目基因克隆及基因文库构建.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,2011-9-26,目的基因的克隆及基因文库的构建,从生物体基因组中分离克隆目标基因，是分子克隆技术取得应用前提。进而，才能对目标基因进行以下研究：,确定其表示调控机制和生物学功效；,建立高效表示系统，构建含有经济价值基因工程菌（细胞）；,将目标基因在体外进行必要结构功效修饰，然后输回细胞内改良生物体遗传性状，包含人体基因治疗。,目标基因克隆与基因文库构建,2,目基因克隆及基因文库构建,第1页,普通来说，目标基因克隆策略分为两大类：,一类是利用,PCR,扩增、化学合成等技术体外直接合成目标基因，然后将之克隆表示。,另一类是构建感兴趣生物个体基因文库,，即将某生物体全基因组分段克隆，然后建立适当筛选模型从基因组文库中挑出含有目标基因重组克隆。,鸟枪法构建基因组文库,cDNA,法构建,cDNA,文库,3,目基因克隆及基因文库构建,第2页,目标基因克隆,基因分离物理方法,鸟枪法,cDNA,法,PCR,法,化学合成法,基因文库构建,鸟枪法,cDNA,法,4,目基因克隆及基因文库构建,第3页,一、目标基因克隆,取得目标基因，是基因工程研究中最主要内容，也是基因工程操作中关键。,每种基因都由四种碱基组成，含有极相同理化性质，这给分离特定基因带来很大困难。,尽管如此，人们仍可经过各种方法有效地分离出所要基因。,5,目基因克隆及基因文库构建,第4页,（一）基因分离物理方法,依据,DNA,分子两条链存在着,GC,，,A=T,碱基配对。如,DNA,分子中某段,GC,碱基对含量高，则其热稳定性就高，其熔解温度（,Tm,）就高。这么，人们经过控制熔解温度使富,A=T,区解链变性，而富,GC,区仍维持双链。能够利用单链核酸酶,S1,，去除解开单链部分，得到富,GC,区,DNA,片段。,6,目基因克隆及基因文库构建,第5页,用限制性内切酶将基因组,DNA,进行切割，得到很多在长度上与普通基因大小相当,DNA,片段（,1000 bp,），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当载体，转化后在受体菌（如：,E.Coli,）中进行扩增，再用适当筛选方法筛选出目标基因。,（二）鸟枪法克隆目标基因,(Shot gun,，又称霰弹法）,7,目基因克隆及基因文库构建,第6页,1.,鸟枪法克隆目标基因基本策略,随机克隆供体细胞全基因组,DNA,片段，然后经过快速有效筛选程序从众多克隆中分离出含有目标基因,重组子，进而取得目标基因。,鸟枪法适合用于原核细菌目标基因克隆分离。,8,目基因克隆及基因文库构建,第7页,2.,鸟枪法克隆目标基因基本步骤,染色体,DNA,切断,超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。,全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目标基因断开，,大小不可控。,部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目标基因完整。,与载体连接,假如转化子采取菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；假如转化子采取基因产物功效检测法筛选，则选择表示型载体。,假如转化子采取菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；假如转化子采取基因产物功效检测法筛选，则选择能使目标基因表示受体细胞。,转化受体细胞,筛选含有目标基因重组子,菌落原位杂交法、基因产物功效检测法（筛选模型建立）,9,目基因克隆及基因文库构建,第8页,3.,鸟枪法操作改进,使用这一改进方法前提条件是：目标基因酶切图谱已知。假如已知目标基因两端酶切口，可用该酶处理染色体,DNA,，,然后与载体拼接，这么能够确保目标基因完整性，从而提升目标重组子出现频率。,（,1,）使用特征性限制性内切酶切开染色体,DNA,10,目基因克隆及基因文库构建,第9页,比如，已知某目标基因位于,1.8,kb,Sal,I,片段中，将染色体,DNA,用,Sal,I,切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于,1.6-2.0,kb,大小区域内凝胶块，从此凝胶块中回收,DNA,片段，然后与载体进行拼接。,（,2,）在连接前将,DNA,片段进行分级分离,2.0,kb,1.6,kb,1.8,kb,11,目基因克隆及基因文库构建,第10页,冻融法,滤纸法,吸附法,低融点凝胶法,溶解法,（,3,）凝胶,DNA,片段回收技术,12,目基因克隆及基因文库构建,第11页,13,目基因克隆及基因文库构建,第12页,4.,鸟枪法克隆目标基因不足,工作量较大，需要了解目标基因背景知识,较难取得长度较小目标基因,不能除去真核生物目标基因内含子序列,优点：操作简单，命中率较高。,缺点：盲目性大，阳性片段不一定恰好是基因，样本多，可能会错漏目标基因。,14,目基因克隆及基因文库构建,第13页,（三）,cDNA,法克隆目标基因,是以,mRNA,为模版，用反转录酶合成互补,DNA,方法。,cDNA,克隆对于特定基因分离和特征研究是极有价值工具cDNA,文库最关键特征是它只包含在特定组织或细胞类型中已经被转录成,mRNA,那些基因序列。,15,目基因克隆及基因文库构建,第14页,1.cDNA,法克隆目标基因基本策略,mDNA,（,1,）,cDNA,第一链合成,5,ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,5,ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,5,ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,cDNA,第一链,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,16,目基因克隆及基因文库构建,第15页,反转录酶：,AMV,来自禽成髓细胞瘤病毒）,MMLV,（来自,Moloey,鼠白血病病毒）,引物：,Oligo,（,dT,）和随机引物,Oligo（dT）,引导,cDNA,合成,是指,Oligo（dT）,引物与,mRNA,3 末端,poly（A）,配对，引导反转录酶以,mRNA,为模板合成第一链,cDNA。,这种,cDNA,合成方法在,cDNA,文库构建中应用极为普遍，其缺点是因为,cDNA,末端存在较长,poly（A）,而影响,cDNA,测序。,随机引物引导,cDNA,合成,采取 610 个随机碱基寡核苷酸短片段来锚定,mRNA,并作为反转录起点。因为随机引物可能在一条,mRNA,链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较轻易合成专长,mRNA,分子 5 端序列。,随机引物,cDNA,合成方法不适合构建,cDNA,文库，普通用于克隆特定,mRNA,5 末端，如,RT-PCR,和 5-,RACE。,17,目基因克隆及基因文库构建,第16页,（,2,）,cDNA,第二链合成,煮沸,NaOH,本身引导法：,AAAAAAAAAAAAAA,5,ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,OH,3,Klenow,dNTPs,S1 nuclease,18,取得双链,cDNA,5,端会有几对碱基缺失,目基因克隆及基因文库构建,第17页,DNApol dNTPs,RNaesH,置换合成法：,5,ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,AAAAAAAAAAAAAA,p,5,5,S1,AAAA,TTT,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,5,TTTTTTTTTTTTTT,OH,3,AAAAAAAAAAAAAA,5,5,TTTTTTTTTTTTTT,3,3,T4-DNA ligase,RNaseH,：催化,DNA-RNA,杂合体,RNA,部分核内降解，产生不一样链长、带,3,羟基和,5,磷酸末端寡核糖核酸。,19,取得双链,cDNA,5端也会有几对碱基缺失,目基因克隆及基因文库构建,第18页,dCTP,TdT,引导合成法：,5,ppp5,G,G,AAAAA,OH,3,TTTTT,p,5,3,HO,5,ppp5,G,G,AAAAACCCCCCC,OH,3,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,5,p,GGGGGGG,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,5,p,GGGGGGG,AAAAA,OH,3,NaOH,退火,Klenow,dNTPs,20,取得双链,cDNA,能保留完整5端序列,目基因克隆及基因文库构建,第19页,（,3,）双链,cDNA,克隆,双链平头,cDNA,通常能够使用以下三种方法克隆入载体中：,平头末端直接与载体连接，但插入片段无法回收。,平头两端分别接同聚物尾，最好是,AT,同聚物尾，这么重组分子可经过加热局部变性和,S1,核酸酶处理回收插入片段。,加装人工接头引入酶切位点，方便插入片段回收。,21,目基因克隆及基因文库构建,第20页,22,目基因克隆及基因文库构建,第21页,（,1,）完备分离程序,提取细胞总,mRNA,，,合成总,cDNA,，,将之全部克隆，然后借助于适当筛选伎俩找到目标重组子。,筛选时，若使用是多拷贝载体，则采取菌落原位杂交法筛选；若使用是表示型载体，则采取菌落免疫杂交法筛选。,完备分离程序适合用于,mRNA,分子数少目标基因克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子,VIII,基因等。,2.cDNA,法分离目标基因基本程序,23,目基因克隆及基因文库构建,第22页,（,2,）特异分离程序,提取细胞总,mRNA,，,琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标,mRNA,，,由此合成双链,cDNA,，,然后进行克隆。,特异分离程序较适合用于,mRNA,丰度极高目标基因克隆如血红蛋白基因等。,24,目基因克隆及基因文库构建,第23页,（,3,）差异分离程序,利用两组细胞,mRNA种类差异，分离克隆差异,mRNA,所对应,cDNA,，,因而这种程序较适合用于分离克隆新基因。,比如：正常大鼠,FR3T3,成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表示，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功效。,25,目基因克隆及基因文库构建,第24页,多瘤病毒感染,FR3T3,细胞,正常,FR3T3,细胞,总,mRNA,总,mRNA,cDNA,双链,cDNA,单链,cDNA,提取,mRNA,合成,cDNA,合成第二链,克隆,提取,mRNA,共价交联,上柱,原位杂交,病毒诱导表示基因,cDNA,克隆,差异分离程序,26,目基因克隆及基因文库构建,第25页,3cDNA,法克隆目标基因不足,并非全部,mRNA,分子都含有,polyA,结构。,细菌或原核生物,mRNA,半衰期很短。,mRNA,在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难。,仅限于克隆蛋白质编码基因。,27,目基因克隆及基因文库构建,第26页,（四）,PCR,法克隆目标基因,使用,PCR,法克隆目标基因前提条件是：已知待扩增目标基因或,DNA,片段两侧序列，依据该序列化学合成聚合反应必需双引物。,1.PCR,法定向扩增目标基因基本原理,定义：,聚合酶链式反应,（Polymerase Chain Reaction,，,PCR,）技术是指在四种脱氧核苷三磷酸（,dNTP,）存在下，以寡聚合苷酸为引物，以单链,DNA,为模板，经,DNA,聚合酶催化，合成,DNA,互补链到达基因扩增目标过程。,28,目基因克隆及基因文库构建,第27页,PCR,技术反应周期包含三个步骤：,高温变性：,经过加热使得复制双螺旋,DNA,变性分离为单链，作为模板。（,91,，,1,分钟）。,低温退火：,（约,50,，,1,分钟）使专门设计一对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模板,DNA,两端互补区段互补结合。,适温延伸：,将反应混合物温度上升到,72,，保温,1,分钟。,29,目基因克隆及基因文库构建,第28页,5,5,目标基因,5,变性,加热,5,5,引物,退火,5,5,底物,聚合,5,5,5,5加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,1,2,3,30,目基因克隆及基因文库构建,第29页,31,目基因克隆及基因文库构建,第30页,PCR,原理图,32,目基因克隆及基因文库构建,第31页,由,Taq DNA,聚合酶扩增,PCR,产物中，其,3,末端总是会带有一个非模板依赖型突出碱基，而且这个碱基几乎总是,A,，,因为,Taq DNA,聚合酶对,dATP,含有优先聚合活性。因为该突出碱基存在，克隆时即能够采取,TdT,末端加同聚尾方法与载体拼接，也能够使用专门,T,载体克隆。,2.PCR,克隆目标基因基本程序,5,5,A,A,T,T,5,5,PCR,扩增产物,T,载体,T7,lacZ,MCS,ori,Amp,r,33,目基因克隆及基因文库构建,第32页,（五）化学合成法克隆目标基因,伴随寡核苷酸化学合成自动化，基因化学合成变得更经济、轻易和准确。,前提条件：对基因结构序列清楚。,分为：基因片段全化学合成,基因化学,-,酶促合成,34,目基因克隆及基因文库构建,第33页,1.,化学合成法基本策略,（,1,）全基因合成,化学合成目标基因前提条件是基因,DNA,序列已知，有三种策略。,小片段粘接法：,混合退火,依据目标基因全序列，分别合成,12-15个碱基单链,DNA,小片段,T4-DNA,连接酶连接,克隆入适当载体,35,目基因克隆及基因文库构建,第34页,补丁延长法：,混合退火,依据目标基因,两条互补链,全序列，分别合成,12-15个,碱基单链,DNA,小片段以及,20-30个,碱基单链,DNA,中片段,T4-DNA,连接酶连接,克隆入适当载体,Klenow,酶聚合,36,目基因克隆及基因文库构建,第35页,大片段酶促法：,混合退火,依据目标基因,全序列，分别合成,40-50个,碱基单链,DNA,片段,T4-DNA,连接酶连接,克隆入适当载体,Klenow,酶聚合,37,目基因克隆及基因文库构建,第36页,上述三种方法各有利弊：,化学合成,DNA,单片段愈短，收率就愈高，但因为化学合成份额较大，成本较高；,在大片段酶促法合成目标基因时，即使化学合成份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成收率极低。比如，每聚合一个单体产物收率为,95%，,则合成,50,个碱基,DNA,单链大片段总收率只有,7.7%。,38,目基因克隆及基因文库构建,第37页,（,2,）探针等寡聚核苷酸合成,在一些情况下，往往只知道目标基因编码产物部分氨基酸序列，而基因序列未知。此时需要从已知氨基酸序列推测其,DNA,序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或,cDNA,法得到基因文库，最终取得含有目标基因重组子。,因为大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列设计时必须考虑以下问题：,生物体对简并密码子偏爱性，合成系列探针。,探针应含有足够长度，通常在,17-20,个核苷酸之间。,探针内部不应出现可能互补区域。,39,目基因克隆及基因文库构建,第38页,某段连续氨基酸序列全部可能,DNA,序列,Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile,TGT,ATG,GAC,GAA,ATG,AAA,AGA,AAC,ATA,C T,G,G,G,T,T,C,设计简并探针序列,TG,T,ATG,GA,C,GA,I,ATG,AA,TG,T,ATG,GA,T,GA,I,ATG,AA,TG,C,ATG,GA,C,GA,I,ATG,AA,TG,C,ATGGA,T,GA,I,ATG,AA,A,G,另外还能够参考各种生物体,EST,数据库进行倾向性简并序列设计。,三个位点，八条引物,40,目基因克隆及基因文库构建,第39页,2.,化学合成单元操作,化学合成,DNA,实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包含：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。,从反应机理上来讲，,DNA,化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法。,详细操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。,前者操作繁琐，基本上已淘汰；,后者反应中间物分离程序简便；,DNA,合成仪就是依据固相亚磷酸三酯法原理设计。,41,目基因克隆及基因文库构建,第40页,化学合成单元操作,O,H,G,H,H,H,H,O,CH,2,O,DMT,P,O,Me,N,CH,Me,Me,CH,Me,Me,H,激活,缩合,氧化,脱取代基,玻璃珠,连接臂,DMT,：二甲氧基三苯甲基,Me,：甲基,42,目基因克隆及基因文库构建,第41页,3.,基因化学合成优点,能够合成细菌偏爱密码子,能够定向改变个别氨基酸,能够在两端加上需要限制酶切点,能够经过自动化仪器合成,43,目基因克隆及基因文库构建,第42页,4.DNA,化学合成用途,合整天然基因,修饰改造基因,设计新型基因,制备探针、引物、接头,如胰岛素基因、干扰素基因等。,如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等,44,目基因克隆及基因文库构建,第43页,二、基因文库构建,45,目基因克隆及基因文库构建,第44页,1.,基因文库基本概念,（,1,）基因库与基因文库,基因库（,gene pool）,特定生物体基因组上全部基因集合（天然存在）。,基因文库（,gene library or gene bank）,从特定生物个体中分离全部基因，这些基因以克隆形式存在（人工构建）。依据构建方法不一样，基因文库分为：,基因组文库（含有全部基因）,cDNA,文库（含有全部编码蛋白质结构基因）,46,目基因克隆及基因文库构建,第45页,（,2,）基因文库构建基本策略,用鸟枪法构建基因组文库：材料来自染色体DNA,。所谓基因组文库是将基因组,DNA,经过限制性内切酶部分酶解后所产生基因组,DNA,片段随机地同对应载体重组、克隆，所产生克隆群体代表了基因组,DNA,全部序列。,用,cDNA,法构建,cDNA,文库：材料来自,mRNA,。在高度分化生物体中，不一样组织和细胞在不一样时段,mRNA,种类不一样（即基因表示谱不一样），所以同种生物体,cDNA,文库有组织细胞界定，如肝组织,cDNA,文库或胚胎组织,cDNA,文库等。很显然，,cDNA,文库信息量远小于基因组文库。,47,目基因克隆及基因文库构建,第46页,依据基因文库功效不一样把基因文库分为：,克隆文库：克隆载体,表示文库：表示载体（融合蛋白和天然蛋白表示载体），蛋白质表示文库,（,3,）基因文库类别,48,目基因克隆及基因文库构建,第47页,依据载体不一样把基因文库分为：,质粒文库,噬菌体文库,柯斯质粒文库,人工染色体文库,不一样载体适于构建不一样文库！,49,目基因克隆及基因文库构建,第48页,（,4,）基因文库完备性,基因文库完备性是指：在构建基因文库中任一基因存在概率，它与基因文库所含最低克隆数,N,之间关系可用下式表示：,N=ln(1P)/ln(1f),其中：,P=,任一基因被克隆（或存在于基因文库中）概率,f=,克隆片段平均大小/生物基因组大小,比如，人单倍体,DNA,总长为,2.9,x 10,9,bp,，,基因文库中克隆片段平均大小为,15,kb，,则构建一个完备性为0.9,基因文库最少需要,45,万个克隆；而当完备性提升到,0.9999时，基因文库最少需要180,万个克隆。,50,目基因克隆及基因文库构建,第49页,（,5,）基因文库质量标准,除了尽可能高完备性外，一个理想基因文库应具备以下条件：,重组克隆总数不宜过大：以减轻筛选工作压力,载体装载量最好大于基因长度：防止基因被分隔克隆,克隆与克隆之间必须存在足够长度重合区域：以利克隆排序,克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保留、扩增、筛选,51,目基因克隆及基因文库构建,第50页,（,1,）基因组,DNA,制备,为了最大程度地确保基因在克隆过程中完整性，,用于基因组,文库构建,DNA,在分离纯化操作中应尽可能防止过分断裂。制备,DNA,分子量越大（最少是插入片断大小,3-5,倍），经切割处理后样品中含有不规则末端,DNA,片段比率就越低，重组率和完备性也就越高。,A,A,A,A,用常规方法制备染色体,DNA,长度普通在100,kb,左右,假如先将细胞固定在低融点凝,胶中，然后置入含有,SDS、,蛋,白酶,K、RNase,缓冲液中浸泡，可取得长达1000,kb,DNA,片段。,2.,基因组文库构建程序,52,目基因克隆及基因文库构建,第51页,（,2,）基因组,DNA,切割,用于基因组,文库构建,DNA,片段切割普通采取超声波处理和限制性内切酶部分酶切,两种方法，其目标是：,第一，确保,DNA,片段之间存在部分重合区,第二，确保,DNA,片段大小均一,超声波处理：,DNA,片段呈平头末端，需加装人工接头。,部分酶切法：普通选取四对碱基识别序列限制性内切酶,，,如,Sau,3AI,或,Mbo,I,等，这么,DNA,酶解片段大小可控。,连接前，上述处理,DNA,片段必须依据载体装载量进行分级分离，以杜绝不相干,DNA,片段随机连为一体！,53,目基因克隆及基因文库构建,第52页,（,3,）载体和受体选择,基因组文库构建载体：出于压缩重组克隆数量原因，通常选,装载量较大,-DNA,或考斯质粒,；对于大型基因组（如动植物和,人类）需使用,YAC,或,BAC,载体。,cDNA,文库构建载体：通常选质粒，,因为因为绝大多数真核生物,mRNA,小于,10,kb,。,l,-DNA,上述几个,载体最大装载量以下：,质粒,考斯质粒,1,0 kb,25,kb,45,kb,BAC,300,kb,YAC,400,kb,基因文库构建受体：依据载体使用选择大肠杆菌或酵母菌。,54,目基因克隆及基因文库构建,第53页,在基因组,文库构建过程中，,大量体系连接前先使用,小体系连接来寻找最正确百分比！,方法一：粘末端连接,方法二：人工接头法,（,4,）载体与,DNA,片段连接,（,5,）转化或侵染宿主细胞,在基因组,文库构建过程中，最好选择转化效率高进口感受态细胞和质量稳定进口包装蛋白！,55,目基因克隆及基因文库构建,第54页,56,目基因克隆及基因文库构建,第55页,（,6,）从基因文库中筛选目标基因,大型基因组,文库,普通由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除,了一些含有特殊功效蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）能够采取特殊正选择筛选,程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，普通基因组,文库筛选均需多轮操作步骤。,57,目基因克隆及基因文库构建,第56页,密集铺板（1-10万）,杂交,挖取,铺板,铺板,目标重组克隆,58,目基因克隆及基因文库构建,第57页,（,7,）基因组文库构建技术性问题,在基因组,文库构建过程中，,最应引发重视问题是：,禁止外源,DNA,片段之间连接！,为了防止上述情况发生，,可采取以下办法组合：,将待连接,DNA,片段依据载体装载量分级分离,用碱性磷酸单酯酶除去,DNA,片段末端磷酸基团,用,TdT,酶在,DNA,片段末端上增补同聚尾末端,59,目基因克隆及基因文库构建,第58页,（,8,）构建基因组文库应注意问题,1、构建一个文库，插入,DNA,和载体,DNA,质量是成功是否关键。基因组,DNA,应该非常纯以适应,DNA,酶解，而且基因组,DNA,也应足够大（最好超出,200kb,）以取得两个末端消化产物。,2、不论是载体,DNA,还是靶,DNA,不含外源片段是一个基本条件。污染少许探针序列或载体基因组,DNA,将引发很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被判定为所要克隆。,3、部分消化产品应该是一组覆盖整个基因组随机片段。识别4个碱基限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机插入片段。部分消化所产生片段应能连接到设定载体上。限制酶和部分消化过程应事先检验。一些批次酶质量不够高而造成产生,DNA,片段末端不能有效地连接。假如预期结果没有出现，检验限制酶和,DNA,浓度及纯度。,60,目基因克隆及基因文库构建,第59页,4、在考虑把,噬菌体臂和插入,DNA,片段连接过程中有两个主要参数：,噬菌臂和潜在插入片段百分比、基因组,DNA,浓度和纯度。,大约10,pg,噬菌臂和4,gDNA,能产生有效地包装。对一个经典基因组，要产生一个可表示文库，重组子数普通要大于,110,6,6,l0,6,。,5,、包装抽提物包装效率：贮存于,液氮,中可保持1年多。而在,-70,中只能保留几星期，而且包装效率还会降低。因为,包装抽提物质量,是一个关键性原因，商业性包装抽提物，比如,Gigapack,（,Stratagene,），都已经有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装,噬菌体,DNA,和插入片段过程能产生大量噬菌斑。,61,目基因克隆及基因文库构建,第60页,基因组文库构建程序,随机酶切成较大,DNA,片段（,10-30 Kb,，平均,20 Kb),，对这些片段进行分离,重组入适当载体（噬菌体）,转化进宿主菌（,E.coli,),，扩增，构建成基因文库,从基因组文库中筛选出含有目标基因组重组子,。,（,9,）总结,62,目基因克隆及基因文库构建,第61页,cDNA,文库组建步骤以下,3.cDNA,文库构建程序,Total RNA,提取,mRNA,分离,cDNA,双链合成,载体制备,cDNA,双链和载体连接,转化或转染,快速判定,pBlueScript cDNA,库扩增,63,目基因克隆及基因文库构建,第62页,64,目基因克隆及基因文库构建,第63页,（,1,）利用,PCR,技术构建,cDNA,文库,能够从极其有限起始材料中构建,cDNA,文库。,以总,RNA,为模板合成,cDNA,，,无需,mRNA,纯化，不但简化操作，而且防止了低丰度信息分子丢失。,能够提升,cDNA,文库完整性，取得那些低水平表示基因,cDNA,克隆。此法对植物基因功效研究，如对某种外界原因作用后或不一样发育阶段基因表示改变研究尤为适用。,65,目基因克隆及基因文库构建,第64页,（,2,）应用差异杂交法构建,cDNA,文库,适合用于分离经特殊处理而被诱发表示,cDNA,克隆；,技术基础：,在一个细胞群体中目标基因正常表示，在另一个细胞群体中目标基因不表示；,能够经过这两种总,mRNA,（,cDNA,拷贝）为探针平行杂交，对有目标基因表示细胞总,mRNA,构建克隆库进行筛选。,66,目基因克隆及基因文库构建,第65页,差示筛选（,Differential Screening,）,67,目基因克隆及基因文库构建,第66页,（,3,）应用扣除杂交法构建,cDNA,文库,不是细胞内全部表示基因全体集合，而是主要含差异表示基因部分,cDNA,集合；,用过量参考细胞,mRNA,或,cDNA,与目标细胞,cDNA,或,mRNA(,又称目标序列)杂交，形成,RNA-cDNA,杂交体是两种细胞共有，将其扣除；剩下,cDNA,或,mRNA,能够标识成探针(称减法或扣除探针)，从上述目标细胞,cDNA,文库中筛选目标克隆；,实质上是除去了一大批高丰度非特异性,cDNA,，含有是特异表示,cDNA,克隆及其它一些低丰度,mRNA,cDNA,克隆。,68,目基因克隆及基因文库构建,第67页,扣除杂交（,Subtractive Hybridization,）,69,目基因克隆及基因文库构建,第68页,基因组文库,cDNA,文库,信息供体,DNA mRNA,载体 噬菌体，黏粒，人工染色体 质粒，噬菌体,连接前 部分酶切，分级分离 反转录合成,cDNA,双链,连接 粘端连接，人工接头 同聚物加尾，人工接头,筛选 核酸探针 核酸探针，免疫探针,基因组文库和,cDNA,文库比较,70,目基因克隆及基因文库构建,第69页,组织,可克隆之,DNA,载体,DNA,cDNAmRNA,部分酶解,DNA,DNA,长度分级,双链,cDNA,DNA,与载体连接,引入宿主细胞,判定文库完备性,扩增后供长久储存,筛选出所需要克隆,71,目基因克隆及基因文库构建,第70页,4.,基因文库重组克隆排序,大型基因文库（包含人基因文库）构建在技术上并不十分困难，假如一个,YAC,基因文库插入片段总和为整个基因组十倍以上时，普通就能从基因文库中调出任何一段,DNA,序列。然而基因文库克隆都是随机序列，必须将全部克隆排列成一个像天然染色体,DNA,上所表现出信息次序。这项工作工作量可能远大于基因组文库构建，属于基因文库后期制作。,72,目基因克隆及基因文库构建,第71页,原理：,将单一,YAC,克隆插入,DNA,片段,用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标识同位素。,然后再用,Sau,3AI,或,Mbo,I,将末端标识,DNA,片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每,10,个,YAC,克隆走在同一块板上，形成10个克隆特征性,DNA,指纹图谱。,电脑分析指纹图谱，如发觉任何两个克隆,DNA,指纹图谱有部分相同，则其两个,YAC,片段就有相互重合可能性，于是这两个,YAC,克隆,DNA,片段克隆在染色体上是排列在一起。,（,1,）酶切片段末端标识法,73,目基因克隆及基因文库构建,第72页,H,H,H,H,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,单一克隆指纹图谱,十克隆指纹图谱,载体,DNA,克隆,DNA,74,目基因克隆及基因文库构建,第73页,原理：,将若干,YAC,克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成,20,种随机序列短探针。,用,20,种探针随机定位杂交（一对一）,20,份,YAC,克隆薄膜。,假如某两个克隆对同一个探针展现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重合。若将杂交阳性结果记为,“,1,”,，而阴性结果记为,“,0,”,，可清楚地列成一张表，最终排出上述,YAC,克隆排列次序。,（,2,）随机探针联合杂交法,75,目基因克隆及基因文库构建,第74页,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,A,B,C,D,E,F,G,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,76,目基因克隆及基因文库构建,第75页,01,04,12,06,13,14,02,14,07,19,11,15,05,08,16,03,10,09,20,18,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,11,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,F,C,A,D,G,E,B,77,目基因克隆及基因文库构建,第76页,从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读起点，将之两端序列分别亚克隆,，,亚克隆片段在,0.5-2.0,kb,范围内。,分别以上述亚克隆,DNA,片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中插入,DNA,片段必定与起点克隆所含,DNA,片段连锁在一起。,然后再以阳性克隆片段两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体,DNA,端点。,（,3,）染色体走读法（,chromosome walking）,78,目基因克隆及基因文库构建,第77页,79,目基因克隆及基因文库构建,第78页,从基因文库大量克隆中判定出某个含有目标基因特定克隆过程，称为筛选,.,筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探针能够与其互补序列结合从而检测出含目标基因克隆。,将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性标识探针溶液中保温，检出对应克隆。,通常构建核酸探针，要求了解其基因序列或表示产物（蛋白质）信息。,（,1,）基因文库筛选策略,5.,基因文库判定和筛选,80,目基因克隆及基因文库构建,第79页,（,2,）基因文库探针制备,寡聚核苷酸探针：,DNA,合成仪,抗体探针：检测,cDNA,编码蛋白质,81,目基因克隆及基因文库构建,第80页,寡聚核苷酸探针,82,目基因克隆及基因文库构建,第81页,抗体探针,83,目基因克隆及基因文库构建,第82页,（,3,）平板杂交筛选,克隆,DNA,转移到尼龙膜上；,膜上,DNA,在碱性条件下变性，解聚形成单链；,再经过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；,再将膜置于含有放射性标识核酸探针溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；,杂交后充分洗去未杂交探针，然后可由放射性自显影判定。,84,目基因克隆及基因文库构建,第83页,对应菌斑或噬菌斑位置不变，能够直接找出阳性菌落。,85,目基因克隆及基因文库构建,第84页,86,目基因克隆及基因文库构建,第85页,试验技术,Gateway,技术：,Invitrogen,企业In-Fusion PCR,技术：,TaKaRa,企业,87,目基因克隆及基因文库构建,第86页,Gateway,技术,MultiSite Gateway,Pro 2-Fragment Recombination,Two PCR products flanked by specific,att,B or,att,Br sites and two MultiSite Gateway Pro Donor vectors are used in separate BP recombination reactions to,generate two entry clones.The two entry clones and a destination vector are used together in a MultiSite Gateway Pro LR recombination reaction to create your expression clone containing two DNA elements.,88,目基因克隆及基因文库构建,第87页,MultiSite Gateway,Pro 3-Fragment Recombination,Three PCR products flanked by specific,att,B or,att,Br sites and three MultiSite Gateway Pro Donor vectors are used in separate BP recombination reactions to generate three entry clones.The three entry clones and a destination vector are used together in a MultiSite Gateway Pro LR recombination reaction to create your expression clone containing three DNA elements89,目基因克隆及基因文库构建,第88页,MultiSite Gateway Pro 4-Fragment Recombination,Four PCR products flanked by specific attB or attBr sites and four MultiSite Gateway Pro Donor vectors are used in separate BP recombination reactions to generate four entry clones.The four entry clones and a destination vector ar