免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座.pptx

Reading Fun,Sub topics go here,*,免疫荧光技术基本原理,免疫荧光技术是将抗原抗体反应特异性和敏感性与显微示踪准确性相结合一项技术,以荧光素作为标识物，与已知抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特征。然后将荧光素标识抗体作为标准试剂，用于检测和判定未知抗原,在荧光显微镜下，能够直接观察展现特异性荧光抗原抗体复合物及其存在部位。,在实际工作中，因为荧光素标识抗体检验抗原方法较为惯用，所以普通通称为荧光抗体技术,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第1页,荧光产生,物质吸收外界能量进入激发状态，再回到稳定基态时，多出能量会以电磁辐射形式释放，即发出荧光，这类物质被称为荧光素。,由光激发所引发荧光，为光致荧光,荧光免疫技术,由化学反应引发荧光，为化学荧光,化学荧光技术,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第2页,荧光素荧光特征,停顿供能，荧光现象随即终止,对光吸收和荧光发射含有高度选择性 发射光波长,入射光波长,荧光效率：发射荧光光量子数,荧光效率,=,吸收光光量子数,荧光淬灭现象：荧光素辐射能力减弱,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第3页,适当荧光素选择,含有与蛋白质形成共价键化学基团,荧光效率高，标识后下降不显著,荧光与背景色泽对比鲜明,标识后能保持生物学活性和免疫活性,标识方法简单、快速、安全无毒,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第4页,免疫荧光技术主要优缺点,优点：特异性强、敏感性高、速度快,缺点：存在非特异性染色，结果判定客观性不足，技术程序也较复杂,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第5页,依据试验方法分类,直接法,间接法,补体法,其它,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第6页,直接法,将荧光标识特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定温度和时间染色，水洗,-,干燥,-,封片,-,镜检,操作简便、特异性高、非特异性染色少,敏感性低,抗原,标识抗体,荧光,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第7页,间接法,先用已知未标识特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标识抗体（二抗）与其反应，形成抗原,-,抗体,-,抗体复合物，水洗,-,干燥,-,封镜,-,镜检,未知抗原,未标识抗体,标识抗体,荧光,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第8页,补体法,利用补体反应，经过形成抗原,-,抗体,-,补体复合物发射荧光,补体,标识抗补体抗体,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第9页,其它免疫荧光技术,时间分辨荧光免疫分析,荧光偏振免疫分析技术,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第10页,时间分辨荧光免疫测定,利用含有双功效基团结构螯合剂，将镧系元素标识到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，因为镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合成份后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第11页,时间分辨荧光测定特点,采取脉冲光源（每秒闪烁,1000,次以上疝灯），照射样品后即短暂熄灭,以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测镧系荧光。,镧系元素含有较长荧光寿命，延缓测量时间，能有效地消除非特异本底荧光,(10ns),干扰,镧系螯合物激发光与荧光发射峰之间波长差异，有利于排除非特异性荧光干扰，提升检测特异性。,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第12页,荧光偏振免疫分析技术,利用荧光素经单一波长偏振光照射后吸收光能，释放出对应偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比关系而建立免疫分析技术,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第13页,谢谢！,免疫荧光技术的原理分类和应用专家讲座,第14页,