜自我 封闭形成内膜小泡的外表面含有F1颗粒。）7.2.3 线粒体各部分的化学组成和特性 线粒体的化学组成经过对线粒体各结构组分的生化分析，线粒体的化学组分主要是由 蛋白质、脂类、水份等组成。蛋白质 占线粒体干重的6570%。线粒体的蛋白质分为可溶性和 不溶性的。可溶性的蛋白质主要是基质的酶和膜的外周蛋白；不溶性的蛋 白质构成膜的本体，其中一部分是镶嵌蛋白，也有一些是酶蛋白。脂类 线粒体的脂类只占干重的2030%。在线粒体的脂类中多数 是磷脂，占总脂的3/4以上。含丰富的心磷脂和较少的胆固醇是线粒体在 组成上与细胞其他膜结构的明显差别。线粒体内、外膜在化学组成上的主要区别是脂类和蛋白质的比例不同,内膜上的脂类与蛋白质的比值低（0.3:1）,外膜中的比值较高（接近l:l）o 线粒体各部分的特性和功能 蛋白分布：线粒体由四个部分组成，在能量转换过程中分别起不同的作用。各部 分功能的差异主要是化学组成的差异，特别是蛋白和酶分布的差异（表7-1）o表7-1线粒体各部分蛋白的分布 功能由于线粒体各部分结构的化学组成和性质的不同，它们的功能各异（表7-2）o表7-2线粒体各部分的功能 标志酶通过细胞化学分析，线粒体各部位有特征性的酶，称为标志酶：外 膜：单胺氧化酶内膜：细胞色素氧化酶膜间隙：腺甘酸激酶基质：苹果 酸脱氢酶 线粒体外膜是最外的一层全封闭的单位膜结构，是线粒体的界膜，厚67nm,平整光滑。外膜含有孔蛋白，所以外膜的通透性非常高，使得膜 间隙中的环境几乎与胞质溶胶相似。外膜含有一些特殊的酶类，如单胺氧 化酶（monoamine oxidase）,这种酶能够终止胺神经递质，如降肾上腺素和多巴胺的作用。线粒体外膜的通透性差，又没有电子传递装置，所以没有什么作用，此 说正确吗？(答案)答：不正确。虽然外膜中外膜含有孔蛋白，最大可允许5,000道尔顿的 分子通过，由于ATP、NAD、辅酶A等的相对分子质量都小于1,000道尔顿,因此这些分子都能自由通过外膜。所以外膜的通透性非常高,使得膜间隙中 的环境几乎与胞质溶胶相似。但是它有两个重要的作用：一是建立了膜间 隙，有利于建立电化学梯度；第二是外膜含有一些特殊的酶类，如参与色氨 酸降解、脂肪酸链延伸的酶,表明外膜不仅参与膜磷脂的合成，同时对那些 将在线粒体基质中进行彻底氧化的物质先行初步分解。外膜上含有单胺氧 化酶(monoamine oxidase),该酶是外膜的标志酶，这种酶能够终止胺神经递 质，如降肾上腺素和多巴胺的作用。)位于外膜的内侧包裹线粒体基质的一层单位膜结构，厚56nm。内 膜的通透性较低，一般不允许离子和大多数带电的小分子通过。线粒体内膜通常要向基质折褶形成崎(cristae),其上有ATP合酶(ATPsynthase),又叫F0 Fl ATP酶复合体，是一个多组分的复合物。内膜的酶类可以粗略地分为三类：运输酶类、合成酶类、电子传递和 ATP合成酶类。内膜是线粒体进行电子传递和氧化磷酸化的主要部位。在电子传递和 氧化磷酸化过程中，线粒体将氧化过程中释放出来的能量转变成ATPo线粒体内膜和外膜之间的间隙称为膜间隙，宽68nm,由于外膜通 透性很强，而内膜的通透性又很低，所以膜间隙中的化学成分很多，几乎 接近胞质溶胶。功能是建立和维持氢质子梯度。线粒体基质内膜和崎包围着的线粒体内部空间是线粒体基质，与 三竣酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶都存在于基质之中；此 外还含有DNAtRNAs、rRNA、以及线粒体基因表达的各种酶和核糖体。比较线粒体外膜、内膜、膜间隙和基质的化学特性和功能的主要差别(答案)答：外膜是线粒体最外的一层全封闭的单位膜结构，是线粒体的界膜,厚67nm,平整光滑。外膜含有孔蛋白，所以外膜的通透性非常高,使得膜 间隙中的环境几乎与胞质溶胶相似。外膜含有一些特殊的酶类，外膜上含 有单胺氧化酶(monoamine oxidase),该酶是外膜的标志酶，这种酶能够终止胺神经递 质，如降肾上腺素和多巴胺的作用。外膜的主要作用是形成膜间隙，帮助建立电化学梯度，同时能进行 一些生化反应，协助线粒体内膜和基质完成能量转换功能。内膜是位于外膜的内侧包裹线粒体基质的一层单位膜结构，厚5 6nmo内膜的通透性较低，一般不允许离子和大多数带电的小分子通过。内膜的蛋白与脂的比例相当高，并且含有大量的心磷脂(cardiolipin),约占磷脂含量的20%,心磷脂与离子的不可渗透性有关。线粒体内膜通常要向基质折褶形成崎(cristae),崎的形成使内膜的表 面积大大增加。线粒体内膜的崎上有许多排列规则的颗粒称为线粒体基粒(elementary particle),即 ATP 合酶(ATP synthase),又叫 FO Fl ATP 酶复合体，是一个多组分的复合物。内膜的酶类可以粗略地分为三个大类：运输酶类：内膜上有许多 运输酶类进行各种代谢产物和中间产物的运输合成酶类：内膜是线粒 体DNA、RNA和蛋白质合成的场所；电子传递和ATP合成的酶类：这是 线粒体内膜的主要成分，参与电子传递和ATP的合成。内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。内膜是线粒体进行电子传递和氧化磷酸化的主要部位，含有电子传递 链中进行氧化反应的蛋白和酶。在电子传递和氧化磷酸化过程中，线粒体 将氧化过程中释放出来的能量转变成ATPo膜间隙是线粒体内膜和外膜之间的间隙，宽68 nm,其中充满无 定形的液体，含有可溶性的酶、底物和辅助因子。膜间隙中的化学成分很 多，几乎接近胞质溶胶。腺甘酸激酶是膜间隙的标志酶，它的功能是催化 ATP分子的末端磷酸基团转移到AMP,生成两分子ADP。膜间隙的功能是建立氢质子梯度。线粒体基质是内膜和崎包围着的线粒体内部空间是线粒体基质。基质 中的酶类最多，与三较酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶都存 在于基质之中。此外还含有DNA、tRNAs、rRNA、以及线粒体基因表达的 各种酶和核糖体。基质中的标志酶是苹果酸脱氢酶。线粒体基质的功能是进行氧化反应，主要是三竣酸循环。7.2.4 线粒体内膜的主动运输系统由于线粒体对于大多数亲水物质的透性极低，所以它必须具备特殊的 主动运输系统，完成下列运输作用：糖酵解产生的NADH必须进入电子传递链参与有氧氧化；线粒体产生的代谢物质如草酰辅酶A和乙酰辅酶A必须运输到细胞 质中，它们分别是细胞质中葡萄糖和脂肪酸的前体物质；线粒体产生的ATP必须进入到胞质溶胶，以便供给细胞反应所需的 能量，同时，ATP水解形成的ADP和Pi又要被运入线粒体作为氧化磷酸化 的底物。丙酮酸、脂肪酸、Pi等的运输在线粒体内膜上具有完善的运输系统，主要是运输蛋白和一些起促进 运输作用的脂类（如心磷脂）。运输系统也包括参与电子传递和氢质子传递 的复合物，内膜上有运输丙酮酸、脂肪酸和特殊氨基酸的运输蛋白,其中某 些运输蛋白（包括同向和逆向）的运输作用是靠质子梯度驱动的（图7-9）。图7-9线粒体内膜中的运输系统线粒体内膜的通透性极低，它是如何进行物质运输的？（答案）答：由于线粒体对于大多数亲水物质的透性极低，所以它必须具备特 殊的主动运输系统，完成下列运输作用：糖酵解产生的NADH必须进入电子传递链参与有氧氧化；线粒体产生的代谢物质如草酰辅酶A和乙酰辅酶A必须运输到细胞 质中，它们分别是细胞质中葡萄糖和脂肪酸的前体物质;线粒体产生的ATP必须进入到胞质溶胶，以便供给细胞反应所需的 能量，同时，ATP水解形成的ADP和Pi又要被运入线粒体作为氧化磷酸化 的底物。在线粒体内膜上具有完善的运输系统，主要是运输蛋白和一些起促进 运输作用的脂类（如心磷脂）。运输系统也包括参与电子传递和氢质子传递 的复合物，内膜上有运输丙酮酸、脂肪酸和特殊氨基酸的运输蛋白，其中 某些运输蛋白（包括同向和逆向）是靠质子梯度驱动的。线粒体氧化磷酸化作用所需无机磷（Pi）输入是与线粒体中0H-的输出 同时逆向进行的（二者间输入与输出的比值为l：l）o线粒体中由ADP+Pi生成的ATP向细胞质的运送是通过另一种运输蛋 白与细胞质中的ADP进行交换完成的，其结果，ATP被运输到胞质溶胶供 细胞代谢需要,ADP被运进线粒体基质，与运进的Pi 一起参与ATP的合成。这两种逆向运输泵共同维持线粒体基质中高ADP和Pi的浓度。）线粒体对细胞内Ca2+的调节线粒体、内质网和细胞外基质都是Ca2+的储藏地，在内质网、肌质网 和细胞质膜上都有Ca2+泵的存在。线粒体内膜上有两种类型的Ca2+运输 系统，能够将Ca2+输入到线粒体基质中，或将Ca2+从线粒体基质运输到 膜间隙（图7-10）。图7-10线粒体的两种Ca2+离子运输系统系统1是由膜动力势引起的Ca2+离子流向线粒体基质;系统2是通过 与Na+离子的交换将Ca2+离子输出到胞质溶胶。线粒体内膜是如何进行Ca2+运输的?对细胞质中Ca2+浓度调节有何意 义？（答案）答：线粒体内膜上有两种类型的Ca2+运输系统，能够将Ca2+输入到线 粒体基质中，或将Ca2+从线粒体基质运输到膜间隙。系统1是由膜动力势引起的Ca2+离子流向线粒体基质;系统2是通过 与Na+离子的交换将Ca2+离子输出到胞质溶胶。Ca2+从线粒体膜间隙输入到线粒体基质是由内膜上的膜动力势驱动 的（内膜内侧带负电，能吸引正电离子）。Ca2+输入的速率随着外部Ca2+浓 度的变化而变化。在心脏、脑和骨骼肌等组织中，Ca2+的输出是由Na+梯 度驱动的，即与Na+进行逆向协同运输。在正常情况下，这种交换运输的 速度非常之快。因此，线粒体、内质网和肌质网都能作为细胞质中Ca2+调节的缓冲区域。如果胞质溶胶中Ca2+浓度升高，Ca2+输入线粒体的速率 提高，而Ca2+输出的速率维持不变，这样导致线粒体基质Ca2+浓度的升 高而胞质溶胶中Ca2+浓度下降到原始的浓度水平。反之，胞质溶胶中Ca2+浓度的下降，促使线粒体对Ca2+输入速率的下降，而只有线粒体Ca2+的输出速率不变，最后导致胞质溶胶中Ca2+浓度恢复到一个设定 点（set-point）o）7.3 导向信号与线粒体蛋白定位线粒体中的蛋白质绝大多数都是核基因编码，在细胞质的游离核糖体 上合成后运输到线粒体的（表7-3）o表7-3细胞质中合成的某些线粒体蛋白质7.3.1 蛋白质寻靶(protein targeting)和蛋白质分选(protein sorting)蛋白质的两种转运方式细胞质中的核糖体在合成蛋白质时有两种可能的存在状态，一种是在 蛋白质合成的全过程一直保持游离状态(实际上是与细胞骨架结合在一起 的)，这种核糖体称另一种情况是核糖体在合成蛋白质的初始阶段处于自 由状态，但是随着肽链的合成，核糖体被引导到内质网上与内质网结合在 一起，这种核糖体称为这两种核糖体上合成的蛋白质不仅在细胞内的去向 不同，它们的转运方式也是不同的。翻译后转运(post-translational translocation)与蛋白质寻靶游离核糖体上合成的蛋白质释放到胞质溶胶后被运送到不同的部位,即先合成，后运输。由于在游离核糖体上合成的蛋白质在合成释放之后需 要自己寻找目的地，因此又称为蛋白质寻靶(7-11)。图7-11蛋白质翻译后转运定位在线粒体、叶绿体、细胞核、细胞质、过氧化物酶体的蛋白质在 游离核糖体上合成后释放到胞质溶胶中，进入细胞核的蛋白质通过核孔运 输，与定位到其他翻译后转运的细胞器蛋白的运输机制不同。蛋白质分选膜结合核糖体上合成的蛋白质通过定位信号，一边翻译，一边进入内 质网，由于这种转运定位是在蛋白质翻译的同时进行的，故称为共翻译转 运(图7-12)。在膜结合核糖体上合成的蛋白质通过信号肽，经过连续的膜 系统转运分选才能到达最终的目的地，这一过程又称为蛋白质分选。图7-12蛋白质的共翻译转运膜结合核糖体合成的蛋白质经内质网、高尔基体进行转运，运输的目 的地包括内质网、高尔基体、溶酶体、细胞质膜、细胞外基质等。导向序列(targeting sequence)与信号序列(signal sequence)导向序列将游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号称为导向信号(targeting signal),或导向序列(targetingsequence),由于这一段序列是氨基酸组成的 肽，所以又称为转运肽(transit peptide),或 信号序列将膜结合核糖体上合成的蛋白质的N-端的序列称为信号序列(signalsequence),将组成该序列的肽称为信号肽(signal peptide)。在不需要特别区分时，可将它们统称为信号序列或信号肽。比较引导序列与信号序列有什么不同？(答案)答：无论是在游离核糖体合成的蛋白质还是在膜结合核糖体合成的蛋 白质，它们的转运都是由信号引导的，这种信号一般存在于蛋白质的N-端，这就是蛋白质的定位信号。由于游离核糖体合成的蛋白质与膜结合核 糖体合成的蛋白质的运输信号不同导致运输机制的不同，为了便于区别它 们，将游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号统称为导向信号(targeting signal),或导向序列(targeting sequence),由于这一段序列是氨基酸组成的 肽，所以又称为转运肽(transit peptide),或导肽(leading peptide)。将膜结 合核糖体上合成的蛋白质的N-端的序列称为信号序列(signal sequence),将 组成该序列的肽称为信号肽(signal peptide)o在不需要特别区分时，可将 它们统称为信号序列或信号肽。虽然转运到细胞核中的蛋白质也是在游离 核糖体上合成的，由于此类蛋白的运输机制特别，所以将这些蛋白中的定 位引导序列称为核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。)7.3.2 线粒体蛋白转运构成线粒体的蛋白主要是核基因编码的，少量是线粒体基因编码的，无 论是核基因还是线粒体基因编码的蛋白质都要转运定位。线粒体有四个组 成部分，其中有两层膜，所以由细胞质核糖体合成的蛋白质转运到线粒体基 质必须穿过两层膜障碍(图7-13)o图7-13线粒体蛋白转运的部位 线粒体基质蛋白(mitochondrial matrix protein)转运线粒体基质蛋白，除极少数外，都是游离核糖体合成，并通过转 运肽转运进来的，转运过程十分复杂(图7-14)。图7-14蛋白质输入线粒体基质线粒体基质蛋白是如何定位的？(答案)答：定位过程是：前体蛋白在游离核糖体合成释放之后，在细胞质分 子伴侣Hsp70的帮助下解折叠，然后通过N-端的转运肽同线粒体外膜上的 受体蛋白识别，并在受体(或附近)的内外膜接触点(contact site)处利用ATP水 解产生的能量驱动前体蛋白进入转运蛋白(protein translocator)的运输通道,然后由电化学梯度驱动穿过内膜，进入线粒体基质。在基质中，由线粒体分 子伴侣Hsp70(mHsp70)继续维持前体蛋白的解折叠状态。接着在Hsp60的 帮助下，前体蛋白进行正确折叠，最后由转运肽酶切除导向序列，成为成熟的 线粒体基质蛋白。)从线粒体基质蛋白质的定位，可看出导肽在转运蛋白时具有哪些特点？(答案)答：线粒体转运肽转运蛋白质时，具有以下特点：需要受体由于被转运的蛋白质需要穿过(或插入)线粒体膜,转运肽 首先需要与线粒体膜上的受体识别，然后才能进行转运。从接触点进入 线粒体的内外膜要局部融合形成被运输蛋白进入的 接触点(contact site)o蛋白质要解折叠 蛋白质在合成时为了防止降解，需要立即折叠形 成空间结构，但是在转运时，必须解折叠，运入线粒体之后再重新折叠，需要能量 转运肽引导的蛋白质转运是一个耗能过程，既要消耗ATP,又要膜电位的驱动。需要转运肽酶由于转运肽只是起蛋白质转运的引导作用，而非蛋 白质的永久结构，所以，当蛋白质到达目的地后，转运肽要被切除，是由 转运肽酶(transit peptidase)催化的。需要分子伴侣的帮助 在线粒体蛋白的转运过程中，至少需要两种类型的分子伴侣的参与，一种是帮助转运的蛋白质解折叠，另一种是将转运的 蛋白质重新折叠。线粒体膜间隙蛋白的转运线粒体膜间隙蛋白，如细胞色素c的定位需要两个导向序列，位于N 端最前面的为基质导向序列(matrix-targeting sequence),其后还有第二个导 向序歹U,艮膜可隙导向序歹U(intermembrane-space-targetingsequence),功 能是将蛋白质定位于内膜或膜间隙，这类蛋白有两种转运定位方式。保守性寻靶(conservative targeting)前体蛋白在N-端的基质导向序 列引导下采用与线粒体基质蛋白同样的运输方式，将前体蛋白转运到线粒 体基质，在基质中由转肽酶切除基质导向序列后，膜间隙导向序列就成 了 N端的导向序列，它能够识别内膜的受体和转运通道蛋白，引导蛋白 质穿过内膜，进入线粒体膜间隙，然后由线粒体膜间隙中的转肽酶将膜间 隙导向序列切除(图7-15)。图7-15线粒体内膜蛋白的保守性寻靶，详见正文 非保守性寻靶(nonconservative targeting)与保守性寻靶不同,蛋白质的非保守性寻靶首先在线粒体基质导向序 列的引导下，通过线粒体的外膜和内膜，但是疏水的膜间隙导向序列作为停 止转运序列(stop-transfer sequence)锚定在内膜上，从而阻止了蛋白质的C-末端穿 过内膜进入线粒体基质；然后通过蛋白质的扩散作用,锚定在内膜上的蛋白 逐渐离开转运通道，最后在转肽酶的作用下，将膜间隙导向序列切除,蛋白质 释放到膜间隙，结合血红素后，蛋白质折叠成正确的构型（图7-16）。图7-16线粒体膜间隙蛋白的非保守性寻靶 线粒体内膜和外膜蛋白的转运图7-17显示线粒体内膜蛋白的N-端只有一个基质导向序列，内膜蛋 白在基质导向序列的引导下，按基质蛋白的转运方式进入线粒体基质后，由转肽酶切除导向序列，然后通过构型的变化或与别的蛋白结合形成复合物后再插入 到内膜中，详细机理尚不清楚。图7-17中的P70是线粒体外膜的一个重要的蛋白质，通过体外实验获 得有关外膜蛋白转运的一些线索。在P70的N-端有一个短的基质导向序列,紧随其后是一段较长的、强疏水性氨基酸序列。实验中，如果将疏水性氨基 酸序列缺失,P70进入线粒体基质，并且其基质导向序列依然连接在一起。这一结果提示，长的疏水性氨基酸序列可作为停止转运信号，既防止了外 膜蛋白进入线粒体基质，又作为锚定序列将外膜蛋白锚定在外膜上。正常 情况下，外膜蛋白N-端的基质导向序列和长的疏水性序列都不会被切除。图7-17线粒体内膜、外膜的导向序列7.3.3 线粒体蛋白转运的实验研究上面所讨论的线粒体蛋白的转运方式已得到许多实验的支持。线粒体蛋白转运的实验证明通过脉冲示踪研究发现酵母线粒体蛋白合成之后存在于胞质溶胶中，后来逐渐进入线粒体各部位，通过无细胞系统进一步证明这一结果。请设计一个实验证明线粒体蛋白合成之后进入了线粒体（答案）答：可通过基因工程和分子生物学方法进行研究，主要过程如下：克隆线粒体基质蛋白基因；在无细胞系统中合成酵母线粒体蛋白；检测分离后将合成的蛋白质分成两组，一组直接加入胰蛋白酶，另一 组先加入线粒体，然后再用胰蛋白酶蛋白酶处理；结果分析：如果加入线粒体的一组中的蛋白质对胰蛋白酶具有抗性,而不加线粒体的一组中蛋白质被胰蛋白酶水解，即可证明加入线粒体后，线粒体蛋白进入了线粒体。因为胰蛋白酶是水溶性的酶，不能进入线粒体，所以对胰蛋白酶的抗性说明线粒体蛋白进入了线粒体从而得到保护。实验过程示于图7E-lo图7E-1线粒体蛋白前体转运的实验证明）转运中间体与导向序列的特异性研究在线粒体蛋白转运中一个很重要的中间过程是基质导向序列穿过内 外膜，如果能够证明线粒体基质蛋白正在穿过内外膜通道形成的中间体的 存在则是对上述转运机制的最有力的证明。另外，线粒体导向序列对所引导的蛋白质是否具特异性也是人们所关 心的问题。科学家通过实验证明了中间体的存在，同时也证明了导肽没有特异性。科学家是怎样证明线粒体基质蛋白在转运过程中穿膜中间体的存在？如何证明导序列（导肽）没有特异性？（答案）答：主要是通过离体实证实了穿膜中间体的存在，并证明导向序列对所引导的蛋白质没有特异性(图7E-2)O首先利用DNA重组技术构建一个嵌合蛋白，其N-端含有一个长为31 个氨基酸的线粒体基质导向序列，其后接上一段间隔序列,长度为51个氨基 酸，紧接着是187个氨基酸组成的小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR),该酶在正常 情况下存在于胞质溶胶中，并且它的C-末端可在分子伴娘的作用下处于非 折叠状态。用无细胞系统合成的DHFR嵌合蛋白能够被转运到线粒体基质,然后切除导向序列。氨甲蝶吟(methotrexate)是DHFR抑制剂，它能够与嵌合的DHFR的活性位点牢牢 地结合，使嵌合DHFR锁定在折叠状态而不能进入线粒体基质。但是N-端的 导向序列能够进入线粒体基质，并被水解,此时的DHFR仍然被结合在膜上 形成稳定的转运中间体。这一实验中，间隔序列的设计非常重要，如果间隔 序列较短,譬如说35个氨基酸，就得不到稳定的转运中间体。当除去氨甲蝶 吟，嵌合DHFR就能完全进入线粒体基质。这一实验同时证明了导肽没有特异性。图7E-2线粒体蛋白转运中间体的证明(a)通过重组DNA技术构建的嵌合蛋白的结构。(b)转运中间体的证明。氨甲蝶吟是DHFR的抑制剂，它能够同DHFR的活性位点结合，使DHFR不能 解折叠，因而不能穿过运输通道，维持转运中间体的状态，这种状态能够通过 电子显微镜进行观察。当除去氨甲喋吟，转运中间体消失，因为DHFR能够解 折叠，从而进入线粒体基质。)7.4 线粒体的功能-氧化磷酸化作用线粒体是真核生物氧化代谢的部位，是糖、脂肪和氨基酸最终氧化放 能的场所。最终氧化的共同途径是三较酸循环和呼吸链的氧化磷酸化。7.4.1 真核细胞中的氧化作用（oxidation）葡萄糖和脂肪酸是真核细胞能量的主要来源，细胞通过对葡萄糖的代 谢获取能量。葡萄糖进入细胞后先在细胞质中通过酵解作用生成丙酮酸，如果有氧存在时，丙酮酸进入线粒体基质经过三较酸循环、电子传递和氧 化磷酸化，最后生成ATP和水。如果没有氧，丙酮酸经过发酵生成乳酸（图 7-18）o图7-18真核细胞中碳水化合物代谢俯瞰 葡萄糖酵解生成丙酮酸细胞质中的葡萄糖（或糖原）在一系列酶的催化下生成丙酮酸的过程称 为应的主要过程包括：葡萄糖在磷酸化酶的作用下形成1,6二磷酸果糖，此过程需要消耗两个ATP；二磷酸6-碳糖被裂解生成两 个3-碳糖；三碳糖被逐步转变成丙酮酸（图7-19）。图7-19葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸的过程 线粒体中乙酰CoA的生成 丙酮酸生成乙酰CoA细胞质膜中由糖酵解生成的丙酮酸分子经过线粒体外膜的孔蛋白进 入线粒体膜间隙，然后在运输蛋白的作用下穿过内膜进入线粒体基质。在 基质中，丙酮酸被丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase）氧化成乙酰辅酶A,同时生成一分子NADH和一分子CO2o脂肪酸在线粒体基质中通过B氧化途径(B-oxidation pathway)循环氧化生成乙酰辅酶A。生物需要能量时首先利用多糖，必要时也会利用脂肪。脂肪被水解生 成脂肪酸后进入线粒体。每两个脂肪酸碳产生一分子乙酰辅酶A,同时产 生一分子 NADH、一分子 FADH2(图 7-20)。图7-20脂肪酸氧化脂肪酸氧化的第一步是与辅酶A的筑基(-SH)结合而被激活。这一反应 发生在脂肪酸的脂酰基团在线粒体内膜运输蛋白帮助下穿过内膜之后。在 线粒体中，脂酰CoA经过B氧化循环，每循环一次，脱去两个C,产生一 分子乙酰CoA进入TCA循环，同时产生一分子NADH、一分子FADH2。乙酰辅酶A是线粒体能量代谢的核心分子，无论是糖还是脂肪酸 作为能源，都要在线粒体中被转变成乙酰辅酶A才能进入三较酸循环彻底 氧化。三较酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)乙酰CoA一旦形成，立即进入线粒体基质的循环氧化途径，即TCA循 环。TCA循环又称Krebs循环、柠檬酸循环(图7-21)。每循环一次生成两分 子的C02、一分子GTP、四分子的NADH(连同丙酮酸脱竣形成乙酰CoA时 产生的一分子NADH在内)和一分子的FADH2,释放5对电子。图7-21 TCA循环，特别标出从丙酮酸氧化开始释放的5对用于ATP合 成的电子形成部位 辅酶在能量传递中的作用能量传递中的辅酶催化细胞的氧化还原反应中的酶常常利用辅酶作为电子供体或受体,具有这种作用的辅酶是NAD+、NADP+、FAD和FMN（图7-22）o图7-22辅酶NAD+、NADP+、FAD和FMN在氧化和还原状态下的结构在NAD+和NADP+还原期间转移一个质子和两个电子，FAD和FMN还 原过程中转移两个质子和两个电子。尽管它们转移的质子数量不同，但是 每次转移的电子数量是相同的，都是两个电子。TCA循环产生还原型的辅酶一次TCA循环共产生1分子FADH2、4分子NADH,它们总共接受了 5 对电子。这些电子可用于ATP的合成。苹果酸-天冬氨酸穿梭（malate-aspartate shuttle）与甘油磷酸穿梭（glycerol-phosphate shuttle）,将胞质溶胶中产生的1分子NADH的电子 传递到线粒体内膜参与电子传递（图7-23）o葡萄糖在胞质溶胶中进行糖酵解时形成的1分子NADH是怎样被氧化 的？（答案）答：葡萄糖在胞质溶胶中进行糖酵解时形成1分子NADH,由于胞质溶 胶中形成的NADH自身不能进入线粒体，但可通过另外的方式将其电子转 移到线粒体并参与电子传递:将电子还原那些小分子的代谢物，这些小分子的代谢物 能够:通过苹果酸-天冬氨酸穿梭（malate-aspartate shuttle）进入线粒体，然 后将线粒体中NAD+还原成NADH；通过甘油磷酸穿梭（glycerol-phosphate shuttle),将电子传递给线粒体的FAD,使其还原形成FADH2。这些被还原的辅 酶通过线粒体内膜的电子传递链最后被传给氧。如在甘油-磷酸穿梭过程中，电子从NADH转移给二羟丙酮磷酸(DHAP)生成甘油3磷酸，甘油3磷酸进入线粒体膜间隙后被线粒体内膜中的甘 油3-磷酸脱氢酶脱氢，将内膜中FAD还原成FADH2o脱氢的甘油3磷酸又 穿梭回到胞质溶胶，FADH2在内膜中被氧化。)图7-23甘油-磷酸穿梭在甘油-磷酸穿梭过程中，电子从NADH转移给二羟丙酮磷酸(DHAP)生成甘油3磷酸，进入线粒体膜间隙，甘油3-磷酸被线粒体内膜中的甘油 3-磷酸脱氢酶脱氢，使内膜中FAD还原成FADH2。脱氢的甘油3-磷酸又穿 梭回到胞质溶胶。FADH2中的电子再转移给线粒体内膜的电子传递链中的 电子载体。7.4.2呼吸链与电子传递在三较酸循环中，乙酰CoA氧化释放的大部分能量都储存在辅酶(NADH和FADH2)分子中。细胞利用线粒体内膜中一系列的电子载体(呼吸 链)，伴随着逐步电子传递，将NADH或FADH2进行氧化，逐步收集释放的自由能最后 用于ATP的合成，将能量储存在ATP的高能磷酸键。电子载体(electron carriers)在电子传递过程中与释放的电子结合并将电子传递下去的物质称为 电子载体。参与传递的电子载体有四种：黄素蛋白、细胞色素、铁硫蛋白 和辅酶Q,在这四类电子载体中，除了辅酶Q以外，接受和提供电子的氧 化还原中心都是与蛋白相连的辅基。黄素蛋白是由一条多肽结合1个辅基组成的酶类，每个辅基能够接受 和提供两个质子和电子(图7-22)o细胞色素(cytochromes)细胞色素是含有血红素辅基(图7-24)的一 类蛋白质。在氧化还原过程中，血红素基团的铁原子可以传递单个的电子。血红素中的铁通过Fe3+和Fe2+两种状态的变化传递电子；在还原反应时,铁原子由Fe3+状态转变成Fe2+状态；在氧化反应中，铁由Fe2+转变成Fe3+。图7-24细胞色素c的血红素基团的结构及氧化还原状态的变化四个吓琳环都含有侧链，不同的细胞色素所含侧链不同。图中所示是细 胞色素c血红素与多肽的两个半胱氨酸共价结合，但在大多数细胞色素分 子中，血红素并不与多肽共价结合。铁硫蛋白是含铁的蛋白质，也是细胞色素类蛋白。在铁硫蛋白分子的 中央结合的不是血红素而是铁和硫，称为铁-硫中心(iron-sulfur centers,图 7-25)o图7-25两种类型的铁硫蛋白的结构(a)2Fe-2S型铁硫蛋白；(b)4Fe-4s型铁硫蛋白辅酶Q是一种脂溶性的分子，含有长长的疏水链，由五碳类戊二醇构成。如同黄素蛋白，每一个配能够接受和提供两个电子和质子(图7-26),部分还原的称为半配，完全还原的称为全能(UQH2)。图7-26辅酶Q的氧化和还原形式辅酶Q的氧化还原分两步进行，先接受一