慢性排斥患者移植肾组织中细胞因子的表达.doc

慢性排斥患者移植肾组织中细胞因子的表达（全面版）资料

慢性排斥患者移植肾组织中细胞因子的表达

关键词　肾移植　排斥反应　细胞免疫
　　慢性排斥反应(慢排)移植肾中细胞免疫的确切机制尚不清楚，多数学者一致认为浸润的各种免疫细胞起关键性作用。已证明粘附分子ICAM-1，VCAM-1在介导特异性白细胞粘附到内皮细胞作用的同时，也在白细胞—内皮细胞迁移、侵入方面发挥重要作用；其在正常人类肾脏和实验动物肾脏上均有表达，且已在用抗细胞粘附分子(CAMS)单克隆抗体治疗移植物排斥反应方面取得一定进展，且TNF-α是单核巨噬细胞系来源的细胞因子，在炎症免疫反应中充当重要角色；而IL-2通过与IL-2R相互作用，更是在免疫反应过程中起中枢作用，而IL-2R表达是免疫系统特别是巨噬细胞活化的重要标志；B7－1是T细胞活化过程中不可缺少的第二信使，通过B7-1／CD28协同刺激通道在排斥反应中发挥重要作用。本文拟在对慢排移植肾组织活检的基础上，研究ICAM-1，VCAM-1，TNF-α，IL-2R及B7－1分子的原位表达，初步探讨移植肾慢性排斥反应的细胞免疫机制。
1　材料和方法
1．1　材料　本组包括临床(症状+检查)和病理（参照Banff标准）均证实为慢排的肾活检组织共26例，5例因配型结果不佳而弃用的供肾作为正常对照，所有慢排标本经肾tru-cut针活检穿刺获取，经OCT包埋，液氮保存。
1．2　免疫组化技术　液氮保存的肾活检组织行冰冻切片（5μm），室温下空气干燥，密封保存于－70℃低温冰箱中备用，丙酮固定，以抗人ICAM-1 VCAM-1单抗及TNF-α，CD25，B7－1单抗，采用ABC法检测肾组织中相应抗原，DAB显色(或ACE)，苏木素复染，镜下观察，每例均设阴性对照。
1．3　结果分析　肾组织内所有结构均行ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、IL-2R及B7－1观察，至少10个视野，根据肾内阳性细胞数计分，（－）无阳性细胞；（＋）散在阳性细胞；（）中等数量阳性细胞；（）大量阳性细胞。
2　结果
2．1　病理改变特征　本研究中，经临床诊断为移植肾慢排的26例患者，组织切片HE染色，均可观察到不同程度慢排的病理改变特征：包括肾血管、肾小球、肾间质与肾小管等诸方面的变化，最常见的病理改变特点为移植肾细小动脉壁增厚，较严重病例可见累及叶间动脉和弓状动脉；动脉内膜纤维组织增生，间质成纤维细胞进入内膜。在不同的慢排病例中肾小球的病变程度不同，其中包括GBM增生，系膜区基质增生，局灶节段性肾小球硬化，萎缩；而肾间质变化主要是间质细胞浸润及纤维化，小管萎缩。
2．2　粘附分子，细胞因子及协同刺激因子在慢排移植肾组织中的原位表达（见附表）
附表　ICAM-1，VCAM-1，TNF-α，IL-2R，B7－1在慢排移植肾组织中的原位表达

ICAM-1
VCAM-1
TNF-α
IL-2R
B7－1
慢排组
n＝26
正常组
n＝5
慢排组
n＝26
正常组
n＝5
慢排组
n＝26
正常组
n＝5
慢排组
n＝26
正常组
n＝5
慢排组
n＝26
正常组
n＝5
肾小球
／
＋／
－／＋
－／＋
－／＋
－／＋
－／＋
－／＋
－／＋
－／＋
肾小管
－／＋
－／＋
＋／
－／＋
－／＋
－／＋
－／＋
－／＋
＋／
－／＋
肾间质
＋／
－／＋
＋／
－／＋
＋／
－／＋
＋／
－／＋
－／＋
－／＋

2．2．1　ICAM-1表达　同正常肾脏相比，肾小球部分壁层上皮细胞及其间质ICAM-1表达增强，在部分近曲小管上皮细胞及微动脉，小动脉内皮细胞上ICAM-1也有部分表达。
2．2．2　VCAM-1表达　VCAM-1在慢排肾组织中表达比正常肾脏更为广泛，肾间质及微动脉、小动脉内皮细胞上有VCAM-1表达，且染色有不同程度的增强。此外，ICAM-1和VCAM-1在间质炎症区域和小管损伤的部位有更加集中的表达；但在少数缺乏活动性炎症仅表现为间质纤维化的慢排移植肾中ICAM-1有所增强，但VCAM-1几乎不表达。
2．2．3　TNF-α表达　在慢排移植肾中表达明显增强，主要见于肾间质浸润细胞。
2．2．4　IL-2R表达　慢排移植肾中IL-2R表达明显增强，亦主要分布于肾间质浸润细胞。
2．2．5　B7－1表达　B7－1在慢排肾组织中主要表达于肾小管上皮细胞，肾小球毛细血管丛，管周毛细血管内皮细胞，而其它部位B7－1表达甚少。
3　讨论
　　本研究探讨慢排的细胞免疫机制，对26例慢排移植肾活检组织中粘附分子，细胞因子及协同刺激因子原位表达进行检测，表明在慢排移植肾组织不同结构中其表达异常，ICAM-1增强表达于肾小球及肾间质小血管，伴周围淋巴细胞浸润；而VCAM-1则在肾小管及其间质内表达增强，在肾小球中无表达。已证明ICAM-1和VCAM1在介导特异性白细胞粘附到内皮细胞作用的同时，也在白细胞—内皮细胞迁移、侵入方面发挥重要作用［1］。故我们有理由认为，ICAM-1在慢排肾脏肾小球及间质小血管内皮细胞的炎性细胞免疫攻击中起重要作用；而小管损伤可能有VCAM-1的参与。进一步我们观察到ICAM-1和VCAM-1在间质炎症区域和小管损伤部位有更加集中的表达，从而支持了上述观点。
　　TNF-α主要由活化的巨噬细胞／单核细胞和淋巴细胞产生；而IL-2R表达则是活化巨噬细胞的标志［2，3］，二者在肾间质浸润细胞表达增强，提示慢排肾组织中浸润炎细胞（T淋巴细胞，巨噬细胞）处于活化状态，在移植免疫中起重要作用，已有人用细胞培养的方法证实细胞因子TNF-α、IFN-γ等刺激激活的肾小管上皮细胞合成ICAM-1［4］，故可以推测在慢排中粘附分子同细胞因子间作用息息相关，共同参与细胞免疫排斥反应，在我们的实验中，我们观察到在慢排肾脏中肾间质ICAM-1，VCAM-1与TNF-α同时出现表达增强，推测有可能它们共同参与间质炎性损伤；有文献报道TNF-α可能作用于血管内皮细胞，引起内皮细胞损伤［5］，而在慢排中的作用，有待进一步探讨。在实验中我们注意到同TNF-α一样，IL-2R在肾间质中染色增强，表明活化的巨噬细胞参与了间质炎症。
　　在我们的观察中B7－1主要表达于肾小管上皮细胞、少许肾小球毛细血管丛及管周毛细血管内皮细胞上，我们认为在慢排中，一方面通过自身的抗原产生针对内皮细胞的特异性抗体，引起一系列损害；而另一方面内皮细胞以抗原呈递细胞的身份通过表达B7－1产生协同刺激信号，对T细胞的活化是必不可少的前提条件。VCAM-1与B7－1在慢排肾脏中的表达分布相类似，共同表达于肾小管。它们之间有何关联需进一步研究。
　　小结　本研究通过26例慢排移植肾组织活检，用免疫组化技术证明在人类慢排移植肾组织中粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达有不同程度增强，浸润淋巴细胞和巨噬细胞原位表达TNF-α和IL-2R明显增强；B7－1表达在肾小管上增强，这些资料进一步支持细胞免疫在慢排发病机制中起重要作用。
作者单位：西安医科大学第一临床医学院肾移植科（西安，710061）
参考文献
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（1999-08-02收稿，1999-09-28修回）

慢波睡眠的激素与细胞因子调节

摘要　慢波睡眠(SWS)是最重要的睡眠成分。近年来的研究揭示：腹外侧视前区-结节乳头核(VLPO-TMN)可能是睡眠-觉醒的中枢发生部位。基底前脑吻端前列腺素D2（PGD2）敏感性睡眠促进区(PGD2-SPZ)参与睡眠的调控。PGD2延长SWS；前列腺素E2（PGE2）延长觉醒，抑制SWS和快动眼睡眠(REMS)。SWS与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的活动呈负相关，与生长激素的分泌呈正相关。褪黑素(melatonin)对SWS的影响与其降低体温的效应有关。白细胞介素1(IL-1）促进SWS的作用可能通过PGD2介导。5-HT参与肿瘤坏死因子延长SWS的作用。睡眠-觉醒机制的研究进展提示，开发新型选择性延长SWS的药物，可以从以下几方面入手：PGD2激动剂；免疫增强剂或免疫调节剂；影响5-HT系统的药物；褪黑素及生长激素等睡眠的生理性调节物质等。
关键词　慢波睡眠；前列腺素D2；前列腺素E2；激素；细胞因子
学科分类号　R338.63
Regulation of SWS by Hormones and Cytokines
LI Li-Hua,KU Bao-Shan
(Department of Pharmacology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
Abstract　SWS is the most important component of sleep.(1) VLPO-TMN seems to generate sleep and wakefulness.The rostral basal forebrain,which was defined as PGD2-SPZ,may be involved in regulation of sleep.(2) PGD2 promotes sleep,especially SWS,while PGE2 prolongs wakefulness and depresses both SWS and REMS.(3) During SWS the activation of hypothalamus-pituitary-adrenocortic axis is inhibited,while the release of growth hormone is accelerated.The soporific effects of melatonin may be attributed to its hypothermic effects.(4) Interleukin-1 prolongs sleep,especially SWS,which seems to be mediated by PGD2.Tumor necrosis factor (TFN) may promote SWS through 5-HT and its receptor.Therefore,the development of new hypnotics,which selectively prolong SWS,might follow the following ways: PGD2 and chemicals which act like PGD2; immuno-regulators; substances with effects on 5-HT receptors; hormone,such as melatonin and growth hormone,which play roles in the physiological regulation on sleep-wakefulness.
Key words　Slow wave sleep; PGD2; PGE2; Hormone; Cytokine
　　1992年作者曾提出“慢波睡眠（slow wave sleep,SWS）是最重要的睡眠成分，寻找增加SWS的药物是催眠药物开发的重要内容”的构想［1］。当时提出这一构想的基本根椐是：SWS是大脑皮层睡眠；剥夺睡眠两天后，恢复睡眠的第一夜主要是SWS反跳，可达这一夜全部睡眠量的50％（成年人正常约为20％左右）； 正常短睡眠（4～5小时/昼夜）者，与普通睡眠（7～9小时/昼夜）者相比，SWS的百分比明显要高（前者50％以上，后者15%～20%），绝对时间也较长；SWS期间生长激素分泌达到峰值；某些严重的神经、精神疾患如焦虑、抑郁、老年性痴呆等均有SWS的减少或消失。在提出以上构想的当时，有关增加SWS物质的报道尚不多。此后我们一直密切注意着这一领域的动态，现将近年来一些有意义的进展追踪报道如下。
一、睡眠-觉醒的中枢调节机构
　　结节乳头核（tuberomammillary nucleus，TMN）的组胺能神经元发出轴索构成组胺能上行觉醒系统，在觉醒期间保持紧张性活动，SWS期间活动减少，REMS期间停止放电。反之，腹外侧视前区（ventrolateral preoptic，VLPO）神经元在清醒时放电频率较低，在REMS和非快动眼睡眠（NREMS）时增至两倍。已知VLPO神经元对TMN存在着GABA能神经支配［2］。睡眠期间下丘脑后部的γ-氨基丁酸（GABA）含量增加；电刺激VLPO可引发GABAA受体中介的TMN神经元抑制；GABA可使TMN神经元超极化和放电频率减少；向TMN内注入GABA激动剂可使视前区毁损的动物恢复睡眠。以上研究揭示，VLPO(GABA能神经元)-TMN(组胺能神经元)调控着睡眠-觉醒过程。

　　基底前脑吻端被称为“PGD2敏感性睡眠促进区（PGD2-sensitive sleep-promoting zone，PGD2-SPZ）”。在此区的蛛网膜下腔内灌注PGD2后，NREMS增加，同时VLPO有强烈的Fos表达，其强度与动物处死前的睡眠量呈正相关，而TMN的Fos表达强度则与睡眠量呈负相关［3］。由此可见，基底前脑(PGD2受体介导的神经元) 与VLPO-TMN有联系，也参与睡眠-觉醒的调节。至于不同的睡眠时相，如SWS期或REMS期，上述中枢核团或脑区之间Fos表达的差异尚未见报道。
　　PGD2受体的mRNA广泛分布于软脑膜，未见于脑实质内。PGD2灌流下丘脑后部并未促进睡眠，提示PGD2未直接抑制TMN觉醒神经元的活动。向大鼠PGD2-SPZ内灌注PGD2，下丘脑处的软脑膜Fos表达最为强烈。那么，从PGD2激动软脑膜上的受体到VLPO神经元活动增强之间的信号转导又是怎样的呢？Satoh等［4］将选择性腺苷A2a受体激动剂CGS21680注入PGD2-SPZ的蛛网膜下腔，SWS和REMS呈剂量依赖性增加。预先给予腺苷A2受体拮抗剂KF17837，可取消CGS21680的效应，也可取消向此区的蛛网膜下腔内注入PGD2诱发SWS的效应。提示腺苷A2受体可能中介了软脑膜PGD2受体与VLPO-TMN之间的信号转导。
　　与PGD2促进睡眠相反，PGE2则参与觉醒。哺乳动物下丘脑可产生PGE2。向大鼠脑室内或下丘脑注入PGE2可明显延长觉醒，抑制SWS和REMS。室旁核（paraventricular nucleus,PVN）和下丘脑腹内侧（ventromedial hypothalamus,VMH）可能参与睡眠-觉醒的调控。用放免分析方法测量PVN和VMN之间脑区的微透析液中的PGE2，发现清醒时含量最高，REMS时次之，SWS期间PGE2含量最低［5］。
二、激素与睡眠调节
　　夜间激素分泌与睡眠之间存在相关性。夜间睡眠的早期SWS占优势，此期也是一天当中下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（hypothalamus-pituitary-adrenocortic axis,HPA轴）分泌活动显著受抑，体内促皮质激素（ACTH）和考的松浓度最低的时期。睡眠早期特别是SWS期间，垂体-肾上腺应答受到抑制，确切原因还不清楚，可能是其它激素抑制了促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）的分泌，或下丘脑分泌了某种未知的ACTH抑制因子。夜间睡眠的后半期是REMS占优势的时期，也是一天之中HPA分泌活动最活跃的时期。生长激素释放激素（GHRH）与CRF之间的平衡，在生理和病理性睡眠调节中发挥重要作用。GHRH增加健康青年人的SWS，促进生长激素的释放，抑制考的松的释放；CRF的作用则相反。向大鼠脑室内注入CRF可剂量依赖性地缩短NREMS和REMS，延长觉醒将IL-1与CRF先后（间隔10分钟）注入脑室内，CRF可取消IL-1延长NREMS和缩短REMS的效应，提示IL-1刺激产生的CRF可能作为一种负反馈机制，抑制IL-1的中枢及外周效应［6］。
　　褪黑素（melatonin）是松果体分泌的光信号激素，在调节动物的昼夜节律和季节节律以及机体睡眠-觉醒节律方面发挥重要的作用。正常情况下,体温与睡眠按同步节律变化，睡眠期间体温下降，觉醒后体温开始缓慢回升，活动状态时达最高值。正常状态下,人体日间褪黑素水平低于检测限。日间应用褪黑素可使体温降低0.3～0.4℃。夜间给予明亮光线刺激可抑制褪黑素的分泌，使体温升高，继而给予外源性褪黑素，可逆转上述体温的变化［7］。夜间给予可抑制褪黑素分泌的强度的光线，可致夜间睡眠量减少。外源性褪黑素对动物和人均具有快速催眠作用［8］。以上研究结果提示，内源性褪黑素可能通过降低体温参与正常睡眠的维持。Van Den Heuvel 等［9］发现夜间（19∶00）给予β肾上腺素受体阻断剂阿替洛尔，可使青年受试者尿中褪黑素代谢产物6s-aMT显著减少，体温升高，总的觉醒时间延长，入睡困难，睡眠之间觉醒次数增加，REMS和SWS均缩短；给予褪黑素能逆转以上效应，使之恢复到对照水平。阿替洛尔引起的青年受试者睡眠结构和质量的变化非常类似于老年人的睡眠障碍。早在1986年已证实与年龄有关的褪黑素量的下降，与夜间体温偏高之间存在相关性。褪黑素的年龄相关性下降可能是老年人睡眠质量下降，睡眠障碍增多的原因之一。适当利用褪黑素，可以改善老年人及经常面临时差变化或昼夜交替工作的人的睡眠质量。
三、细胞因子IL-1、TNF对睡眠-觉醒的影响
　　（一）IL-1对睡眠-觉醒的影响　微生物感染、组织损伤等会导致机体代谢、免疫、内分泌、中枢神经系统进入应激状态，表现出发热、免疫功能增强、嗜睡等现象。IL-1作为一种具有多种生物学功能的细胞因子，在炎症反应、免疫反应中发挥着重要的作用，是神经-内分泌-免疫三大系统的共同语言信号。体内巨噬细胞是IL-1的主要来源，还有其它多种细胞也可以产生IL-1，如神经胶质细胞等。本研究室发现，许多免疫增强剂及免疫调节剂具有调节睡眠时相，改善睡眠质量的作用。异丙肌苷、转移因子、胞壁酰二肽等免疫增强剂在使脑内IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)分泌增加的同时，也延长了家兔的睡眠时间［10］；应用免疫抑制剂环磷酰胺降低家兔免疫功能的同时，可明显抑制SWS。IL-1的产量与睡眠有关，在SWS期间活性达峰值，在睡眠剥夺期间产量增多［11］。外源性IL-1可在兔、大鼠、猫、猴等动物诱发睡眠，尤其是SWS［12］。IL-1受体拮抗剂或抗IL-1抗体在抑制内源性IL-1活性的同时，可抑制兔的自发睡眠，还可抑制睡眠剥夺后“反跳现象”的出现［13，14］。
　　IL-1与PGs有许多共同的生物学效应，如诱导发热和厌食，激活交感神经系统和下丘脑-垂体-肾上腺系统。IL-1灌流PGD2-SPZ的蛛网膜下腔时SWS显著增加，这种效应可被同时灌流的非选择性环氧酶（cyclooxygenase，COX）抑制剂双氯芬酸(diclofenac)阻断，或被预先给予的选择性COX-2抑制剂吡罗夕康(piroxicam)阻断［15］，提示IL-1促进SWS的作用可能是通过PGD2介导的。值得一提的是，IL-1影响睡眠的作用部位（PGD2-SPZ），与其引起发热和厌食症的作用部位是分离的（后者在邻近第三脑室的区域内）。
　　（二）TNF及5-HT对睡眠-觉醒的影响　TNF参与炎症反应及免疫反应。巨噬细胞淋巴细胞以及中枢的星形胶质细胞均可产生TNF。我们以前的研究已证实，TNF经静脉注射或脑室内注入均可延长家兔睡眠时间，其中以SWS为主。TNF促进大鼠、小鼠脑内5-HT的合成，提高5-HT及其代谢产物5-HIAA的含量，这可能是它促进SWS的机制［16］。
　　5-HT参与多种生理功能的调节，如体温调节、情绪活动、痛觉等，对睡眠-觉醒的调节作用已被多项研究证实。中缝核是5-HT神经元密集的核团，电损毁中缝核可导致动物失眠，给予此区适当的电刺激可使清醒动物立刻进入睡眠状态。应用PCPA阻断脑内5-HT的合成，可导致失眠。口服5-HT前体5-HTP后，脑内5-HT含量增加，促进睡眠。5-HT通过不同的受体亚型发挥对睡眠的调节作用。我室对大鼠的研究（药理学通报待发表）发现，5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT小剂量时（0.01mg/kg,s.c.）减少觉醒，延长NREMS(包括SWS)；大剂量（0.375mg/kg）时使觉醒时间延长，NREMS（包括SWS）和REMS均缩短。这个结果与国外报道一致。我们还发现，选择性5-HT2受体拮抗剂利坦色林(ratanserin)（0.63mg／kg i.p.）不影响觉醒及浅睡眠，而是特异性地增加SWS并减少REMS。脑室内注入5,7-DHT，选择性地毁损突触前5-HT1A自身受体（somatodendritic autoreceptor），可抑制小剂量8-OH-DPAT延长SWS和缩短觉醒时间的效应，对大剂量8-OH-DPAT缩短SWS和延长觉醒的作用则无明显影响。一般认为小剂量时8-OH-DPAT 选择性激动了突触前5-HT1A自身受体，通过自身调节抑制突触的神经传导［17］，大剂量时则激动突触后受体。5-HT1A受体部分激动剂丁螺环酮(buspirone)和吉吡隆(gepirone)皮下注射使大鼠觉醒时间延长，各睡眠成分均缩短。 5,7-DHT未能影响它们对于睡眠-觉醒的效应，提示这两种药物可能是激动了突触后的5-HT1A受体。β肾上腺素受体拮抗剂pindolol可阻断突触前后的5-HT1A／1B受体，有效地拮抗丁螺环酮和吉吡隆延长觉醒时间、缩短NREMS的作用，对两药缩短REMS的作用则无影响［18］。选择性5-HT3受体激动剂m-chorophenylbiguanide注入大鼠侧脑室后，增加觉醒时间，缩短REMS和SWS，多巴胺D1和D2受体拮抗剂可抑制这种效应。
　　5-HT各受体亚型对睡眠-觉醒的影响可总结如下：激动突触前5-HT1A自身受体可延长NREMS(包括SWS)，减少觉醒，对REMS无明显影响；激动突触后5-HT1A受体可抑制睡眠（包括REMS和SWS），促进觉醒；拮抗5-HT2受体可促进SWS，抑制REMS；激动5-HT3受体可减少REMS和SWS，促进觉醒。以上研究提示SWS与REMS通过不同途径（5-HT受体亚型）分别受到复杂而精细的调控。我们发现联合给予小剂量5-HT1A自身受体激动剂8-OH-DPAT（0.01mg/kg s.c.）和5-HT2A受体拮抗剂利坦色林（0.63mg／kg i.p.）显示出协同效应，觉醒和REMS显著减少，SWS和浅睡眠的比例显著增加（药理学通报，待发表）。
四、催眠药物开发的切入点
　　临床上常用的镇静催眠药物或多或少均缩短SWS和REMS，延长浅睡眠。这些药物虽然延长了总的睡眠时间，却损害了两种最重要的睡眠成分SWS和REMS(后者保持固定的比例最为重要［1］），并未真正改善睡眠质量，从而不可避免会出现头晕、乏力、困倦、注意力不集中，甚至暂时性健忘(如安定类)和宿醉现象(如长效巴比妥类)。突然停药时会出现REMS的反跳现象，如焦虑不安、失眠、多梦、恶梦等。根据以上研究进展，开发选择性延长SWS的催眠药物，也许以下几个方面可以做为切入点：
　　（一）PGD2激动剂　包括PGD2前体物质、能够促进PGD2产生的物质和可能影响COX活性的物质。
　　（二）免疫增强剂或免疫调节剂　许多药物，特别是具有扶正固本作用的中药，具有不同程度的免疫增强和调节作用，其中有些药物成分临床已经证实可改善睡眠。
　　（三）影响5-HT系统的药物　不同5-HT受体亚型的选择性激动或拮抗，对睡眠各成分产生复杂的影响。目前已合成多种选择性作用于不同亚型的化学物质，从中筛选可延长SWS的物质进行定向研究将是一条重要途径。
　　（四）褪黑素、生长激素等参与睡眠调节的物质　这些生理性物质参与睡眠及其它生理过程，外源性给予尤其适用于那些因此类物质匮乏而引起的睡眠障碍。
李利华(北京医科大学药理学系，北京　100083)
库宝善(北京医科大学药理学系，北京　100083)
参考文献

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利肾口服液拮抗细胞因子对系膜细胞影响的研究

    提要　探讨利肾口服液治疗系膜细胞增殖型肾炎的机理。以肾小球系膜细胞培养技术，3H-TdR掺入测定法。结果：利肾口服液高、中剂量组3H-TdR掺入值极显著低于空白组和IL-1、IL-6、TNF组(P＜0.01）；IL-1、IL-6、TNF组3H-TdR掺入值极显著高于空白组（P＜0.01）。提示：直接抑制系膜细胞和拮抗IL-1、IL-6、TNF刺激系膜细胞异常增殖是利肾口服液治疗以系膜细胞增殖为主要病理的肾小球肾炎的机理之一。
　　主题词　＠利肾口服液/药理学　系膜细胞　清热利湿
　　肾小球系膜细胞（GMC）的增殖及其基质的病理性聚积是肾小球硬化的主要病理。研究表明某些细胞因子在肾小球肾炎的发生发展和慢性化过程中起重要作用〔1〕；若探索出拮抗这些细胞因子的中药，则可望在一定程度上防止肾小球病变的发生和发展。本研究观察了利肾口服液拮抗细胞因子对GMC影响。
1　材料和方法
1.1　材料　　大白鼠，重200g(由华西医科大学动物实验室提供)，RPMI-1640(美国GIBCO公司提供)，普通胰岛素(美国Sigma公司提供)，利肾口服液(由石韦、木贼、益母草等组成，本校附院制剂室提供)；1g／ml(相当于含生药3g/ml），滤过除菌，无菌7.5％　NaHCO3调pH值至7.1～7.4。IL-110万u/支、IL-6　10万u/支、TNF　5万u/支、地塞米松5mg／ml(中国军事医学科学院提供)。
1.2　方法
〔2〕4／ml的悬液，转种至96孔板，200　μl／孔，预培24小时，使大部分细胞同步在G0期。除空白组外，其余分别再加入含IL-1、IL-6、TNF各100U／ml各等份和利肾口服液高、中、低剂量组(简称中药组，7.5mg／ml、5mg／ml、2.5mg／ml）以及地塞米松10μg／ml的培养液40μl。置37℃5％CO2〔3〕公式计算。采用方差分析及t检验处理数据，统计软件为SPSS。
2　结果
2.1　利肾口服液直接对GMC的抑制作用　　见表1。

组别
n
剂量
　　　CPM
抑制率
(%)
空 白 组
6
Ⅱ号液20μl
1988.5±153.45

＋地米组
6
10μg／ml
1214.2±259.98※
39.34
＋利肾高
6
7.5mg／ml
1168.0±105.22※※
41.26
＋利肾中
6
5mg／ml
1334.8±49.44※※
32.87
＋利肾低
6
2.5mg／ml
1387.2±71.01※※＃
30.23

     　　注：※与空白组比较P＜0.05；＃与地米组比较P＜0.05，※※与空白组比较P＜0.01(下同)
　　从表1可以看出，地塞米松能直接抑制GMC的增殖，与同类研究结果近似〔4〕。中药高、中、低剂量组与地塞米松组CPM值均显著低于空白组（P＜0.01）。提示利肾口服液可显著直接抑制GMC增殖。中药高、中、低剂量组之间有一定的量效关系。其抑制率由强至弱的顺序为利肾高剂量组＞地塞米松组＞利肾中剂量组＞利肾低剂量组。
2.2　利肾口服液拮抗IL-1刺激GMC的增殖作用　　见表2。
　　从表2可以看出，加IL-1组CPM显著高于空白组（P＜0.01），提示IL-1能促进GMC增殖；而在IL-1培养皿中加用中药各剂量组及地塞米松组均可显著抑制IL-1刺激GMC异常增