单核增生李斯特氏菌检测.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单核增生李斯特氏菌检测,单核增生李斯特氏菌检测,第1页,内 容,介绍李斯特氏菌属,单核增生李斯特氏菌生物学特征,流行病学,致病性,试验室危害及其预防,检测程序,快速检测方法,单核增生李斯特氏菌检测,第2页,李斯特氏菌属,李斯特氏菌属（,Listeria,）普遍存在于环境中，最新分类学研究表明，其分为六个种：,单核增生李斯特氏菌（,Listeria monocytogenes,）,绵羊（伊氏）李斯特氏菌（,Listeria ivanovii,）,英诺克（无害）李斯特氏菌（,Listeria innocua,）,斯氏李斯特氏菌（,Listeria seeligeri,）,威氏李斯特氏菌（,Listeria welshimeri,）,格氏李斯特氏菌（,Listeria grayi,）,在李斯特氏菌属六个种中，只有两种致病菌：,单核增生李斯特氏菌,和,伊氏李斯特氏菌,能够引发老鼠和其它动物发病。不过，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类李斯特氏菌症（,listeriosis,）相关。所以，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。,单核增生李斯特氏菌检测,第3页,生物学特征,-,菌体形态及染色特征,革兰氏,阳性,小、类似球形,杆菌,，,0.4,0.50.52,m,，,在有些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成,V,形，或成群细胞沿长轴方向平行排列，在较老或生长不良培养物中，可能形成丝状；,20-25,周生,鞭毛,运动，在,37,只有较少鞭毛或,1,根鞭毛；,无芽孢、无荚膜。,单核增生李斯特氏菌检测,第4页,单核增生李斯特氏菌检测,第5页,生物学特征,-,培养特征,兼性厌氧；,在,20-25,培养有,动力,，穿刺培养,2-5,天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。,生长温度范围为,2-42,（也有报道在,0,能迟缓生长），最适培养温度为,30-37,。,pH,范围,pH4.4-pH9.6,。,单核增生李斯特氏菌检测,第6页,生物学特征,-,培养特征,在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但伴随菌落增大，变得不透明。,在,5-7%,血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小,-,溶血环,。,在,0.6%,酵母浸膏胰酪大豆琼脂,(TSAYE),琼脂上，用,45,角入射光照射菌落，经过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。,单核增生李斯特氏菌检测,第7页,生物学特征,-,生化反应,氧化酶,阴性。,能发酵各种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、,鼠李糖,、,七叶苷,、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵,木糖,、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。,不利用枸橼酸盐，,40%,胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，,VP,、甲基红试验和精氨酸水解阳性。,单核增生李斯特氏菌检测,第8页,生物学特征,-,血清型,依据菌体（,O,）抗原和鞭毛,(H),抗原，将单增李氏菌分成,13,个血清型，分别是,1/2a,、,1/2b,、,1/2c,、,3a,、,3b,、,3c,、,4a,、,4b,、,4ab,、,4c,、,4d,、,4e,和“,7”,。,致病菌株血清型普通为,1/2b,、,1/2c,、,3a,、,3b,、,3c,、,4a,、,1/2a,和,4b,后两型尤多。,单核增生李斯特氏菌检测,第9页,生物学特征,-,抵抗力,该菌对理化原因抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长久存活；,对碱和盐抵抗力强，,60-70,经,5-20min,可杀死，,70%,酒精,5min,、,2.5%,石炭酸、,2.5%,氢氧化钠、,2.5%,福尔马林,20min,可杀死此菌；,湿热灭菌（,121,，最少,15min,）和干热灭菌（,160-170,，最少,1hr,）可杀灭该菌，对紫外线和,射线敏感；,该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素（已产生抗性）、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。,单核增生李斯特氏菌检测,第10页,流行病学,分布,：广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中都有该菌存在，所以动物很轻易食入该菌，并经过口腔,-,粪便路径进行传输,寄主范围,：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫,单核增生李斯特氏菌检测,第11页,流行病学,据报道，有,1-10%,人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，,4-8%,水产品、,5-10%,奶及其产品、,30%,以上肉制品及,15%,以上家禽均被该菌污染。,相关食品,：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软奶酪）、冰激凌、生蔬菜、发酵过生肉制作香肠、生和加工过禽肉、各种生肉类、生和烟熏鱼肉。约有,85-90%,病例是由被污染食品引发。,单核增生李斯特氏菌检测,第12页,致病性及其治疗,该病临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺点患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发烧、抽搐、昏迷、,自然流产或死婴,、脑膜炎、败血症直至死亡。,由该菌造成脑膜炎致死率可高达,70%,，败血症死亡率达,50%,，围产期或新生儿感染死亡率超出,80%,，怀孕期妇女感染，母亲通常能存活下来。,抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，或与氨基糖苷类抗生素一起用药。,单核增生李斯特氏菌检测,第13页,感染人群,感染剂量未知，但与该菌毒力和易感人群年纪、免疫状态相关。,易感者：,孕妇,/,胎儿,围产期和新生儿感染；,免疫缺损者；,癌症病人,尤其是白血病患者；,年纪较大人；,没有免疫缺点健康人，食用污染该菌尤其是大量污染该菌食品后，也有患病危险。,单核增生李斯特氏菌检测,第14页,致病机理,单增李氏菌抗原结构与毒力无关，它致病性与毒力机理以下：,1,、寄生物介导细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；,2,、抗活化巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内过氧物（为杀菌毒性游离基团）分解；,3,、,溶血素,，即李氏杆菌素,O,，能够从培养物上清液中取得，有,和,两种，为毒力因子。,单核增生李斯特氏菌检测,第15页,试验室危害,不是一个普遍与试验室相关传染病，当前只有少数有报道案例发生；,直接摄取,是最普遍一个感染方式，除此之外，暴露在该菌高浓度气溶胶中，也可经过眼睛和破损皮肤、粘膜进入体内造成感染。,单核增生李斯特氏菌检测,第16页,注意事项,生物安全,2,级,，操作时应有对应防污染设施，在进行可能产生气溶胶操作时，应在生物安全柜内完成；,在直接接触有感染性材料时，必须穿着试验服，戴手套和护目镜；,怀孕妇女,应防止接触传染物。,单核增生李斯特氏菌检测,第17页,操作要求,溅洒,：使气溶胶沉降，穿着防护服装，用纸巾轻轻覆盖溅洒处，加入,1%,次氯酸钠溶液，由周围向中心加，在清理之前要留充分接触时间（,30min,）；,废弃,：在废弃前应先采取净化办法，高压蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等；,储存,：在有适当标识密封容器内储存。,单核增生李斯特氏菌检测,第18页,25g,样品,+225ml FB,1,增菌液,30 25h1h,1mL,转种,10mLFB,2,增菌液,30 25h1h,VIDAS,快速筛选,阴性，汇报结果,阳性，继续判定,选择性培养基（显色培养基、,OXA,、,PALCAM,）,挑选可疑菌落，接种,TSA-YE,35 24h,接种,TSB-YE,蓝色菌落检验,经典运动检验,过氧化氢酶试验,革兰氏染色,溶血试验,动力试验,协同溶血试验,血清学试验,汇报结果,单核增生李斯特氏菌,检测流程,（,SN/T 0184.1-,）,API,判定试验或生化试验,尿素酶水解，硝酸盐还原，葡萄糖，甘露醇，麦芽糖，鼠李糖，木糖，七叶苷，,TSI MR-VP,单核增生李斯特氏菌检测,第19页,检测程序,-,增菌,当前常见单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有,半量,Fraser,肉汤,、,Fraser,肉汤,（,FB,）、,UVM,（,Modified University of Vermont broth,，也叫,UVM1,）、,LEB,（,Listeria,enrichment broth,）和,BLEB,（,buffered,Listeria,enrichment broth,）,单核增生李斯特氏菌检测,第20页,半量,Fraser,肉汤和,Fraser,肉汤,含有,选择性,和,区分性,。,加入,柠檬酸铁铵,和,七叶灵,，起到区分作用。李斯特氏菌能够水解七叶灵，与培养基中铁离子反应，使培养基变黑，可直观从培养液颜色就能够判断是否有单核李斯特氏菌生长。,单核增生李斯特氏菌检测,第21页,UVM,UVM,只有选择性没有区分性,加入,萘啶酮酸,和,盐酸吖啶黄,，作为选择性因子。即使其中含有七叶灵，不过没有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色颜色反应。,单核增生李斯特氏菌检测,第22页,LEB,和,BLEB,只有选择性没有区分性,LEB,是在,TSB-YE,基础上加入,盐酸吖啶黄,、,萘啶酮酸,和,放线菌酮,等选择性因子；加入,丙酮酸钠,，有利于受损细胞恢复；不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应,BLEB,是在,LEB,基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠,单核增生李斯特氏菌检测,第23页,检测程序,-,分离,分离培养基有：,OXA,、,PALCOM,、,LPM,、,MOX,等。分离原理主要是基于李斯特氏菌含有,D,葡萄糖苷酶,活性，能水解培养基中七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应,还有一些选择性显色培养基，如,BCM,、,ALOA,、,CHROMagar listeria,、,RapidL.mono,等，其原理主要是检测由毒力基因编码,溶血素,，而此种溶血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而能够很好将此两种菌同李斯特属其它种分开。,单核增生李斯特氏菌检测,第24页,OXA,平板,/,(palcam),单核增生李斯特氏菌,ATCC 19117,48h,，,35,培养,单核增生李斯特氏菌检测,第25页,OXA,平板,无害李斯特氏菌,ATCC 33090,48h,，,35,培养,单核增生李斯特氏菌检测,第26页,显色平板,单核增生李斯特氏菌检测,第27页,检测程序,-,判定,蓝色菌落检验（,Henry illumination,）,经典运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头,动力试验：,7,天，伞形生长,过氧化氢酶,试验：阳性,革兰氏染色,：阳性短杆菌,溶血试验,：穿刺接种血平板,硝酸盐还原试验：,5,天，阴性,糖发酵试验,：葡萄糖、麦芽糖和七叶灵，李斯特菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性，李斯特其它种甘露醇阴性，,木糖,和,鼠李糖,最有检测意义,单核增生李斯特氏菌检测,第28页,动力试验,单核增生李斯特氏菌检测,第29页,血平板,单核增生李斯特氏菌,ATCC 19117,36h,，,35,培养,单核增生李斯特氏菌检测,第30页,血平板,无害李斯特氏菌,ATCC 33090,36h,，,35,培养,单核增生李斯特氏菌检测,第31页,血平板,伊氏李斯特氏菌,ATCC 19119,24h,，,35,培养,单核增生李斯特氏菌检测,第32页,单增李斯特菌,无害李斯特菌绵羊李斯特菌,马红球菌,金葡,协同溶血试验,单核增生李斯特氏菌检测,第33页,单核增生李斯特氏菌检测流程,(GB/T4789.30-),检样,25g(,或,25mL),样品,+LB1,增菌液,225mL,，均质,0.1mL+10mL LB2,增菌液,李斯特氏菌显色培养基,PALCAM,琼脂,接种木糖、鼠李糖，,361,，,24h,；同时于,TSA-YE,平板划线纯化，,30 1,，,24h48h,木糖,-,，鼠李糖,+,判定,结果汇报,30 1,，,24h,30 1,，,1824h,36 1,，,24h48h,单核增生李斯特氏菌检测,第34页,单核增生李斯特氏菌检测流程,(FDA),25g,样品,+225ml BLEB,基础（加入丙酮酸钠）,加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮,30,4hr,划线接种,OXA,平板,30,24hr,和,48hr,科玛嘉李氏菌显色培养基,TSA-YE,分纯,35,24hr-48hr,35,24hr,过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发酵试验（木糖、鼠李糖）,API Listeria,35,24-48hr,汇报结果,35,18-,24hr,单核增生李斯特氏菌检测,第35页,方法名称,一次增菌,二次增菌,分离,判定,快速方法,SN 0184,-1993,加工,MBP,30,，,18-24h,EB,30,，,24/48h,MMA/,OXA,（,35,24-48h,）,蓝色菌落；经典运动；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发酵；动力试验；协同溶血*；血清学检验*；小鼠毒力试验*,无,未加工,EB,（,30,，,24/48h,）,GB/T 4789.30-,EB,（,301,，,48h,）,MMA,（,301,，,24-48h,）,蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色镜检（革兰氏染色、经典运动）；生化特征（溶血反应、硝酸盐还原、尿素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力试验；协同溶血,无,LB,1,（,301,，,24h,）,LB,2,（,301,，,24h,）,FDA,BLEB+Phy,（,30,，4h,）,BLEB+Phy+,三种抑菌剂,（,30,，,20/44h,）,OXA/PALOM/MOX/LPM+,七叶灵,+Fe,3+,推荐,BCM/ALOA/,RapidLmono,/CHROMagar,Listeria,蓝色菌落*；经典运动或动力试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血；血清学检验；小鼠毒力试验*,筛选、判定都能够使用快速方法,USDA,UVM,（,302,，,222h,）,FB,（,352,，,26-482h,）,MOX,（,352,，,26-482h,）,初步判定：纯菌菌落形态；经典运动；,生化判定：MICRO-ID Listeria或Api Listeria或BAM等方法中传统生化反应；协同溶血,遗传判定：核糖体RNA检测；PFGE*,筛选取快速方法必须经过确认后才可使用,判定中用到MICRO-ID、Api、GenProbe AccuProbe、GENE-TRAK,各官方方法比较,单核增生李斯特氏菌检测,第36页,各官方方法比较,方法名称,一次增菌,二次增菌,分离,判定,快速方法,CFIA,MFHPB-30,LEB,（,UVM,）,（,30,，,24/48h,）,MFB,（,35,，,24-48h,）,OXA+LPM,或,MOX,或,PALCOM,经典运动或动力试验；溶血试验；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速判定试剂盒*；过氧化氢酶革兰氏染色*；协同溶血*；血清学试验*,作为判定可选步骤，允许使用快速方法，如Vitek或API、Micro ID Listeria、Listera Accuprobe,ISO 11290-1:1996,（,E,）,半量,Fraser,肉汤,（,30,，,242h,）,Fraser,肉汤,（,35,或,37,，,482h,）,OXA,和,PALCOM,（,30,、,35,或,37,，,24-48h,，）,PALCOM,平板微需氧或好氧条件培养,蓝色菌落*；过氧化氢酶；革兰氏染色；动力试验或经典运动*；溶血试验；糖发酵试验；协同溶血；送参考试验室（血清或噬菌体分型）,无,NMKL No.136 2,nd,1999,LB,（,30.01.0,，,243h,）,LB,（,30.01.0,，,243h,）或,Fraser,肉汤（,37.01.0,，,484h,）,OXA,和,PALCOM,（,37.01.0,，,243/484h,，好氧或微需氧）,溶血试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；经典运动,动力试验；糖发酵试验；送参考试验室（血清、噬菌体、DNA或酶分型）,允许使用经过确认商业化生产单核增生李斯特氏菌菌株判定试验，但没列明详细试剂盒名称,单核增生李斯特氏菌检测,第37页,单核增生李斯特氏菌检测快速方法,VIDAS,VITEK,API Listeria,BAX,TECTA,单核增生李斯特氏菌检测,第38页,VIDAS LMO,：单核增生李斯特,VIDAS LIS,：李斯特氏菌,VIDAS,单核增生李斯特氏菌检测,第39页,API Listeria,单核增生李斯特氏菌检测,第40页,BAX,单核增生李斯特氏菌检测,第41页,TECRA,UNIQUE PLUS,TECRA,UNIQUE,TM,单核增生李斯特氏菌检测,第42页,