免疫组织化学技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,概念,：应用,免疫学及组织化学原理,，对,组织切片或细胞标本,中一些多肽和蛋白质等,大分子物质,进行,原位定性、定位或定量,研究技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。,基本过程,：被检抗原,/,半抗原提取,免疫动物,特异性抗体,标识抗体,抗原抗体反应部位出现有色沉淀,能与对应抗体结合出现抗原,-,抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和全部类脂都属于半抗原。,免疫组织化学技术,第1页,免疫酶组织化学,免疫荧光组织化学,免疫胶体金组织化学,亲和免疫组织化学,（抗原信号放大系统）,优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。,免疫组织化学技术,第2页,第一节 免疫组织化学基本原理,一、,直接法,用,酶,或其它标识物,标识特异性抗体,直接与标本中对应,抗原,结合，再与,酶底物,作用产生,有色产物沉积,，在抗原抗体反应部位即可检测。,免疫组织化学技术,第3页,优点：,简单快速，,特异性,强，,非特异性,反应低；,缺点：,敏感性差,；抗原量要求高；,极难取得各种市售标识抗体。（肿瘤蛋白标识物：低丰度蛋白）,在免疫荧光和免疫酶技术中因材料处理不妥或用量不妥产生背景着色反应。,免疫组织化学技术,第4页,第一抗体（,兔,）不标识，使用与,一抗,种属相同抗体,Fc,段,（有种属特异性）作为抗原,免疫动物（羊），,制备抗抗体，即,第二抗体（羊抗兔），,并,标识第二抗体,。,二、间接法,染色时，顺次以,第一抗体,和,标识第二抗体,处理标本，在抗原存在部位形成,抗原,-,第一抗体,-,标识第二抗体复合物,，以到达检测该抗原目标。,免疫组织化学技术,第5页,优点：,间接法因第二抗体放大作用敏感性大大增高（放大原理,=,抗原：抗体,1,：,6,）,；,缺点：,可能出现非特异性反应；,子宫内膜巨噬细胞移动抑制因子,MIF,免疫组织化学技术,第6页,三、亲和,免疫组织化学,(,一,),亲和素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物法,(avidin-biotin-peroxidase complex method,，,ABC,法,),特点,:,以,亲和素,作为,“,桥,”,将,生物素结合酶,和,生物素化抗体,连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性。,1.,原理,:,生物素,(biotin),为含硫杂环单羧酸，生物素分子量为,244.31,，,pI,为,3.5,，咪唑酮环（又称,Ureido,环）,(I,环,),是与亲合素结合主要部位；,环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧基是标识抗体和酶唯一结构。,免疫组织化学技术,第7页,亲和素,(avidin),又称抗生物素蛋白，是一个糖蛋白，分子量为,6.8KD,，,pI 10,10.5,；在,pH9,13,缓冲液中性质均稳定。天然亲合素为碱性蛋白，由,4,个相同亚单位组成,4,聚体；每个亲合素亚单位经过其结构中色氨酸残基与生物素中,Ureido,环（,I,环）结合。所以，,1,个亲合素分子存在,4,个与生物素分子结合位点,免疫组织化学技术,第8页,ABC,法,免疫组织化学技术,第9页,链霉亲和素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物法,SABC,法原理,免疫组织化学技术,第10页,2.,免疫组织化学酶类标识物,免疫组化标识物酶以共价键结合在抗体上，,SABC,法则采取生物素,-,亲和素系统，制成酶标抗体，再借助酶对底物特异催化作用，生成有色不溶沉淀，在光镜下进行各种抗原成份观察。,惯用酶类：辣根过氧化物酶,(Horseradish peroxidase,，,HRP),碱性磷酸酶,(Alkaline phosphatase,，,AP),免疫组织化学技术,第11页,用于标识酶特征,酶催化反应形成产物易于在光镜下观察,酶反应终产物是稳定沉淀，不会从酶活性部位向四面弥散而影响组织学定位,较易取得纯酶分子,中性,PH,值时，酶分子稳定,酶连接在抗体上，二者活性均不受影响,免疫组织化学技术,第12页,HRP,底物,:,过氧化物：过氧化氢,供氢体：二氨基联苯胺,(Diaminobenzidine,DAB),3-,氨基,-9,乙基咔唑,(3-amino-9-ethylcarbozole,AEC),DAB+H2O2,棕色；,AEC+H2O2,紫红色,AP,磷酸酯水解酶，,溴氯羟吲哚磷酸盐,(,底物）,/,硝基蓝四唑,(BCIP/NBT),溴氯羟吲哚磷酸盐,(,底物）,/,硝基,四紫唑,(BCIP/INT),NBT/BCIP,蓝紫色,INT/BCIP,棕红色,或,橘黄色,HRP,HRP,AP,AP,免疫组织化学技术,第13页,ABC,法,优点,：敏感性更高,ABC,法,缺点,：,亲和素,(,鸡蛋白,),中含有,10%,糖类，造成背景着色,亲和素等电点约,10,左右，带较多负电荷，造成纤维组织着色。,内源性生物素造成背景着色,亲和素中有,4,个结合点，其中二分之一与连接抗体结合，另二分之一与复合物结合，可降低其敏感性。,免疫组织化学技术,第14页,(,二,),链霉菌抗生物素蛋白,-,过氧化酶法,（,Streptavidin-peroxidase method,，,SP,法）,链霉亲和素替换,ABC,法中亲和素,-,生物素复合物，形成链霉菌抗生物素蛋白,-,过氧化酶法，,SP,法,免疫组织化学技术,第15页,Ag,1Ab,2Ab,DAB,ABC method,DAB,SP method,A-B-Complex,Sa-P-Complex,P,A,B,P,Sa,放大系统,免疫组织化学技术,第16页链霉亲和素,SA,（链霉菌抗生物素蛋白）约,6.5KD,，由,4,条相同肽链组成，每条肽链可结合,1,个生物素分子。每个,SA,有,4,个生物素结合位点，结合常数与,A,相同为,1015mol/L,，约为抗原抗体间,ka,（,105,1011 mol/L),1,万倍以上。,SA,最高活性可达,18u,，较,A,高（,15u,）；,SA,四个亚基能够全部和二抗上生物素结合。,链霉亲和素组织穿透性强，反应速度快。,等电点为,5.56.7,，靠近中性，所带负电荷少；,链霉亲和素不含糖基。,SP,法优点,免疫组织化学技术,第17页,第二节、免疫组织化学染色步骤,一、免疫组化染色步骤,（一）石蜡切片,1.,烤片：,58 2-,h,；,目标：带蜡组织切片牢靠黏在载玻片上,注意：高温加速组织中抗原氧化,2.,脱腊和水化：二甲苯,、,中浸泡,15min,脱蜡,100,酒精,、,中分别浸泡,5min95,、,90,、,80,、,70,酒精各浸泡,2minPBS,洗,3,次,3min,置蒸馏水中待用；,免疫组织化学技术,第18页,3.,抗原修复：甲醛形成醛键、羧甲基等封闭部分抗原决定簇；蛋白分子交联隐蔽了抗原决定簇。,加热修复：,高压修复：,pH 6.0,0.1mol,L,柠檬酸缓冲液高压锅内煮沸，切片置于其中,高压修复,1.5min,，室温冷却，蒸馏水和,PBS,各冲洗,2,次,3min,；,注意时间过长背景加深；新鲜柠檬酸缓冲液；缓冲液足量,微波修复：,pH 6.0,0.1mol,L,柠檬酸缓冲液微波煮沸，切片置于其中，中高档微波处理,15-20min,，室温冷却，蒸馏水和,PBS,各冲洗,2,次,3min,；,蒸汽修复,:,内，盛自来水铝制容器加热至水沸腾,放入含,pH 6.0,0.1mol,L,柠檬酸缓冲液和切片盖容器,.,继续沸腾,10-15min,室温冷却,.,(,强烈推荐,),免疫组织化学技术,第19页,胰蛋白酶消化,：细胞内抗原,0.1%,胰酶溶液（,0.1%,氯化钙,pH7.8,），,37,，,15-30 min,，,PBS,冲洗,3,次,3min,；,胃蛋白酶消化,细胞间质抗原,0.4%,，,37,，,30-180 min,注意,:,酶溶液新鲜配制,;,或分装冻存,;,要预热,提议,：仔细阅读抗体说明书，是否需要进行抗原修复，选择适当抗原修复方法和时间。,单一方法无效,可联合应用,适合于免疫组化双重标识或多重标识,.,免疫组织化学技术,第20页,4.,细胞膜打孔,0.1-0.3,tritonX-100,浸泡，,RT,，,25min,，,PBS,冲洗,3,次,5min,原理,:tritonX-100,为脂溶性去垢剂,注意：检测膜抗原可省略此步骤,使抗体渗透进入细胞方法,（,1,）,Triton X-100,：使细胞膜脂类溶解,（,2,）,Np-40,：使细胞膜蛋白质破环,（,3,）,Saponin,皂苷：使细胞膜胆固醇溶解,免疫组织化学技术,第21页,5.,灭活内源性酶及封闭内源性生物素,（,1,）,灭活内源性过氧化物酶：,3,甲醇,-H,2,O,2,浸泡，,RT,，,30min,，,PBS,冲洗,3,次,5min,；,（,2,）灭活碱性磷酸酶：以每毫升,24mg,左旋咪唑加入底物液中，保持,PH7.6,8.2,。酸性磷酸酶用,0.05M,酒石酸抑制。,（,3,）,灭活内源性生物素：,加生物素阻断剂,A,液（,0.01%,亲和素）,1,滴，,RT,，,10min,，,PBS,冲洗,3,次,2min,；加,B,液（生物素）,1,滴，,RT,，,10,分钟，,PBS,冲洗,3,次,2min,；此步骤适合用于富含生物素组织（如脑和胚胎组织）,免疫组织化学技术,第22页,6.,非免疫血清封闭：,原因：富含正电荷胶原和结缔组织吸附抗体,目标：吸附带正电荷蛋白,操作：与二抗种属相同非免疫血清或,2-5BSA,（牛血清白蛋白），,RT,，,10min,，不洗；,注意,：结合不牢靠，不能冲洗,提议,：可试用不一样动物非免疫血清（尽可能不要与一抗种属相同）,免疫组织化学技术,第23页,7.,加入一抗,4,过夜，或,37,孵育,1-2h,，,PBS,冲洗,3,次,5min,多克隆抗体,兔多抗,价格低，效价高,非特异性反应高，效价不稳定,单克隆抗体,小鼠单抗,大鼠单抗,兔单抗,特异性强，无交叉反应，效价稳定,价格高，效价低,浓缩型抗体,探索效价,市售抗体稀释液，或含1-3%非免疫血清PBS,即用型抗体,无需探索效价,免疫组织化学技术,第24页,8.,加入生物素标识,IgG(,二抗），,RT,10,分钟，,PBS,冲洗,3,次,5min,；,注意：与一抗匹配,9.,加入链霉亲和素,-,生物素,-,辣根过氧化物酶,/,碱性磷酸酶（,SABC-POD,，或,SABC-AP,），,RT,10min,，,PBS,冲洗,4,次,5min,免疫组织化学技术,第25页,10.,AEC,或,DAB,（或,NBT/BCIP,）,显色 显色过程为,2,10min,（镜下监控，,AEC,不能长久保留），蒸馏水或自来水冲洗；,11.AEC,和,NBT/BCIP,显色直接用水溶性封片剂封片。,12.,苏木精复染（,10,秒钟），自来水冲洗返蓝,13.,苏木精染色则经过脱水透明，用中性树胶封片。,14.,镜下检验结果,免疫组织化学技术,第26页,DAB,显色,免疫组织化学技术,第27页,ChAT,免疫组化检测结果,AEC,显色,免疫组织化学技术,第28页,