沙门菌检验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,GB,4789.42010食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验,1,沙门菌,概况,沙门菌是,1885,年由,Salmon,氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于,Salmon,氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。,沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有,2500,多个血清型和变种。我国自,1911,年至,90,年代初已有,255,个血清型。,2,虽然沙门菌的血清型很多，但多数国家从人体、动物和食品中分离出沙门菌仅约,4050,个血清型。而在一个国家中的一定时期只约有,10,个血清型是比较常见的。,分类：,伤寒沙门菌,(,伤寒、副伤寒,)-,传染病防治法中规定报告的乙类传染病。,非伤寒沙门菌,-,食品卫生标准的检测的主要对象。,3,沙门菌的生物学特性,形态与染色性：,革兰氏阴性杆菌，无芽胞,一般无荚膜。,除鸡瘟沙门菌（,S.pullorum,),和鸡沙门菌,(,S.gallinarum,),外均有动力。为周身鞭毛，并多数有菌毛。,大小：,13um,0.51um,。,4,营养需求不高，需氧或兼性厌氧。普通营养培养基上均能生长，能够利用柠檬酸盐作为碳源。,在普通肠道选择性平板上基本上形成无色菌落。菌落中等大小，半透明，表面光滑，边缘整齐或呈锯齿状。,不分解乳糖，大部分菌株产,H,2,S,，发酵葡萄糖产酸不产气。,培养与生化特性,5,最适培养温度为,37,，最适,pH 7.2,7.6,。,耐受胆盐，在粪便、土壤、食品、水中可生存,5,个月至二年之久。,6,沙门菌的分布,沙门菌广泛存在于自然环境中。,通过沙门菌病患者或健康带菌的人和动物的排泄物污染环境和食品。,易于污染的高危食物：畜禽肉类、蛋、奶及其制品。,沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常没有感官性状的改变。,7,沙门氏菌检验程序,8,目的：修复损伤的细菌细胞；,方法：,25 g,（,mL,）样品,225 mL BPW,的无菌均质杯中，以,8 000 r/min,10 000 r/min,均质,1 min,2 min,，或置于盛有,225 mL BPW,的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打,1 min,2 min,。若样品为液态，,不需要均质，振荡混匀。,如使用均质袋，可直接,进行培养。于,36 1,培养,8 h,18h,。,前增菌,9,无菌均质袋,10,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取,1 mL,转种于,10 mL TTB,内,于,42 1,培养,18,24 h,。同时,另取,1 mL,转种于,10 mL SC,内,于,36 1,培养,18,24 h,。,分别用接种环取增菌液,1,环,划线接种于一个,BS,琼脂平板和一个,XLD,琼脂平板（或,HE,琼脂平板或显色培养基平板）。于,36 1,分别培养,18,24 h(XLD,琼脂平板、,HE,琼脂平板、显色培养基平板,),或,40 h,48 h(BS,琼脂平板,),，观察各个平板上生长的菌落。,为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。,选择性增菌与分离,11,分离培养基回收率测定（,%,）,进口,-SS,65.3,进口,-,SS,81.0,国产,-SS,52.0,进口,-HE,83.2,国产,-HE,80.0,进口,-XLD,83.0,国产,-XLD,86.2,进口,-BS,106.6,国产,-BS,77.7,CHRO,显色,68.4,国产,-DHL,98.4,国产,-WS,71.6,TSA,（对照）,100.0,12,典型菌落,-BS,菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。,国产,BS,进口,BS,13,典型菌落,-HE,国产,HE,进口,HE,蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。,14,典型菌落,-XLD,进口,XLD,国产,XLD,菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，,或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心,15,典型菌落,-CHRO,菌落为紫红色,16,初筛微生物,菌落颜色,特异性灵敏度,沙门氏菌,紫色,(,直径约,1mm),89,100%,柠檬酸杆菌属,蓝色,(,直径约,1mm),-,变形杆菌,无色或被抑制,-,(,铜绿假单胞菌也呈紫红色，可以通过前增菌排除。所以推荐在检测中的前增菌用,TTB,。,粉红色、深红色、干燥菌落、边缘锯齿状等 均非沙门氏菌菌落。）,17,生化试验,自选择性琼脂平板上分别挑取,2,个,以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（,TSI,）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。,接种针在接种,TSI,后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于,36,培养,18,24 h,，必要时可延长至,48 h,。,18,穿刺TSI方法,19,接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水,(,供做靛基质试验,),、尿素琼脂,(pH7.2),、氰化钾,(KCN),培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于,36 1,培养,18 h,24 h,必要时可延长至,48 h,。,将已挑菌落的平板储存于,2,5,或室温至少保留,24 h,，以备必要时复查。,20,沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果,三糖铁琼脂,赖氨酸脱羧酶试验培养基,初步判断,斜面,底层,产气,硫化氢,-,+,（）,（）,可疑沙门氏菌属,-,+,（）,（）,可疑沙门氏菌属,+,+,（）,（）,可疑沙门氏菌属,+,+,/,/,非沙门氏菌,注：阳性，阴性；（）多数阳性,少数阴性；,/,阳性或阴性。,该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。,21,TSI,的反应 赖氨酸脱羧酶试验,22,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,反应序号,硫化氢,（,H,2,S,）,靛基质,pH7.2,尿素,氰化钾,（,KCN,）,赖氨酸脱羧酶,A1,A2,A3,/,注：阳性；阴性；,/,阳性或阴性。,反应序号,A1,：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、,KCN,和赖氨酸脱羧酶,3,项中有,1,项异常,按下表可判定为沙门氏菌。如有,2,项异常为非沙门氏菌。,23,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,pH7.2,尿素,氰化钾,(KCN),赖氨酸脱羧酶,判,定,结,果,甲型副伤寒沙门氏菌,(,要求血清学鉴定结果,),沙门氏菌,或,(,要求符合本群生化特性,),沙门氏菌,个别变体,(,要求血清学鉴定结果,),注：表示阳性；表示阴性。,反应序号,2,：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性；,反应序号,3,：补做,ONPG,，,ONPG,阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。,24,沙门氏菌属各生化群的鉴别,必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定,项,目,卫矛醇,山梨醇,水杨苷,ONPG,丙二酸盐,KCN,注：表示阳性,;,表示阴性。,25,沙门菌的增菌培养基,缓冲蛋白胨水,(BPW),肉汤：是基础增菌培养基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙门菌复苏。使受损伤的沙门菌细胞恢复到稳定的生理状态。一般用于加工食品或冷冻食品的前增菌。,26,沙门菌的增菌液,四硫磺酸钠煌绿增菌液,(TTB),：含有胆盐，抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与付伤寒沙门菌仍能生长。,亚硒酸盐胱氨酸增菌液（,SC,）：可对伤寒及其他沙门菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。,27,沙门菌的分离培养基,亚硫酸铋琼脂（,BS,）：含有煌绿、亚硫酸铋能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门菌的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用时配制，超过,48h,不宜使用。,注：此培养基在制作过程中过分加热可使培养基的选择性降低，与,TTB,或,SC,合用可获得更高的检出率。,28,沙门菌的分离培养基,HE,琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加入了一些抑制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏阴性的肠道致病菌则无抑制作用。,沙门菌在,HE,琼脂上的菌落形态：蓝绿色或蓝色，多数菌株产,H,2,S,，中心呈黑色或几乎全黑色。,29,沙门菌的分离培养基,XLD,琼脂：培养基中含有去氧胆酸钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑制剂，而不影响沙门菌属和志贺菌属的生长。,XLD,培养基分离沙门菌和志贺菌的敏感性超过了传统的培养基，如：,EMB,、,SS,、,BS,。因这些培养基尚有抑制志贺菌属生长的潜在因素，故本培养基是分离鉴定沙门菌及志贺菌属的可靠培养基。在国外广泛使用。,30,分离培养中的注意要点,非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。,HE,和,XLD,琼脂：非典型的沙门氏菌在,HE,和,XLD,琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。,HE,和,XLD,平板经,242,小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取,2,个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。,31,BS,琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果,BS,平板培养,242,小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养,242,小时。如果经,482,小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取,2,个或更多个非典型的菌落。,32,沙门菌显色培养基,沙门菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门菌。其基本原理：利用沙门菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门菌在培养基上呈紫色或紫红色。而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈蓝绿色。,色原,-,特定结合物,色原特定结合物,沙门菌辛酸脂酶,无色,显色,游离,33,可疑菌落的生化鉴定,自选择性琼脂平板（至少,2,种选择性平板）上直接挑取,2,个以上可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂,(TSI),。,TSI,的主要成分：蛋白胨、乳糖、蔗糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠、酚红、琼脂在,TSI,琼脂中有,2,个指示剂体系：,-,酚红,:,在碱性环境中呈红色；在酸性环境中呈黄色。,-,硫酸亚铁铵：是硫化氢的指示剂，可与硫化氢反应生成硫化铁呈黑色。硫代硫酸钠可防止硫化氢氧化形成,S-S,基而影响反应。,34,沙门菌在,TSI,琼脂上的反应,斜面,底层,产气,H,2,S,可能的菌属和种,+,+/,+,沙门菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌,+,+,+/,+,沙门菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌,+,伤寒沙门菌、鸡沙门菌、志贺菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属,+,+,沙门菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属,+,+,+/,非沙门菌,35,赖氨酸脱羧酶试验,赖氨酸脱羧酶试验培养基：蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、溴麝香草酚蓝（紫）。,原理：细菌使氨基酸脱羧，产生胺类，使培养基变碱，颜色不改变。,沙门菌的反应：阳性。,意义：柠檬酸杆菌、志贺菌 均为阴 性；埃希氏菌不定。,注：本试验的阳性反应为培养基不改变颜色,而培养基变黄色者为阴性反应。本试验一定要设空白对照。培养基需用液体石蜡封盖，阻止空气的氧化作用。,36,靛基质试验,靛基质试验的培养基：蛋白胨水。,原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸，生成靛基质，与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。,沙门菌的反应：阴性反应或阳性（靛基质阳性变种）。,37,尿素酶试验,尿素培养基：蛋白胨、葡萄糖、酚红、氯化钠、磷酸二氢钾、尿素，,pH7.2,。,原理：含尿素酶细菌能分解尿素，产生大量的氨，使培养基呈碱性，指示剂变红。,沙门菌的反应：阴性。,38,氰化钾试验,氰化钾试验培养基：蛋白胨、磷酸盐缓冲对、氯化钠、氰化钾。,原理：氰化钾是剧毒药物，可抑制某些细菌的呼吸酶系统，使这些酶失去活性，细菌的生长因此受到抑制。而某些细菌可对氰化钾产生抗性，能在氰化钾培养中生长。本试验常用于沙门菌与柠檬酸杆菌的鉴定。,沙门菌生长情况：阴性（不生长）。,注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为阴性。若对照管与试验管均无细菌生长则应重复试验。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低细菌生长，呈假阳性反应。,39,沙门菌生化鉴定培养基,-,半乳糖苷酶,(,ONPG,),试验,-,半乳糖苷,(ONPG),培养基：蛋白胨、,ONPG,。,原理：大肠杆菌含有,-,半乳糖苷酶，能分解,ONPG,，使培养基呈黄色。,沙门菌的反应：阴性。,注：本试验主要用于不产,H2S,的沙门菌与大肠杆菌的判定,40,沙门菌生化鉴定的主要试验项目,糖发酵试验：三糖铁琼脂,(,葡萄糖、乳糖、蔗糖,),、甘露醇、山梨醇、卫茅醇、水杨苷、,ONPG,。,氨基酸和蛋白质代谢试验：靛基质、赖氨酸脱羧酶、尿素酶。,碳源和氮源利用试验：丙二酸盐。,其他生化试验：氰化钾。,41,沙门菌在,API 20E,的典型反应,第,1,位数,第,2,位数,第,3,位数,第,4,位数,第,5,位数,第,6,位数,第,7,位数,结果判定,ON,P,G,ADH,L,DC,ODC,C,I,T,H2S,URE,T,D,A,IND,VP,GEL,GLU,MAN,INO,S,O,R,RHA,SAC,ME,L,AMY,ARA,OX,1 2 4,1 2 4,1 2 4,1 2 4,1 2 4,1 2 4,1 2 4,反应结果,-+,+,-,-+,+,+-+,-+-,沙门菌,应得树值,0 2 4,1 2 4,0 0 0,0 0 4,1 2 4,1 0 4,0 2 0,组合编码,6,7,0,4,7,5,2,42,VITEK GNI,43,沙门菌的血清学鉴定,培养基：一般使用,1.5%,的琼脂斜面作纯培养，取培养物,(,抗原,),作玻片凝集试验。,国内使用的沙门菌,O,抗原多价诊断血清：,A-F,多价诊断血清。,44,血清学鉴定时的注意要点：,做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。,O,血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高,(,如,2.53%),的斜面上，再做凝集。,如果由于,Vi,抗原的存在而阻止了,O,抗原的凝集反应时，应挑取菌苔于,1mL,生理盐水中做成菌悬液。煮沸后再检查。,(,常见于伤寒沙门菌,),。,当二相沙门菌只检出一相,H,抗原时，可在琼脂斜面上移种,12,代后再检查，如仍只检出一相,H,抗原，可用位相变异的方法诱导另一相。,45,谢谢大家,!,46,