转录组测序原理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,转录组测序技术原理,1,转录本,All transcripts,All mRNAs,2,主要内容,样品检测,文库制备,Cluster Station,Illumina,Sequencing,生物信息分析,3,Total RNA样品检测,Agilent 2100 检测,OD260/280:1.82.2,RNA 28S:18S,1.0;RIN7,4,检测报告,-合格样品,5,检测报告,-不合格样品,6,主要内容,样品检测,文库制备,Cluster Station,Illumina,Sequencing,生物信息分析,7,第一天,消化,DNA,mRNA的分离,mRNA的打断,cDNA的合成,第二天,末端修复,加接头,胶回收,3端加A,第三天,PCR,PCR胶回收,文库制备,8,真核,mRNA,的纯化,mRNA的纯化主要通过磁珠吸附原理从而分离纯化,Oligo（dT）,25,磁珠纯化原理主要是,mRNA的3的poly A与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。,mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。,9,原核,mRNA,的纯化,Ambion MICROExpress Kit,10,mRNA反转录,纯化过的,mRNA样品加入1 l的fragment buffer 70作用1.5min。,加入,1l的stop buffer终止反应。,加入沉淀剂（,NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀酶切产物。,11,末端修复,cDNA 3末端加A,Adapter连接,12,不同方法比较,13,主要内容,样品检测,文库制备,Cluster Station,Illumina,Sequencing,生物信息分析,14,主要内容,样品检测,文库制备,Cluster Station,Illumina,Sequencing,生物信息分析,15,新一代测序技术,Read Length,Run Time,Output,135 bp,1.5 days,26-35 Gb,235 bp,4 days,75-100 Gb,2100 bp,8 days,150-200 Gb,Throughput:up to 25 Gb per day,C,T,A,G,C,T,A,5-,3-,-5,G,T,合成第一个碱基,Cycle 1:按顺序加入反应试剂,清除未反应的碱基和试剂,激发碱基荧光并收集荧光信号,去除阻断基团和荧光基团,Cycle 2-n:重复前面的步骤,G,T,C,T,A,G,T,C,T,G,C,T,A,G,A,基于,SBS测序技术,17,OH,Flow Cell接头,diol,P7,P5,diol,diol,模板杂交,diol,diol,延长,diol,diol,变性,碱基片段杂交,18,Cluster station,剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”,(bridge),。,形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。,双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应。,反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“,DNA簇群”。,19,主要内容,样品检测,文库制备,Cluster Station,Illumina,Sequencing,生物信息分析,20,生物信息分析,21,基本信息分析,数据量产出：,2Gb per sample,测序策略：,HiSeq2000,PE91,or 101,插入片段大小：,200 bps,测序质量控制：,Q20%80,22,有参考基因组序列生物信息分析,基因结构优化,鉴定基因可变剪接,预测新转录本,SNP,分析,基因融合鉴定,23,有参考基因组序列信息分析流程,24,Reads 在基因组上的分布,25,基因结构优化,(Nagalakshmi,U.et al.,2008),通过转录组测序鉴定出酵母3 和5 UTR区域,26,鉴定基因可变剪接,exon1,exon2,exon3,exon1,exon2,exon3,exon1,exon3,common reads,junction reads,mRNA,27,鉴定融合基因,28,新转录本预测,Genomic intergenic region,Reads,cluster,Paired Reads,distribution,Paired-End(PE)Reads,29,N Eng J Med,2009,SNP分析,30,Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome,Genome Res,2010,Rice Transcriptome,Material,callus,root at seedling stage,（,14d）,shoot at seedling stage,（,14d）,flag leaves,（,2 stages）,panicle,（,3 stages）,Methods,RNASeq,（,paired-end&single end）,DGE,small RNA,（,18-30 nt）,基因功能注释,基因结构分析,鉴定出大量新转录本,可变剪接鉴定,基因融合鉴定,31,无参考基因组生物信息分析,Unigene功能注释,Unigene的GO分类,Unigene代谢通路分析,预测编码蛋白框（CDS）,Unigene表达差异分析,Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway富集性分析,32,De novo,reads组装流程,33,U,nigene,GO 分类,34,U,nigene,COG 功能分类,35,基因表达差异分析,N1:total tag Number in sample A,N2:total tag Number in sample B,X:Gene expression level in sample A,y:Gene expression level in sample B,Reference:,Audic S.et al.The significance of digital gene expression profiles.,Genome Res.,1997 7(10):986-995,36,U,nigene,pathway 富集性分析,37,Pathway富集性分析列表,38,39,Thank you,40,