HIV-2核酸检测.docx

附件3
HIV-2核酸检测
1范围
本附件规定了 HIV-2核酸检测的意义、实验室要求、检测方法、结果判定及质量 控制的要求，适用于具有核酸检测能力的实验室。
2检测的意义
2.1 HIV-2感染诊断
当疑似HIV-2感染、HIV-2抗体确证检测结果为不确定，或者需要区分HIV-1和 HIV-2感染，需要判定是否为HIV-1/HIV-2双重感染时，可以检测HIV-2核酸进行诊 断。
HIV-2前病毒DNA （以下简称DNA）、RNA和总核酸（DNA/RNA）检测结果均可用于 HIV-2感染诊断。HIV-2感染者和艾滋病病人血浆中HIV-2 RNA检出率低，病毒载量水 平也低，例如一个西非的队列研究结果显示，在未接受过抗病毒治疗的HIV-2感染 者和艾滋病病人中，血浆HIV-2病毒载量未检出（＜10 cps/mL）的占46.5%，病毒载量 为 10-1 cps/mL、1-10 cps/mL和＞10 cps/mL的分别占 35.8%、11.7%和6.0%。 因此，建议优先选择检测HIV-2 DNA或总核酸。HIV-2核酸阴性或低于检测限时，不能 排除HIV-2感染。
2.2抗病毒治疗疗效监测
适用于已知HIV-2感染者和艾滋病病人。但因HIV-2 RNA病毒载量水平低，应用价 值有限。
3 实验室要求
同HIV-1核酸检测和HIV-1基因型耐药检测，功能分区根据所用方法和设备的需 要而定。
4检测方法
HIV-2核酸检测包括DNA定性、定量，RNA定性、定量（病毒载量）及总核酸检 测。目前我国还没有HIV-2核酸检测试剂盒获得国家药品监督管理局注册。今后如有 试剂盒获批，使用方法以试剂盒说明书为准。以下介绍一些实验室自建方法，实际工 作中可以根据具体需求选用、调整。
4.1样本
外周血单个核细胞（PBMC）、淋巴细胞富集液和全血等样本可用于HIV-2 DNA或 总核酸检测，血浆样本可用于HIV-2 RNA检测。
4.2核酸提取
根据检测目的，选用不同的商品化试剂盒提取核酸，如总核酸提取试剂盒、DNA 提取试剂盒、RNA提取试剂盒。
4. 3核酸检测
常用的HIV-2核酸检测方法有2类，实时荧光PCR和套式PCR。承担美国HIV-2 核酸检测的两家实验室（美国纽约州卫生局Wadsworth中心和华盛顿大学）均使用实 时荧光PCR，HIV-2特异性靶标均为长末端重复序列（LTR）的保守区但位置不同；法 国ANRS-CO5 HIV-2和ANRS-AC11定量工作组（以下简称ANRS项目组，其中ANRS为 国家艾滋病和病毒性肝炎研究所）也使用实时荧光PCR，但HIV-2特异性靶标为LTR 和gag基因保守区。以上方法均可覆盖HIV-2的A、B流行亚型。国内主要利用套式 PCR扩增HIV-2 LTR和gag等基因的保守区片段，PCR产物经测序、序列比对后进行 HIV-2感染诊断。
4.3.1实时荧光PCR
4.3.1.1美国纽约州卫生局Wadsworth中心建立的方法用于血浆中HIV-2 RNA的定性、 定量检测。血浆样本经RNA提取、逆转录后进行双重实时荧光PCR检测，检测靶标 为HIV-2 LTR保守区并设内对照。HIV-2 LTR目的片段的长度为68bp，引物和TaqMan 探针序列见表1。
4.3.1.2华盛顿大学基于雅培（Abbott）m20平台建立的方法用于血浆中HIV-2 RNA 病毒载量、PBMC中HIV-2总核酸检测。采用双重实时荧光PCR，检测靶标为HIV-2 LTR 保守区并设内对照。HIV-2引物和探针序列见表1。
4.3.1.3法国ANRS项目组建立的方法用于血浆中RNA病毒载量检测及外周血单个核 细胞（PBMC）、淋巴细胞富集液或全血中的DNA定量检测。采用三重实时荧光PCR， 检测靶标为HIV-2 LTR及gag基因的保守区及内对照。HIV-2的引物和探针序列见表
表1 HIV-2实时荧光PCR引物和探针序列
来源及名称序列（5’ -3’）
美国纽约州卫生局Wadsworth中心，靶标为LTR保守区
正向引物 HIV-2F27TTGAGCCCTGGGAGGTTCT
反向引物 HIV-2R94GGTGAGAGTCTAGCAGGGAACAC
探针 HIV-2 P486-FAM-CCAGCACTAGCAGGTAG-MGBNFQ
华盛顿大学，靶标为LTR保守区
正向引物GCGGAGAGGCTGGCAGAT
反向引物GAACACCCAGGCTCTACCTGCTA
探针6-FAM-AGAGAACCTCCCAGG-NFQMGB
法国ANRS项目组，靶标1为LTR保守区
正向引物 Fi2AGCAGGTAGAGCCTGGGTGTT
反向引物 Da2TCTTTAAGCAAGCAAGCGTGG
探针FAM-CTTGGCCGGYRCTGGGCAGA-BHQ1
法国ANRS项目组，靶标2为gag基因区
正向引物 F3GCGCGAGAAACTCCGTCTTG
反向引物 R1TTCGCTGCCCACACAATATGTT
探针 S65GAG2FAM-TAGGTTACGGCCCGGCGGAAAGA-BHQ1 4.3.2 套式 PCR
血浆样本经RNA提取、逆转录后进行PCR扩增，或者外周血单个核细胞（PBMC）、 淋巴细胞富集液、全血样本经DNA或总核酸提取后进行PCR扩增（其中总核酸扩增前 需逆转录）。阳性PCR产物做测序、序列比对，如果序列与HIV-2参考株序列高度同 源，可判定为HIV-2核酸阳性。
中国疾控中心艾防中心设计了针对HIV-2五个基因区片段的引物，所建立的套式 PCR方法用HIV-2/ST株前病毒DNA（提取自入JSP4-27噬菌体克隆）验证有效。其中 扩增HIV-2 LTR和gag基因区片段的引物序列见表2。湖南省疾控中心对2份疑似 HIV-2感染的样本进行RNA提取、逆转录、套式PCR扩增（gag基因区片段）、PCR产 物测序、比对后，诊断为HIV-2感染。
编号序列（5’ -3’）
核苷酸位置
LTR (U3/R)外侧引物
正向引物 LTRACTGAGACTGCAGGGACTTTCCAGAAGGG
反向引物 LTRBAAGCAGAAAGGGTCCTAACAGACCAGGGT
LTR (U3/R)内侧引物，产物长度199bp
正向引物 LTRCAGGCTGGCAGATTGAGCCCTGGGAGGTTC
反向引物 LTRDCCAGGCGGCGACTAGGAGAGATGGGAGCAC
gag (p16/p28 )基因区外侧引物
正向引物 gagAAGGTTACGGCCCGGCGGAAAGAAAA
反向引物 gagB2CCTACCCCCTGACAGGCGGTCAGCATCTCTTC
gag (p16/p28)基因区内侧引物，产物长度839 bp
正向引物 gagC2AGTACAGGCTAAAACATATTGTGTGGGC
反向引物 gagD2CCTCAAGCTTTTGTAGAATCTATCTACATA
9379-9406
9739-9767
9513-9541
9682-9711
603-627
1581-1612
628-655
1437-1466

注：HIV-2核苷酸序列的位置参考HIV-2/ROD株。
5结果判定
5.1商品化试剂盒
如果使用商品化试剂盒，按照试剂盒说明书要求判定结果。
5.2实验室自建方法
5.2.1使用实验室自建的套式PCR方法，根据序列比对结果判定是否为HIV-2核酸阳性。
5.2.2使用实验室自建的实时荧光PCR方法，根据方法确认后的标准判定结果：（1） 定性检测结果判定为HIV-2核酸阳性或阴性，其中的核酸写明DNA、RNA或总核酸；（2） 定量检测结果报告检测值或低于检测限（注明检测限的值）。

由于我国HIV-2感染极为罕见，实验室自建的实时荧光PCR方法所得核酸阳性或 高于检测限的结果不宜直接用于临床诊断。应进一步用套式PCR方法检测，以序列比 对所得的HIV-2核酸阳性结果作为临床诊断的金标准。
6质量控制
实验室自建方法需要做好方法确认，对敏感性和特异性做充分评估、验证。其他
同HIV-1核酸检测和HIV-1基因型耐药检测。
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