表达质粒的构建方法.docx

表达载体的构建方法及步骤
一、载体的选择及如何阅读质粒图谱
目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病 毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：
（1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子 中只有一个复制起始点。而
真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段
（4）P/E启动子僧强子
（5）Terms终止信号
（6）加poly（ A）信号可以起到稳定mRNA 作用
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切 位点。如果构建的目
的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆 载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小（大选大，小选小）。如 <10kb选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭，E.col哺乳类细胞表 达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌， 用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合 蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目 的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒(最常用)做载体的5点要求：
(1) 选分子量小的质粒，即小载体(1 -1.5kb)T不易损坏，在细菌里 面拷贝数也多(也有大载
体)；
(2) 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷 贝，而严谨型质粒＜10个。
(3) 必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
(4) 必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr (试一试)。
(5) 满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记， 是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性(如Puro、G418 )等等。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶 将载体DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。
如何阅读质粒图谱
第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
(1 ) Ampr水解0-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
(2) tetr可以阻止四环素进入细胞。
(3 ) camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
(4) neor (kanr)氨基糖苷磷酸转移酶 使G418 (长那霉素衍生物) 失活
(5 ) hygr使潮霉素。失活。
第三步：看多克隆位点MCS )。它具有多个限制酶的单一切点。便 于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入,会导致某种标 志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的 外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转
化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位 点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与 表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
第六步：启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号
(1 )启动子-促进DNA 转录的DNA序列，这个DNA区域常在基 因或操纵子编码序列的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使 之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
(2) 增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种 具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无 关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子，负调控序 列。
(3) 核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs ) : mRNA 有 核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG (起始密码)和SD序列。
(4) 转录终止序列(终止子)/翻译终止密码子：结构基因的最后一个 外显子中有一个AATAAA 的保守序列，此位点down - stream有一段GT或T 富丰区，这2部分共同构成poly(A )加尾信号。结构基因的最后一个外显子中 有一个AATAAA 的保守序列，此位点down - stream有一段GT或T富丰区， 这2部分共同构成poly ( A )加尾信号。
质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA 链，即质粒是环状双链DNA ,它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因 在另一条链上.根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。
二、目的基因的获得
一般来说，目的基因的获得有三种途径：
调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中 通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得 想要的基因片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还 有不同基因的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都 很难调取到目的基因。
全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接设计合成目的基因。此 方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完 成。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优 化，提高目的基因在宿主内的表达量。
三、克隆构建
目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在 还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体 的步骤。
实验材料
实验试剂

试剂名称
生产厂家
载体 pCDNA3.1
Transheep
大肠杆菌菌株DH5 a
Tiangen
限制性内切酶
Fermentas
T4连接酶
Fermentas
质粒DNA小,大量抽提试剂盒
Axygen
凝胶回收试剂盒
Axygen
琼脂糖
Biowest
DNA ladder
Fermentas

(2) X基因慢病毒载体的构建
X基因 基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57中。
PUC57-X 基因 EcoRI/BamHI 酶切结果：

Lanel :GeneRay 1kb DNA Ladder （从上至下依次为：30bp, 20bp, 15bp, 10bp,
5bp, 250bp,1bp）
Lane2 : PUC57-Neurod1 EcoRI/BamHI酶切产物
酶切完成后进行胶回收 2.载体用PCDNA3.1双酶切，酶切体系如下。
20ul酶切体系37度3小时
4ul
PCDNA3.1 载体（5 ng/ul
1ul
BamHI
1ul
EcoRI
2ul
10xbuffer
12 ul
H2O
酶切完成后胶回收（见附录）

25bp, 20bp, 15bp, 10bp, 750bp, 5bp, 250bp）
Lane2 : pcDNA3.1载体酶切回收产物
处理好的目的片段与载体连接反应体系：
6ulPCR酶切回收片段（约50ng/ul）
1ul酶切好的载体（约50ng/ul）
2ulligase buffer
1ulT4ligase
10ulH2O
以上连接液在16°C过夜。
转化感受态细胞：DH5a）具体步骤见附录转化部分。
抗性：Amp; 3C,培养过夜
转化后X基因分别平板挑菌，37C 250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定 后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。
X基因慢病毒载体单克隆菌落PCR鉴定（使用载体通用引物,PCR条带大小应 比实际大2bp左右）：

Lane1 : GeneRay 1kb DNA Ladder
从上至下依次为：20bp, 15bp, 10bp, 750bp, 5bp, 250bp,1bp)
Lane2-4 : X基因 菌落鉴定PCR产物