生物化学实验Folin-Wu法定量测定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Folin-Wu法,定量测定血糖的含量,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,1,1.氧化供能,2.人体的主要组成成分之一,糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等,3.糖代谢紊乱供能障碍一系列代谢变化,糖的重要生理功能,：,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,2,血糖及血糖水平的概念：,血糖：,指血液中的单糖：葡萄糖,血糖水平：,血浆中葡萄糖浓度,血糖总维持在恒定水平：,3.9,6.7mmol/L,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,3,血糖的来源和去路,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,4,血糖测定的目的和意义,临床：,血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。,科研：,在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。,调节血糖水平的激素：,胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。,血糖水平异常：,高血糖及糖尿病；低血糖,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,5,高血糖症：,指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。,糖尿病：,是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,6,症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L,或空腹血浆葡萄糖 7.0mmol/L。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。,糖尿病典型的症状是“三多一少”,，,即多饮,、,多尿、多食及消瘦,糖尿病的诊断标准,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,7,血糖的测定方法,测定方法,酶法：,（1）己糖激酶法（HK）,（2）葡萄糖氧化酶法（GOD法）,特异性高，灵敏度高，干扰因素少,，,适用于自动化分析，为葡萄糖测定的,参考方法,，,但是试剂较贵,无机化学法：,Folin-Wu法，特异性差,有机化学法：,邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法,干扰因素多,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,8,掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。,学会制备无蛋白血滤液。,掌握7200型可见分光光度计的使用方法。,一,、,目的要求,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,9,二、实验原理,葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基,，,Cu,2+,即被葡萄糖还原成Cu,Cu,2,O）而沉淀。,Cu,2+,(CuSO,4,)+葡萄糖 Cu,+,（Cu,2,O）,无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应,Cu,2,O又把酸性钼酸试剂（Mo,6+,）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝。,Cu,2,O+酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD,420,比色,血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu,2,O成正比，而Cu,2,O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,10,三、实验仪器,1、25mL血糖管3支；2、血糖管橡胶塞3个；,3、,沸水浴小锅,1,个,；,4、100mL锥形瓶2个；,5,、电炉1个；6,、滤纸1盒；,7,、吸耳球2个；,8,、7200型分光光度计1台;,血糖管,7200型分光光度计,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,11,1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）,(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。,(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。,2、10%钨酸钠溶液：,称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。,3、0.33mol/LH,2,SO,4,溶液：,于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。,4、碱性硫酸铜溶液,A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.,B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。,临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。,四、实验试剂,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,12,5、酸性钼酸盐溶液：,称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。,置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。,四、实验试剂,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,13,1、无蛋白血滤液的制备,：,用,5ml移液管,吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓,放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。,再加0.33mol/L H,2,SO,4,1ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为,暗棕色,（如不变色可再加0.33mol/L H,2,SO,4,1-2滴）。,用,干滤纸,过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血五、实验步骤,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,14,2、血糖的定量测定：,取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。,然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动,，各加4ml酸性钼酸盐溶液。,一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,15,按下式计算100ml全血中所含血糖的含量,m=A,1,/A,0,C,0,0.1,100,式中:,m,=100ml全血中含血糖毫克数;,C,0,=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）,；,A,1,=样品液光吸收值;,A,0,=标准液光吸收值,0.1,：1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血,六、结果计算：,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,16,七、思考题,实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？,实验中，血糖管有什么作用？,实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,17,注意事项,：,1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀,2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入10硫酸1-2滴，待暗棕色后再过滤。,3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,18,五、实验步骤,1、无蛋白血滤液的制备,：,蒸馏水7ml,摇匀,10%钨酸钠1ml,摇匀,0.33mol/L H,2,SO,4,1ml,边加边摇,加毕充分摇匀,放置515分(沉淀变为暗棕色),(如不变色,再加0.33mol/L H,2,SO,4,12滴,),干滤纸过滤,无蛋白血滤液(每毫升相当于1/10ml全血),20ml锥形瓶,溶血(变为红色透明),用,5ml移液管,取全血1ml,（已加抗凝剂,2、血糖的定量测定：,m=OD1/OD2 C 10 100,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,19,分光光度计的工作原理,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,20,朗伯-比尔定律,朗伯定律,：A=k,1,L,比尔定律,：A=k,2,C,朗伯-比尔定律,：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。,A=KLC,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,21,朗伯-比尔定律应用,A,标,=KC,标,L,A,样,=KC,样,L,标准品法测定未知样品含量,C,样,=,A,样,A,标,C,标,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,22,7200型分光光度计的操作程序,连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。,接通电源，使仪器预热20分钟。,用键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。,用波长选择旋钮设置您所需的分析波长,。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,23,将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。,将0T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0T”键，此时显示器显示“000.0”,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,24,按 MODE键选择A模式,将参比样品拉入光路中，按“0A/100T”键调0A/100T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。,当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,25,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,26,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,27,分光光度计的使用注意事项:,比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。,装样前处理：自来水反复冲洗蒸馏水漂洗2次待装溶液漂洗2次。,用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,28,拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”。,光面,毛面,若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，以保证吸光度测量不受影响。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,29,比色皿内盛液应为其容量的2/3，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。,容量的2/3,比色皿的光面要与光源在一条线上。,光透过窗口,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,30,