诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一 获奖者介绍,安德鲁法尔(,Andrew Fire,),1959年出生于美国加利福尼亚州圣克拉拉县,1983年获美国麻省理工学院生物学博士学位,现任斯坦福大学斯坦福医学院病理学和遗传学教授,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第1页,克雷格梅洛（,Craig C.Mello,）,1960年 出生于美国,1990年取得哈佛大学生物学博士学位,现任美国哈佛大学马萨诸塞州医学院分子医学教授,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第2页,二,RNAi,机制,1.,RNAi,背景,RNA interference,由双链,RNA,（,Double Strand RNA,简称,dsRNA,）指导，在特定酶参加下，以外源或内源,mRNA,为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生缄默现象,生物界普遍存在一个古老而进化高度保守生物学现象,存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物大多数真核生物中，原核生物暂未发觉,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第3页,2.,RNAi,发觉,1990年，科学家,Rich Jorgensen,将产生紫色素基因置于一个强开启子后导入开紫花矮牵牛中，希望得到紫色更深花，但结果是：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色。当初认为这是导入基因和其相同内源基因同时都被抑制，并将之称为协同抑制,1995年，康奈尔大学,Su Guo,博士在用反义,RNA,阻断线虫基因表示试验中发觉：反义RNA（,anti sense RNA,）和正义RNA（,sense RNA,）都阻断了基因表示,1998年，,Andrew Fire,和,Craig Mello,将反义RNA和正义,RNA,同时注射到秀丽隐杆线虫（,Caenorhabditis elegans,）比单独注射反义RNA诱导基因缄默效率高10倍,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第4页,3.,RNAi,机理,3.1,dsRNA,形成,基因组中,DNA,反向重复序列转录产物,DNA,同时转录了反义RNA和正义RNA相互结合,病毒,RNA,复制中间体,以细胞中单链,RNA,为模板，由细胞或病毒,RNA,在相关酶催化下合成,dsRNA,等,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第5页,3.2,siRNA,(干扰性小,RNA small interfering RNA,，简称,siRNA,)形成,RNaseIII,家族中特异识别双链RNA一员,含有解旋酶活性以及,dsRNA,结合域和,PAZ,结构,3.21核酸内切酶,Dicer,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第6页,（1）dsRNA,在细胞中大量扩增,（2）dsRNA,在细胞中到达一定量时，核酸内切酶,Dicer,识别并与之结合形成酶-,dsRNA,复合体,（3）,核酸内切酶,Dicer 对siRNA,进行切割，产生21-23nt长,dsRNA,小片段，即,siRNA,3.22,siRNA,形成过程,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第7页,3.23,siRNA,特征性结构：,siRNA,序列与所作用靶,mRNA,序列含有同源性,siRNA,两条单链末端为5端磷酸和3端羟基,正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，在每条链3端都有2个不配正确碱基（图1）。,图1,siRNA,示意图,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第8页,3.3,RISC,形成和发挥效应,siRNA,和核糖核酸酶复合物结合，形成,RNA诱导基因缄默复合体,（,RNA-induced silencing complex,简称,RISC,）,3.32,RISC,蛋白成份,内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶、同源,RNA,链搜索活性酶、,Argonaute,等,3.31 RISC,形成,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第9页,Argonaute,有一个月牙型底座由三部分组成，分别为N-端（,amino-terminal,）、中部（,middle,）和,PIWI,区域（,PIWI domain,）。月牙底座上面有一个,PAZ,部分，由茎杆结构支撑。,Argonature,蛋白有一个凹槽贯通整个蛋白，凹槽内壁带正电有利于与,RNA,带负电磷酸骨架结合,3.33,Argonaute,蛋白,RISC,特有成份，被比喻成“切薄片机器”,。,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第10页,图2,siRNA,引导,mRNA,被切割模型,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第11页,(1),RISC,中,siRNA,依赖,ATP,水解释放能量而解旋，双链转变成单链而使复合体被激活，得到活性,RISC,。,(2),siRNA,解旋后，,siRNA,单链3端伸入,PAZ,裂缝中，整个单链沿着,PAZ,伸展开，同时目标片段,mRNA,结合于新月型底座。,siRNA,反义链与,mRNA,互补区域结合，形成双链,(3)在离单链,siRNA,5端9个碱基处,由,RNA,酶切割,mRNA,，阻断,RNA,翻译，到达在,RNA,水平上干扰基因表示效果,3.33 效应阶段,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第12页,紫色,正义RNA段,蓝色,反义RNA段,绿色,目标信使RNA,图4 RNAi原理示意图：,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第13页,siRNA,形成后另外作为一个特殊引物,在,RNA,依赖,RNA,聚合酶（,RNA-dependent RNA polymerase，,简称,RdRp,)作用下以靶,mRNA,为模板合成,dsRNA,后者在,Dicer,酶作用下又可被降解形成新,siRNA,，新生成,siRNA,再进入上述循环,3.34,siRNA,特殊保障机制随机降解性多聚酶链式反应,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第14页,3.5,siRNA,目标位点筛选,(1)在预定缄默,mRNA,中找一段21nt序列，起始是AA,(2)找24个小片段,RNA,，经过,SECs（siRNA expression cassettes，,简称,SECs,）筛选最有效,siRNA,(3)在19nt,RNA,片断中不能含有连续4个T或A区域,(4)经过,BLAST,确定片断特异性；,(5)片断GC%应该在30%50%,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第15页,1.开展基因治疗新路径,一基因家族多个基因含有一段同源性很高保守序列这一特征，设计针对这一区段序列,dsRNA,分子，只注射一个,dsRNA,即能够产生多个基因表示同时降低表现，也可同时注射各种,dsRNA,而将多个序列不相关基因同时剔除。,三,RNAi,应用,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第16页,抗肿瘤治疗,RNAi,可用于抑制癌基因表示,传染性疾病 依据病原体如病毒、细菌等致病基因序列，以及生物体内与疾病发生相关基因序列，设计和制备与这些基因序列有同源序列,dsRNA,，转入动植物内使相关疾病基因“缄默”，从而到达治疗效果。,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第17页,AIDS,治疗 利用,siRNA,抑制病毒再生或传染所需蛋白质生成。优势在于能够不损伤细胞而只抑制病毒蛋白质。,动物试验证实，经过,RNAi,方法使造成血胆固醇升高基因“缄默”。,美国哈佛医学院科学家成功地利用,RNA,干扰技术治愈了试验鼠肝炎。,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第18页,2.功效基因组研究,因为,RNAi,含有高度序列专一性，能够准确地使特定基因缄默，取得功效丧失或降低突变，这么当某一特定基因被“缄默”后，其功效便反向表示出来,RNAi,能够在哺乳动物中降低特异性基因表示，制作各种表型，而且抑制基因表示时间，控制基因表示部位,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第19页,四 未解难题,RNA,干扰在患者体内有效部位进行,是否会影响目标基因以外其它基因，引发副作用,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第20页,Thank You！,诺贝尔医学奖RNA干扰机制专家讲座,第21页,