沙门氏菌的检测鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,沙门氏菌的检测及鉴定,杨淑霞,1,设备和材料,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：,2.1 冰箱：2 5。,2.2 恒温培养箱：36 1，42 1。,2.3 均质器。,2.4 振荡器。,2.5 电子天平：感量0.1 g。,2.6 无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL。,2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。,2.8 无菌培养皿：直径90 mm。,2.9 无菌试管：3 mm50 mm、10 mm75 mm。,2.10 无菌毛细管。,2.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。,2.12 全自动微生物生化鉴定系统。,2,3 培养基和试剂,3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）。,3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。,3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。,3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂。,3.5 HE琼脂：见附录A中A.5。,3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。,3.7 沙门氏菌属显色培养基。,3.8 三糖铁（TSI）琼脂。,3.9 蛋白胨水、靛基质试剂。,3.10 尿素琼脂（pH 7.2）。,3.11 氰化钾 （KCN）培养基。,3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基。,3.13 糖发酵管。,3.14 邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）培养基。,3.15 半固体琼脂,。,3.16 丙二酸钠培养基,。,3.17 沙门氏菌O和H诊断血清。,3.18 生化鉴定试剂盒。,3,A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）,A.1.1成分,蛋白胨10.0 g,氯化钠5.0 g,磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.20.2,A.1.2 制法,将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121，15 min。,4,A.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液,A.2.1基础液,蛋白胨10.0 g,、,牛肉膏5.0 g,、,氯化钠3.0 g,碳酸钙45.0 g,、,蒸馏水1 000 mL,、,pH 7.00.2,除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121，20 min。,A.2.2硫代硫酸钠溶液,硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0 g,，,馏水 加至100 mL,，,高压灭菌121，20 min。,A.2.3碘溶液,碘 片20.0 g,、,碘化钾25.0 g,、,蒸馏水 加至100 mL,，,将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。,A.2.4 0.5煌绿水溶液,煌绿0.5 g,、,蒸馏水100 mL,溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。,A.2.5牛胆盐溶液,牛胆盐10.0 g,，,蒸馏水100 mL加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121，20 min。,A.2.6 制法,基础液900 mL,、,硫代硫酸钠溶液100 mL,、,碘溶液20.0 mL,、,煌绿水溶液2.0 mL,牛胆盐溶液50.0 mL,临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。,5,A.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液,A.3.1成分,蛋白胨5.0 g,乳糖4.0 g,磷酸氢二钠10.0 g,亚硒酸氢钠4.0 g,L-胱氨酸0.01 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.00.2,A.3.2 制法,除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55 以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1 g/L L-胱氨酸溶液10 mL（称取0.1 g L-胱氨酸，加1 mol/L氢氧化钠溶液15 mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100 mL即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。,6,A.4 亚硫酸铋（BS）琼脂,A.4.1成分,蛋白胨10.0 g,牛肉膏5.0 g,葡萄糖5.0 g,硫酸亚铁0.3 g,磷酸氢二钠4.0 g,煌 绿0.025 g或5.0gL水溶液5.0mL,柠檬酸铋铵2.0 g,亚硫酸钠6.0 g,琼 脂18.0 g20 g蒸馏水1 000 mL,pH 7.50.2,A.4.2 制法,将前三种成分加入300 mL蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20 mL和30 mL蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20 mL和30 mL蒸馏水中，琼脂加入600 mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80 左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50 55。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。,注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48 h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。,7,注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48 h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。,A.5 HE 琼脂（Hektoen Enteric Agar）,A.5.1成分,蛋白胨 12.0 g 牛肉膏3.0 g,乳糖12.0 g,蔗糖12.0 g,水杨素 2.0 g 胆盐20.0 g,氯化钠5.0 g,琼脂18.0 g20.0 g,蒸馏水1 000 mL,0.4溴麝香草酚蓝溶液16.0 mL,Andrade指示剂20.0 mL,甲液20.0 mL,乙液20.0 mL,pH 750.2,8,A.5.2 制法,将前面七种成分溶解于400 mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600 mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50 55 倾注平皿。,注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。,甲液的配制,硫代硫酸钠34.0 g,柠檬酸铁铵4.0 g,蒸馏水100 mL,乙液的配制,去氧胆酸钠 10.0 g 蒸馏水 100 mL Andrade 指示剂酸性复红 0.5 g 1mol/L氢氧化钠溶液 16.0 mL 蒸馏水 100 mL 将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1 mL2 mL。,9,6、,木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂,A.6.1成分,酵母膏3.0 g,L-赖氨酸5.0 g,木糖3.75 g,乳糖7.5 g,蔗糖7.5 g,去氧胆酸钠2.5 g,柠檬酸铁铵0.8 g,硫代硫酸钠6.8 g,氯化钠5.0 g,琼脂15.0 g,酚红0.08 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.40.2,A.6.2制法,除酚红和琼脂外，将其他成分加入400 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50 55 倾注平皿。,注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。,10,A.7 三糖铁（TSI）琼脂,A.7.1成分,蛋白胨20.0 g,牛肉膏5.0 g,乳 糖10.0 g,蔗 糖10.0 g,葡萄糖1.0 g,硫酸亚铁铵（含6个结晶水）0.2 g,酚 红0.025 g或5.0 g/L溶液5.0 mL,氯化钠5.0 g,硫代硫酸钠0.2 g,琼 脂12.0 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.40.2,A.7.2 制法,除酚红和琼脂外，将其他成分加入400 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。,将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2 mL4 mL，高压灭菌121 10 min或115 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。,11,A.8 蛋白胨水、靛基质试剂,A.8.1 蛋白胨水,蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水1 000 mL,pH 7.40.2,将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121 高压灭菌15 min。,A.8.2 靛基质试剂,A.8.2.1 柯凡克试剂：将5 g对二甲氨基甲醛溶解于75 mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25 mL。,A.8.2.2 欧-波试剂：将1 g对二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20 mL。,A.8.3 试验方法,挑取小量培养物接种,在36 1 培养1 d2 d，必要时可培养4 d5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。,注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。,12,9 尿素琼脂（pH 7.2）,A.9.1成分,蛋白胨1.0 g,氯化钠5.0 g,葡萄糖1.0 g,磷酸二氢钾2.0 g,0.4酚 红3.0 mL,琼 脂20.0 g,蒸馏水1 000 mL,20%尿素溶液 100 mL pH720.2,A.9.2制法,除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入400 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。,将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121 高压灭菌15 min。冷至50 55,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2。分装于无菌试管内，放成斜面备用。,A.9.3试验方法,挑取琼脂培养物接种,在36 1 培养24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。,13,.10 氰化钾（KCN）培养基,A.10.1成分,蛋白胨10.0 g,氯化钠5.0 g,磷酸二氢钾0.225 g,磷酸氢二钠5.64 g,蒸馏水1 000 mL,0.5氰化钾20.0 mL,A.10.2 制法,将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121 高压灭菌15 min。放在冰箱内使其充分冷却。每100 mL培养基加入0.5氰化钾溶液2.0 mL（最后浓度为1:10 000），分装于无菌试管内,每管约4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4 冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。,A.10.3 试验方法,将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36 1 培养1 d2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2 d细菌不生长为阴性（抑制）。,注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。,14,A.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基,A.11.1成分,蛋白胨5.0 g,酵母浸膏3.0 g,葡萄糖1.0 g,蒸馏水1 000 mL,1.6溴甲酚紫-乙醇溶液1.0 mL,L-赖氨酸或DL-赖氨酸 0.5 g/100 mL或1.0 g/100 mL,pH 6.80.2,A.11.2制法,除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100 mL，分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5加入，DL-赖氨酸按1加入。调节pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管0.5 mL，上面滴加一层液体石蜡，115 高压灭菌10 min。,A.11.3试验方法,从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36 1 培养18 h24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。,15,A.12 糖发酵管,A.12.1成分,牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化钠3.0 g,磷酸氢二钠（含12个结晶水）2.0 g,0.2溴麝香草酚蓝溶液12.0 mL,蒸馏水1 000 mL,pH 7.40.2,A.12.2 制法,A.12.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节pH。按0.5加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121 高压灭菌15 min。,A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100 mL，121 高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10溶液，同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。,注：蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。,A.12.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36 1 培养,一般2 d3 d。迟缓反应需观察14 d30 d。,16,A.13 ONPG 培养基,A.13.1 成分,邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）,（O-Nitrophenyl-D-galactopyranoside）,60.0 mg,0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）10.0 mL,1蛋白胨水（pH7.5）30.0 mL A.13.2制法,将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5 mL，用橡皮塞塞紧。,A.13.3试验方法,自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36 1 培养1 h3 h和24 h观察结果。如果-半乳糖苷酶产生，则于1 h3 h变黄色，如无此酶则24 h不变色。,17,A.14 半固体琼脂,A.14.1成分,牛肉膏0.3 g,蛋白胨1.0 g,氯化钠0.5 g,琼脂0.35g0.4 g,蒸馏水100 mL,pH 7.40.2,A.14.2 制法,按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH。分装小试管。121 高压灭菌15 min。直立凝固备用。,注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。,18,A.15 丙二酸钠培养基,A.15.1成分,酵母浸膏1.0 g,硫酸铵 2.0 g 磷酸氢二钾 0.6 g,磷酸二氢钾 0.4 g,氯化钠 2.0 g 丙二酸钠 3.0 g,0.2溴麝香草酚蓝溶液12.0 mL,蒸馏水1 000 mL,pH 6.80.2,A.15.2制法,除指示剂以外的成分溶解于水调节pH，再加入指示剂，分装试管，121 高压灭菌15 min。,A.15.3试验方法,用新鲜的琼脂培养物接种，于36 1 培养48 h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。,19,4 检验程序,20,5 操作步骤,5.1 前增菌,称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW的无菌均质杯中，以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min，或置于盛有225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或HCl调pH 至6.80.2。,无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 1 培养8 h18h。,如为冷冻产品,应在45 以下不超过15 min,或2 5 不超过18 h解冻,5.2 增菌,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB 内，于421 培养18 h24 h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC内，于36 1 培养18 h24 h。,21,5.3 分离,22,23,24,25,26,5.5 血清学鉴定,5.5.1 抗原的准备,一般采用1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。,O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如23）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.550.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.30.4半固体琼脂的小玻管1次2次，自远端取菌培养后再检查。,5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定,在玻片上划出2个约1 cm2 cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。,5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定,同5.5.2。,27,5.5.4 血清学分型（选做项目）,5.5.4.1 O 抗原的鉴定,用AF多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。,被AF多价O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。,不被AF多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：,O多价1 A，B，C，D，E，F，群 （并包括6,14群）,O多价2 13，16，17，18，21群,O多价3 28，30，35，38，39群,O多价4 40，41，42，43群,O多价5 44，45，47，48群,O多价6 50，51，52，53群,O多价7 55，56，57，58群,O多价8 59，60，61，62群,O多价9 63，65，66，67群,28,29,不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的H,因子如下：,H多价1 a，b，c，d，i,H多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51,H多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40,H多价4 1,2；1,5；1,6；1,7；z6,H多价5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38,H多价6 z39，z41，z42，z44,H多价7 z52，z53，z54，z55,H多价8 z56，z57，z60，z61，z62,每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可在琼脂斜面上移种12代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。,30,位相变异试验方法如下：,小玻管法：将半固体管（每管约1 mL2 mL）在酒精灯上溶化并冷至50，取已知相的H因子血清0.05 mL0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1：2001：800的量加入。小倒管法：将两端开口的小玻管 （下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1软琼脂斜面，于37 培养后再做凝集试验。简易平板法：将0.350.4半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。,31,5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定,用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林,沙门氏菌。,5.5.4.4 菌型的判定,根据血清学分型鉴定的结果，按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。,6 结果与报告,综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。,32,提,问,答疑,Question and answer,Question and answer,33,谢谢大家！,作者：杨淑霞,微博：,霞日里的阳光,THANKS,34,