HLA基因检测-修改稿.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,长沙能润医学检验所,邓鹏,HLA,基因检测,1,1.HLA,和,HLA,分型检测,2.HLA,分型方法比较,3.,强直柱脊椎炎,Table of Contents,2,1.HLA,和,HLA,分型检测,2.HLA,分型方法比较,3.,强直柱脊椎炎,Table of Contents,3,什么是,HLA,MHC,、,HLA,、亚型、关联,什么是,HLA,分型,I,型，,II,型，,III,型，,IV,型,HLA,分型与疾病检测,骨髓与器官移植，免疫性疾病，代谢性疾病，神经内科疾病，骨科疾病等,基本概念,4,人类白细胞抗原,human leukocyte antigen ,HLA,MHC,Major histocompatibility complex,，,主要组织相容性复合体,（包括,HLA,、,H-2,、,ChLA,、,RhLA,、,DLA,、,SLA,、,RLA,、,GpLA,、,B,等）,5,1940,年代，,Snell,和,Gorer,小鼠间的肿瘤及皮肤移植试验发现：,决定小鼠间移植排斥与否（即,组织相容性,）,的基因位于,17,号染色体短臂,命名为组织相容性,-2,（,H-2,）,H-2,是一个由许多紧密连锁的基因位点构成的复杂系统,6,1950,年代,Dausset,经产妇血清进行,个体之间抗体与白细胞,凝集和细胞毒试验,发现,人的,MHC,，命名为,HLA,基因位于第,6,号染色体短臂,7,1960,年代，,Benacerraf,不同品系的豚鼠对一些抗原的免疫应答能力比较,发现：,控制机体对不同抗原的免疫应答能力的基因（,Ir,基因,）位于,MHC,基因复合体内。,8,Benacerraf,、,Dausset,和,Snell,三位科学家,分别从不同角度对,MHC,的免疫遗传学进行的开拓性研究，,荣膺,1980,年的诺贝尔医学和生理奖。,9,HLA,共分为,4,型：,I,型分子包括,HLA-A,、,HLA-B,和,HLA-C,，广泛存在与各种,组织细胞,中；,II,型分子包括,HLA-DP,、,HLA-DQ,和,HLA-DR,，存在于,B,细胞,、,巨噬细胞,和,活化,T,细胞,中；,III,型分子为,补体系统,，包括,C2,和,C4,位点，存在于,血清,中；,IV,型分子可能是一些,分化抗原,，只存在于,淋巴细胞,、某些,细胞毒性,T,细胞,和,白细胞,中。,HLA,分型,10,HLA,基因系统的多态性及一些主要基因座位的等位基因数,正式命名显示多态性的,HLA,基因座位有,31,个，共,2 320,个等位基因图中所示为常见基因座位的等位基因数。,及一些主要基因座位的等位基因数,正式命名显示多态性的,HLA,基因座位有,31,个，共,2 320,个等位基因。图中所示为常见基因座位的等位基因数。,11,12,HLA,分型的基本检测方法：,细胞学方法测抗原特异性（型）,血清学方法测抗原特异性,（型）,（微量淋巴细胞毒试验）,分子生物学方法测等位基因,PCR/SSP,PCR/Luminex,PCR/SBT,PCR/,二代测序,PCR/,流式细胞仪,13,HLA,抗原和等位基因命名,:,用血清学及细胞学方法检测抗原特异性,:,HLA-B27,HLA-DR4,（血清学方法）,HLA-DPw2,（细胞学方法）用分子生物学方法检测等位基因：,HLA-,DRB1,*,04,05,位点名,主型,等位基因序号,HLA-B,*,27,07,14,例如,H,L,A-B27,H,L,A-B*2701,H,L,A-B*2702,H,L,A-B*2703,H,L,A-B*2704,H,L,A-B*27051,H,L,A-B*27052,H,L,A-B*2706,H,L,A-B*2707,H,L,A-B*2708,H,L,A-B*2709,H,L,A-B*2710,H,L,A-B*2711,.,.,.,H,L,A-B*2723,15,Loci Considered to be Matched,A,C,B,DR,DQDP,4 M bp,Fathers,Mothers,HLA:,无血源相关,10/10,同胞兄妹 单倍型全相合，半相合,父母亲 半相合,16,17,脐血干细胞移植,外周血干细胞移植,骨髓干细胞移植,17,18,常见,HLA,与疾病关联,疾病,HLA,抗原 相对风险,强直性脊椎炎,B27 89.8,Behcet,综合征,B51 10-15,多发性硬化症,DR2 4.8,乳糜泻,DR3 10.8,Grave,s,病,DR3 3.7,系统性红斑狼疮,DR3 5.8,类风关,DR4 4.2,胰岛素依赖型糖尿病,DR3/DR4 25.0,重症肌无力,DR3 2.5,19,小结,HLA,的三个特性使其成为热点：,决定组织相容性,高度多态性,与疾病关联,20,1.HLA,和,HLA,分型检测,2.HLA,分型方法比较,3.,强直柱脊椎炎,Table of Contents,21,HLA,基因分型,低分辨,:SSP,22,rSSO Luminex bead for class I&class II,中等分辨,HLA,分型,23,24,Next generation sequencing,高分辨高通量,HLA,分型,24,Illumina Sequencing by Synthesis(SBS)chemistry,MiSeq,25,Pacific Biosciences-Single-molecule real-time sequencing,26,27,Sequencing based typing(SBT),高等分辨,HLA,分型,27,Sanger,测序原理,28,Sanger,测序原理,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,A,5,3,A,C,G,T,A,C,G,dNTP,ddNTP-Dyes,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,T,G,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,G,C,T,G,A,A,C,A,C,G,T,A,C,G,T,29,Sanger,测序原理,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,A,5,3,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,53,T,G,A,T,A,G,C,T,A,G,T,G,A,A,C,G,T,C,A,G,T,3,5,T,A,T,C,G,C,A,5,3,T,G,C,T,G,A,A,C,30,HLA,分型模板的扩增,Long PCR,(each:HLA-A,-B,-C,-DR,-DQ,DP,MICA),2.Amplicons (PCR:exon+loci),31,Long PCR to amplify the target gene,www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1206614109,32,Assembly and Alignment,33,Problems in sequence assembly,34,Amplicons-HLA Coverage,HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DQB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1,HLA-DRB1,HLA-DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,4.1kb,2.6kb,4.2kb,10.3kb,9.7kb,7.3kb,7.1kb,4.1kb,35,1.HLA,和,HLA,分型检测,2.HLA,分型方法比较,3.,强直柱脊椎炎,Table of Contents,36,37,AS,的病因,基因有关：,HLA-B27,的转基因大鼠成功地培育出强直性脊柱炎的动物模型。目前已发现包括,B27,在内的,3,种基因与此病相关；并且有明显家族发病倾向。,免疫有关：,MHC,，,T-Cells,感染有关：,相关学说认为，来自尿道、前列腺、精囊的抗原经,Batson,循环到达骶髂关节、脊柱和眼睛等部位而发生相关病变，解释了男性好发的原因,。,38,39,AS,的经典检查,体征：,骶髂关节炎检查：“,4”,字试验、骶髂关节压迫试验、髂棘推压试验、骨盆挤压试验,附着点炎检查：坐骨结节、肋软骨、肋胸关节、耻骨联合等压痛,脊柱和胸廓检查：,Schober,试验、指地距、枕墙距、胸廓活动度等,40,骶髂关节,AS,的经典检查,41,B27,测序的,AS,检查,42,HLA-B27,阴性的,AS,约5-10%,的,AS,患者为,HLA-B27,阴性,AS,患者的,HLA-B27,阳性率达,90-95%,我国汉族人群,HLA-B27,阳性率,2-7%,（,3,千万,-1,亿），,AS,患病率为,0.3%,（,4,百万），大部分,HLA-B27,阳性者并不发生,AS,。,HLA-B27,与,AS,43,患病率：,0.3%,，,20-30,岁，男女比例,10:1,，有家族倾向；,主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织）,可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直,B27,检测可作为有相关症状或高危人群,AS,早期的筛选方法！,AS,不是,RA,的一种特殊类型！,强直性脊柱炎,类风湿性关节炎,地区分布,种族差异大,世界性,性别分布,男女,女男,年龄,20-30,30-50,家族史,明显,不明显,类风湿因子,（）,（,）,44,HLA,基因座位的等位基因和真正的疾病易感基因处于紧密连锁不平衡，而,HLA,基因本身并不是引起疾病的真正基因，仅仅是遗传标志。,连锁不平衡学说,分子模拟学说,关节源性肽假说,其他：,T,细胞受体库假说,超抗原假说,B27,修饰因子假说,Cys67,模型,B27,抗原与某些,G,（,-,）菌之间存在类似的分子结构，能发生分子模拟或交叉反应，机体免疫系统把,B27,当作病原体抗原产生免疫应答，对机体产生免疫损害。,认为关节源性肽只存在于关节组织中，特异性地由,HLAB27,提呈，正常情况下递呈水平低，反应,T,细胞处于耐受状态；当某些具有同源结构蛋白的病毒或细菌感染时，则可致敏耐受的,T,细胞，从而识别以低水平递呈的关节源性肽，引起自身免疫反应而损伤组织。,45,长沙能润医学公司的优势,长沙能润医学成立于,2010,年，,专注于：基因资源与基因检测、肿瘤基因研究与转化、免疫细胞治疗和存储。为医疗机构、制药与健康体检公司提供特色精准医学解决方案。,集团旗下拥有以下业务版块：基因检测、细胞治疗、生物培训、生物双创项目投资、精准医疗科研。集团还参股投资了免疫诊断试剂国家工程实验室、国家基因检测技术示范中心、智慧医院工程建设公司燕通生物、海南乐城合家精准医疗医院等机构。与中科院、中南大学湘雅医学院、湖南师大医学院及斯,坦,福、犹他、华盛顿、,UAB,、耶鲁等大学教授合作共建实验室。,在未来，集团将以,“,基因科技服务健康,”,为宗旨，以双创平台为基础，以基因细胞技术系统为主导，系统模块化，模块产品化为策略，整合产、学、研、金、用资源，努力成为杰出的精准医学服务提供商,。,46,公司基因检测实力雄厚，与中南大学湘雅医学院百人计划邹义洲教授长期合作，有,3,台,ABI3730,测序仪，,1,台,Luminex,公司员工,80%,具有硕士及硕士以上学历，具有丰富的基因检测服务经验，已经完成上万个案例。,47,THANKS 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