转录水平检测AFP.ppt

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mRNA,基因表达水平的方法,。,荧光定量,RT-PCR,应用,3,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,一、实时荧光定量,PCR,（,FQ-PCR,）,01,荧光染料,02,荧光共振能量转移,03,PCR,扩增及其监测,04,实时荧光定量,PCR,定量原理,05,实时荧光定量,PCR,优缺点,荧光定量,RT-PCR,应用,4,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,荧光基团通常各有单一的的光吸收峰，荧光基团吸收激发光的能量后通常以,3,种方式释放出能量。,（,1,）,光能,（,2热能,（,3,）,转,移给邻近的分子,01,荧光染料,荧光定量,RT-PCR,应用,5,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，实际相当于将短波长荧光基团释放的,荧光屏蔽（猝灭）,。,02,荧光共振能量转移,荧光定量,RT-PCR,应用,6,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,荧光,PCR,的,独特之处在,于,PCR,过程中,利用荧光染料在激发光下释放的荧光能量的变化直接反应,PCR,扩增产物量的变化。,由于,荧光信号变量与扩增产物变量成正比,，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光进行采集和分析，能够实现对,PCR,过程的检测，,达到对原始模板定量的目的,，主要采用以下数种模式,：,03,PCR,扩增及其监测,01,仿溴乙錠着色监测,02,荧光标记引物,03,荧光标记探针,荧光定量,RT-PCR,应用,7,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,荧光染料（,如,SYBR Green I,）,直接嵌入扩增产物,DNA,双股螺旋链中,，通过对特定方向的强荧光检测或的信号。这种模式能特异性地区分单链、双链,DNA,（只与双链,DNA,结合），缺点是已产生非特异信号，且本底较高。,03,PCR,扩增及其监测,01,仿溴乙錠着色监测,荧光定量,RT-PCR,应用,8,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,04,实时荧光定量,PCR,定量原理,1.,几个基本概念,01,02,03,04,基线,荧光阈值的设定,C,t,值,05,S,型扩增曲线,熔解曲线,荧光定量,RT-PCR,应用,9,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,是指在,PCR,扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。,一般将,PCR,反应前,15,个循环的荧光信号作为,荧光本底信号,（,本地信号是指没有进样时检测器的信号值，与检测器的类型有关，是无论如何也去不掉的值。测试的结果是在本底值之上增加多少的,）,，荧光域值是,PCR3,15,个循环荧光信号标准差的,10,倍，荧光域值设定在,PCR,扩增的指数期。,04,实时荧光定量,PCR,定量原理,基线,荧光阈值的设定,C,代表循环数、,t,代表域值。,C,t,值的含义是：每个反应管内的荧光信号,到达设定的域值,时,所经历的循环数,，而所涉阈值都很低。,C,t,值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没有被放大，所以具有良好的重现性。,C,t,值,1.,几个基本概念,荧光定量,RT-PCR,应用,10,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,PCR,过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所作的,曲线,。,S,型扩增曲线,1.,几个基本概念,04,实时荧光定量,PCR,定量原理,荧光定量,RT-PCR,应用,11,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,判断扩增曲线,是否良好,的指标主要有几个方面：,曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基面平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。,曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。,标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。,各,管的扩增曲线平行型号，表明各反应管的扩增效率相近,。,S,型扩增曲线,荧光定量,RT-PCR,应用,12,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,对,PCR,产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致,大量的产物解链，荧光急剧下降。,利用该特点以及不同,PCR,产物其,Tm,值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同,，可通过此对,PCR,的特异性进行鉴定。,熔解曲线,04,实时荧光定量,PCR,定量原理,1.,几个基本概念,荧光定量,RT-PCR,应用,13,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,C,t,与起始模板量的对数呈反比,，即,Y=-aX+b,，其中,X,为浓度值对数值，,Y,为,C,t,值。,PCR,扩增包含,定量对照,，即引入一系列,已知起始浓度的模板,与,未知,样品同时进行扩增，配合使用,PCR,扩增与荧光检测合二为一的仪器，利用,该系列模板,C,t,值与已知浓度对数,作直线回归得到标准曲线，从而计算出位置样品的起始模板浓度。,这种定量分析,摒弃对,PCR,终产物的测定,，通过监测,PCR,过程中荧光强度的连续变化，用,准确表征,PCR,对数增长规律的,C,t,值进行循环实时分析,。,04,实时荧光定量,PCR,定量原理,2.,标准曲线绘制,荧光定量,RT-PCR,应用,14,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数呈反比。,研究表明，每个模板的,C,t,值与,该模板的,起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，,C,t,值越小。,利用,已知起始拷贝数的标准品,可做出标准曲线：,横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表,C,t,值。,因此，,只要获得位置样品的,C,t,值，即可从标准曲线上计算出该样品的,起始拷贝数,（起始拷贝数就是指某基因,(,可以是质粒,),在某一生物的基因组中的个数,.,单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个,多则指有多个）。,04,实时荧光定量,PCR,定量原理,2.,标准曲线绘制,荧光定量,RT-PCR,应用,15,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,荧光,PCR,融汇了,PCR,的灵敏性、,DNA,杂交的特异性和光谱技术的定量精确性,，具有以下的优点：,05,实时荧光定量,PCR,优缺点,优点,1,）,封闭反应，直接探测,PCR,过程中的变化以获得定量的结果，污染因素少，且无需,PCR,后处理,。,2,）,灵敏度高，假阳性率低，荧光标记探针的最大优点在于其特异性非常强，避免了非特异性扩增造成的假阳性信号,。,3,）,采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确,。,7,）,操作安全快速,4,）,定量范围宽，可达到,10,个数量级,。,5,）,计算机同步跟踪，数据化自动处理，在线实时监测，结果直观，避免人为判断,。,8,）,利与自动化和联网管理,6,）,效率高，可用多种商品画荧光物质，如,TET,、,FAM,、,HEX,、,JOE,等作为报告荧光（,3,端的猝灭基团常用,TAMRA,），实现一管双检或多检,。,荧光定量,RT-PCR,应用,16,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,扩增的循环数越靠后，定量的重复性越差,，可能有以下主要原因,：,1),荧光定量技术要求在低分子浓度环境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立起来的。如果分子浓度过高，影响作用复杂，而,PCR,扩增产物时高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。,2),由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。,05,实时荧光定量,PCR,优缺点,缺点,荧光定量,RT-PCR,应用,17,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,二、,TaKaRa One Step SYBR QRT-PCR,试剂盒,荧光定量,RT-PCR,应用,18,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,01,制品内容,荧光定量,RT-PCR,应用,19,实验步骤及可能结果,实验原理,实验目的,原理：,本制品利用反转录酶,PrimeScript RTase,将,RNA,反转录成,cDNA,，在以,cDNA,为模板利用,TaKaRaEx Taq HS,在同一反应管内连续进行,RT-PCR,扩增反应（利用,SYBR GreenI,嵌合荧光法,）。采用如图所示的,One Step RT-PCR,方法，反转录以总,RNA,为模板，利用反应引物合成,cDNA,，在以此为模板，利用引物进行,PCR,扩增反应。,01,制品原理,荧光定量,RT-PCR,应用,20,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,荧光定量,RT-PCR,应用,21,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,荧光定量,RT-PCR,应用,22,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,荧光定量,RT-PCR,应用,23,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,荧光定量,RT-PCR,应用,24,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,应用生物信息学知识,从基因库中查阅出,AFP,的,DNA,和,mRNA,序列。,根据引物设计原则,并利用,Primer Express 2.0,设计软件,设计出扩增,AFP mRNA,基因片段的上下游引物和探针。,PCR,实验成功的最关键环节就是引物的设计。,3,引物、探针的设计和合成,荧光定量,RT-PCR,应用,25,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,用上述提取的的总,RNA,进行逆转录,PCR,。,反应体系,:,主要包含上下游引物、各种酶、底物、模板和,Mg,2+,5,种物质。现在以,TaKaRa One Step SYBR QRT-PCR,试剂盒,为例作为整个反应体系。,反应条件,:,针对不同的引物，设定最佳的退火温度是,QRT-PCR,反应顺利进行的关键。,具体反应程序,包括反转录、预变性、变形、退火、延伸等。所有过程的反应温度和作用时间均应经过筛选确定最佳反应条件。具体反应条件的参考值见表,1,，可在参考值范围内加减选择最佳条件。,根据,扩增片断长度,扩增产物用,不同浓度的,琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下割取特异性的条带,用,QIAquick Gel Extraction Kit(,德国,Qiagen,公司,),试剂盒（用于纯化,DNA,）,进行纯化。,4,RT-PCR,扩增,AFP mRNA,荧光定量,RT-PCR,应用,26,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,用,RNase Free dH,2,O,（用于溶解难溶于水的,RNA,）,将总,RNA,稀释到,0.2,g/,l,，作为浓度最高的模板（,2,0,1,号）。然后取,11,个容量为,150,l,的离心管（,212,号），分别加入,10,lRNase Free dH,2,O,。从,1,号管中取,10,l,加到,2,号管中，稀释倍数为,1,。,以此类推，如图所示，将,1,号主机,2,倍稀释成，,2,-1,、,2,-2,、,2,-3,、,2,-4,、,2,-5,、,2,-6,、,2,-7,、,2,-8,、,2,-9,、,2,-10,、,2,-11,，用于标准曲线的制作。,5,标准曲线的制作,荧光定量,RT-PCR,应用,27,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,将倍比稀释的总,RNA,作为,QRT-PCR,标准曲线的模板，应用确定的最佳反应条件，进行实时荧光定量,PCR,扩增，系统根据荧光值的变化规律生成标准动力学曲线、熔解曲线、和标准回归曲线。,5,标准曲线的制作,荧光定量,RT-PCR,应用,28,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,熔解曲线上应该有且只有一个明显的峰，扩增产物的,Tm,值须非常均一，表明没有产生非特异性扩增产物及引物二聚体。,5,标准曲线的制作,荧光定量,RT-PCR,应用,29,5,标准曲线的制作,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,荧光定量,RT-PCR,应用,30,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,制作出最后的标准曲线之后，就建立了检测,AFP,表达的方法。,要检测细胞中,AFP,是否异常表达，即可选取待检测的细胞重复前面的步骤最后通过电脑得出该细胞,RNA,的,C,t,值，在标准曲线上得出它的起始拷贝数，根据此数据来判断是否异常表达。,6,检测,细胞,AFP,是否异常表达,荧光定量,RT-PCR,应用,31,荧光定量,RT-PCR,应用,实验目的,实验步骤及可能结果,实验原理,6,实验出现的可能结果,32,实验目的,实验原理,实验步骤及可能结果,荧光定量,RT-PCR,应用,主要包括病原微生物检测、病原体检测、基因病诊断、传染病检测和病变检测等。,分子生物学上,RT-PCR,应用相当广泛，包括基因转录检测（同一基因在不同组织的表达差异，如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时期的表达差异等。,SNP,分析及深入应用。,临床、食品及环境应用,分子生物学应用,遗传学应用,33,谢,谢,欣,赏,34,