大鼠中枢神经元内免疫神经内分泌物质的共存.doc

大鼠中枢神经元内免疫神经内分泌物质的共存（全面版）资料

大鼠中枢神经元内免疫神经内分泌物质的共存*

    【摘要】　目的　研究白细胞介素-2、代谢型谷氨酸受体1亚型(mGluR1)和雌激素受体(ER)在中枢神经系统神经细胞的表达，证实它们共存的可能性。　方法　使用种属特异性1抗(山羊抗IL-2、兔抗mGluR1,小鼠抗ER血清)的免疫细胞化学三重标记技术，在相邻的两张连续切片(1张显示IL－2，另1张显示mGluR1和ER)上证实大鼠大脑皮质、延髓和脊髓内上述3种物质的共存。　结果　在上述部位的中枢神经元内可见IL－2、mGluR1和ER 3种免疫反应性标记细胞。IL－2免疫反应产物为棕褐色，位于胞浆内。相邻切片的mGluR1免疫反应产物为蓝黑色，位于胞膜；ER免疫反应产物亦为棕褐色，位于胞浆或核内。显示mGluR1和ER的同一切片上有mGluR1/ER双标细胞，双标细胞约占全部标记细胞的50%～60%。通过对相邻的两张切片的投影核对，证实存在mGluR1/ER/IL－2三标细胞，三标细胞占mGluR1/ER双标细胞的30%。　结论　在大鼠中枢神经系统内mGluR1,ER和IL－2可共存于同一个神经细胞，从而首次在细胞水平为神经免疫内分泌网络学说提供了形态学依据。
　　【关键词】　代谢型谷氨酸受体　雌激素　白介素－2　神经元　免疫细胞化学
GOEXISTENCE OF IMMUNE－NEURO－ENDOCRINE SUBSTANCES
IN THE RAT CENTRAL NEURONS
Zhu ChanggengΔ，Liu Qingying,Wei Ying,Ma Chunling, Hao Jiandong, Yan Ping
(Department of Anatomy,Tongji Medical University,Wuhan)
　　【Abstract】　Objective To investigate the expression of Interleukin－2(IL－2),metabotropic glutamate receptor subunit 1(mGluR1) and estrogen receptor (ER) in neurons of the rat central nervous system (CNS) and identify the coexistence possibility of these immune－neuro－endocrine substances in the central neurons.Methods The triple labeling immunocytochemical staining technique with different species－specific primary antibodies(goat anti－IL－2 serum,rabbit anti－mGluR1 serum and mouse anti－ER serum)were used to incubate two serial neighbor sections(one for demonstrating IL－2,another for mGluR1 and ER) and identify the coexistence of above three kinds of substance in the cerebral cortex,medulla oblongata and spinal cord.Results There were IL－2, mGluR1－and ER－immunoreactive(ir)labeled neurons in the above mentioned central areas.The IL－2－ir production showed brown in color,locating in the cytoplasm.In the neighbor serial section,mGluR1－ir production showed blue－black in color,locating at the cell membrane;the ER－ir production also showed brown color,locating in the cytoplasm or nucleus.There were mGluR1/ER double labeled cells in same section, which accounted for about 50%－60% of the total single and double labeled neurons.It was identified by projection check of serial neighbor sections that there were mGluR1/ER/IL－2 triple labeled cells which accounted for about 30% of total mGluR1/ER double labeled nuurons.Conclusion mGluR1,ER and IL－2 can coexist in same rat central neurons,therefore,providing morphological basis for the theory about immune－neuro－endocrine network at the cellular level for the first time.
　　【Key words】 Metabotropic glutamate receptor; Estrogen receptor; Interleukin－2; Neuron; Immunocytochemistry

　　自从1977年Besedovsky［1］提出“免疫－神经－内分泌网络”学说以来，越来越多的研究证明，在免疫、神经和内分泌三大调节系统之间存在着密切而复杂的相互关系。免疫系统的免疫调质通过受体作用于神经和内分泌系统［2，3］，神经系统的神经递质通过受体支配免疫和内分泌器官［4，5］，内分泌系统则通过激素调节免疫和神经系统的功能［6，7］，并借此形成免疫、神经与内分泌之间相互调控的大(三者之间)、小(两者之间)往返回路。然而，迄今未见这3种物质共存于中枢或周围同一神经(或免疫、内分泌)细胞的报道。为了进一步阐明这3个系统的密切关系，我们拟以中枢神经元为靶，在细胞水平证实免疫－神经－内分泌网络的存在，从而为其互相调节的机制提供新的形态学依据。
材料和方法
　　选用健康雌性动情前期或动情期(通过阴道涂片确定)大鼠12只，体重220～280g，在戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg,i.p)下，经心脏插管至升主动脉，先用生理盐水100ml冲洗血液，然后灌注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(pH7．4)400ml。取端脑、延髓和颈、胸、腰段脊髓，后固定于上述灌注液中2h，再入20%蔗糖磷酸缓冲液中过夜至组织块沉底，做好侧别标记，次日作恒冷箱额状切片，片厚20μm，将相邻切片按同样方向分别贴于两张载片上，免疫细胞化学SABC法染色程序如下：第1张切片进行mGluR1/ER双重染色，即首先用小鼠抗ER血清(药盒工作液，Dako公司)和兔抗mGluR1血清(1∶250，日本京都大学重本隆一和水野升教授惠赠)共同孵育切片(4℃，72h)，再用生物素化的马抗小鼠血清(1∶150，北京中山公司，37℃，1h)和链霉亲和素抗生物素－辣根过氧化物酶复合体(SA－HRP，1∶200，北京中山公司，37℃，1h)孵育，DAB呈色。充分洗涤后，用生物素化的山羊抗兔血清(1∶150，北京中山公司)和链霉亲和素抗生物素－辣根过氧化物酶复合体(SA－HRP,1∶200，北京中山公司，37℃，1h)孵育，葡萄糖氧化酶－硫酸镍铵法呈色。在上述各步骤之间均用PBS充分洗涤切片。常规脱水、透明、封片，光镜下观察、摄片。第2张切片进行IL－2单染，先用山羊抗IL－2血清(1∶100，Sigma公司)孵育切片(4℃，72h)，然后用生物素化的兔抗山羊血清(1∶100，博士德公司，37℃，1h) 和链霉亲和素抗生物素－辣根过氧化物酶复合体(SA－HRP，1∶200，北京中山公司，37℃，1h)孵育，DAB呈色。每步骤间充分洗涤。常规脱水、透明、封片，光镜下观察、摄片。用复印胶片描绘出第1张切片上mGluR1/ER双标细胞的轮廓，与第2张切片上的IL－2阳性细胞进行投影核对，确定三标细胞的存在和位置。对照试验：(1)省去1抗，或用正常血清代替1抗孵育切片，结果不出现相应的免疫反应；(2)呈色混合试验：对双染的第1张切片，在第1套染色程序完成后，切片经PBS充分洗涤，然后直接进行第2套染色程序中的呈色步骤，结果为阴性，表明两套免疫细胞化学染色反应之间不互相干扰，本实验具有免疫细胞化学特异性。
结　　果
　　在大鼠大脑皮质、延髓和脊髓颈、胸、腰段均可见到mGluR1,ER和IL－2免疫反应性神经细胞。mGluR1免疫反应产物为蓝黑色，位于胞膜；ER免疫反应产物为棕褐色，位于胞浆或核内。IL－2免疫反应产物亦为棕褐色，位于胞浆内。在大脑皮质，上述3种阳性细胞分布于皮质各层，以第Ⅴ层最为密集。在数量上，mGluR1阳性细胞最多，ER阳性细胞次之，IL－2阳性细胞最少。阳性细胞以锥体形大、中细胞为主(1A，B)。在延髓和脊髓，mGluR1和ER阳性神经元的分布已述于我们的另一篇文章［8］，主要分布于迷走神经背核、孤束核、三叉神经脊束核和网状结构及脊髓的腹角、背角和中间带，以mGluR1阳性神经细胞占优势，以上细胞以中等大多角形细胞为主(2A，3A，4A)。IL－2阳性细胞在延髓和脊髓的分布均较上述两种细胞少(2B，3B，4B)，但分布类型相似。本实验主要对大脑皮质、延髓网状结构和脊髓腹角的含上述免疫、神经、内分泌3类物质的细胞进行研究。在mGluR1和ER双重染色的切片上，可见3种细胞：(1)mGluR1单标细胞，胞膜为蓝黑色；(2)ER单标细胞，胞浆或胞核呈棕褐色；(3)mGluR1/ER双标细胞，胞膜为蓝黑色，胞浆和胞核为棕褐色。双标细胞约占全部(单+双)标记细胞的50%～60%(依部位而异，1A，2A，3A，4A)。双标细胞的形态主要为锥体和多极细胞。通过对相邻两张切片的投影核对，证实在大鼠大脑皮质、延髓网状结构和脊髓腹角内存在mGluR1/ER/IL－2三重标记细胞，即同一神经细胞既为mGluR1/ER阳性，又呈IL－2阳性，1个细胞在相邻两张切片上的影像重迭(比较1A与1B，2A与2B，3A与3B，4A与4B)。三标细胞约占mGluR1/ER双标细胞总数的30%。

<"1-1b (18746 bytes)" src="/med/cano/202103/20210309161226559" 278 188>

1A　大鼠大脑皮质mGluR1和ER双重免疫组织化学染色切片。短箭头(↑)所指与B中相应部位的↑所指为同一细胞。长箭头(↑)所指为mGluR1/ER双标细胞，并与B中相应部位的↑所指为同一细胞。小三角(▲)所指为mGluR1阳性(单标)细胞，大三角(▲)所指为ER阳性(单标)细胞。1B为A的相邻连续切片。IL－2免疫组织化学染色。短箭头(↑)所指与A中相应部位的↑所指为同一细胞。长箭头(↑)所指为IL－2阳性细胞，并与A中相应部位的↑所指为同一(三标)细胞　×100
Fig.1 A mGluR1 and ER double immunostained section of the cerebral cortex.Short arrow(↑)points the same cell in corresponding position of B and pointed by ↑.Long arrow(↑) points mGluR1/ER double labeled cell,which is the same cell in corresponding position of B and pointed by ↑.Small triangle(▲) points mGluR1－positive(single labeled)cell.Large triangle(▲)points ER－positive(single labeled)cell.B:IL－2 immunostained serial neighbor section of A.Short arrow(↑) points the same cell in corresponding position of A and pointed by ↑.Long arrow(↑) points IL－2 labeled cell.which is the same cell in corresponding position of A and pointed by ↑ (triple－labeled cell). ×100

2A　延髓上段网状结构mGluR1和ER双重免疫组织化学染色切片。2B为A的相邻连续切片，IL－2免疫组织化学染色。各种箭头和三角所指同1　×100
Fig.2 A mGluR1 and ER double immunohistochemical staining section of the reticular formation of upper medulla oblongata.B:IL－2 immunohistochemical staining serial neighbor section of A., The targets pointed by different arrows and triangles are the same as in Fig.1. ×100

3A　延髓下段网状结构mGluR1和ER双重免疫组织化学染色切片。3B为A的相邻连续切片，IL－2免疫组织化学染色。各种箭头和三角所指同1　×100Fig.
3 A mGluR1 and ER double immunohistochemical staining section of the reticular formation of lower medulla oblongata.B:IL－2 immunohistochemical staining serial neighbor section of A.the targets pointed by different arrows and triangles are the same as in Fig.1. ×100

4A　颈段脊髓腹角mGluR1和ER双重免疫组织化学染色切片。4B为A的相邻连续切片，IL－2免疫组织化学染色。各种箭头和三角所指同1　×100
Fig.4 A mGluR1 and ER double immunohistochemical staining section of the ventral horn of cervical spinal cord.B:IL－2 immunohistochemical staining serial neighbor section of A.The targets pointed by different arrows and triangles are the same as in Fig.1. ×100

讨　　论
　　关于IL－2、mGluR1和ER三类物质在中枢神经系统的分布已有较多信息，它们中两类物质共存于1个细胞也有一些资料，然而这三类物质共存于同一个神经细胞则尚未见报道。Sternberg［9］在综述神经－免疫调节时指出，神经细胞可合成IL－2，并具有IL－2受体。De Sarro等［10］报道，脑室内给予重组的IL－2可促进致痫剂引起的癫痫发作。王智明等［11］报道，mGluR1阳性神经元广泛分布于脑和脊髓的运动和感觉性核团，参与各种有关功能的调节。Yukhananov和Handa［12］报道，雌激素可通过受体改变大鼠室旁核的前脑啡肽转录。本文首次报道免疫、神经、内分泌三类物质在中枢神经元共存，其意义在于从细胞内水平为免疫、神经、内分泌网络提供了形态学依据，对神经系统复杂功能的调节具有重要意义。至于其细胞内转导机制，可能是通过受体－信使－基因转录途径完成的。由于受体与受体间的直接相互作用目前仅见于腺苷酸受体与多巴胺受体之间［13］，故推测它们之间的整合主要是通过信使间的对话(crosstalk)和转录干扰(transcription interference)实现的，如Ca2+与cAMP之间的对话和在反应元件AP－1的功能整合［14］。最近的研究表明，核因子NF－κ B在脑的信号传递中起关键作用［15］，免疫、神经、内分泌因素都可激活NF－κ B，从而诱导一系列的基因表达，实现转录干扰，调节神经细胞的机能活动。
* 自然科学 重点项目资助课题(No.39330210)
作者单位：朱长庚　刘庆莹　魏瑛　马春玲　郝建东　晏平　同济医科大学解剖学教研室，武汉　430030
参考文献
［1］Besedovsky H,Sorkin E.Network of immune－neuroendocrine interactions.Clin Exp Immunol,1977,27(1):1
［2］Plate－Salaman CR.Immunoregulators in the nervous system.Neurosci Biobehav Rev,1991,15(1):185
［3］Bateman A,Singh A,Kral T.The immune－hypothalamic－pituitary－adrenal axis.Endicrine Rev,1989,10(1):92
［4］Kavelaars A,Jeurisen F,Heijnen CT.Substance P receptors and signal transduction in leukocytes.Immunomethods,1994,5(1):41
［5］Gangolli EA，Conneely OM,O'Malley BW.Neurotrasmitters activate the human estrogen receptor in a neuroblastoma cell line.J Steroid Biochem Mol Biol,1997,61(1－2):1
［6］Pakan DR,Sapolsky RM.Glucocorticoid endangerment of the hyppocampus:tissue steroid and receptor specificity.Neuroendocrinology,1990,51(3):613
［7］Greco B,Edwards DA,Michael RP,et al.Androgen receptors and estrogen receptors are colocalized in male rat hypothalamic and limbic neurons that express FOS immunoreactivity induced by mating.Neuroendocrinology,1998,67(1):18
［8］魏瑛，朱长庚，刘庆莹,等.雌激素受体与代谢型谷氨酸受体在延髓和脊髓的分布与共存.同济医科大学学报(待发表)
［9］Stenberg EM.Neural－immune interaction in health and disease.J Clin Invest,1997,100(11):2641
［10］De Sarro G,Rotiroti D,Audino MG,et al.Effect of interleukin－2 on various models of experimental epilepsy in DBA/2 mice.Neuroimmunomodulation,1994,1(6):561
［11］王智明，李云庆，施际武.大鼠脑内代谢型谷氨酸受体1、1α亚型的定位分布.解剖学报，1996，27(3)：225
［12］Yukhananov RY,Handa RT.Estrogen alters proenkephalin RNAs in the paraventricular nucleus of the hypothalamus following stress.Brain Res 1997,764(1－2):109
［13］Ferré S,Fredhelm BB,Morelli M,et al.Adrenosine－dopamine receptor－receptor interaction as an integrative mechanism.TINS,1997,20(10):482
［14］Uht RM,Anderson CM,Webb P,et al.Transcriptional activities of estrogen and glucocorticoid receptors are functionally integrated at the AP－1 response－element.Endocrinology,1997,138(7):2900
［15］O'Neill LAJ,Kaltschmidt C.NF－κ B:A crucial transcription factor for glial and neuronal cell function.TINS,1997,20(6):252

低能量雷射的照射對末梢神經、中樞神經及皮膚傷口和燙傷之組織的效果

Simon Rochkind, MD, Morris Rousso, MD, Moshe Nissan, PhD, Manuel Villarreal, MD, Liliane Barr-Nea, PhD, 與D. G. Rees, PhD

特拉維夫醫學中心神經外科(S. R.), 特拉維夫Ichilov醫院及以色列耶路撒冷Hadassah Mount Scopus大學醫院整形外科手部單位外科(M.R., M. V.) ；以色列特拉維夫，特拉維夫大學醫療元氣機能組織與細胞生物學科；牛津Headington, Nuffield整形中心OOEC (M.N.) 及英國牛津Headington牛津技術學院數學與計算機科學系

在這份報告中，我們專注於低能量氦氖雷射照射對於受傷的周圍神經系統及中樞神經的復原，以及對皮膚傷口和燙傷的癒合的組織之效果。
雷射照射只照射皮膚雙邊傷口的右邊就能加強雙邊的癒合相比於未照射的控制組(P<0.01) 。相同的結果包含在兩向的燙傷：照射燙傷的一處也會加速沒有照射那一處的治癒(P<0.01) 。但是在沒有照射控制組，所有的老鼠腳上都患有壞疽和雙邊生有壞疽。
低能量的氦氖雷射照射應用於右腳被壓碎的坐骨神經傷口，在兩向造成的壓碎傷口，也會顯著的增加未經照射的左腳複合行為的潛能。統計的分析顯示控制組(未照射組)和照射組之間的高度顯著差異(p<0.01) 。最後，在脊髓部分發現的組織上的效果和破裂的坐骨神經一致。在周邊神經歷經雙邊壓傷後預期會出現的脊髓運動神經元雙邊逆向退化，在雷射治療後大量減少。
在此所提出的組織的效果之報告和低能量的雷射照射的臨床應用及對其所涉及的可能功用的基本研究有其相關。

關鍵字：氦氖雷射、壓碎的坐骨神經、色原溶解

導論
低能量雷射在醫學和生物領域各方面成功的運用，在世界各地都有報告[1-9]，但它的使用仍是具有高度爭議的[10, 11]。
過去13年，我們的團隊專注於低能量雷射照射在周邊神經系統和中樞神經系統的效果，我們認為雷射照射對嚴重受損的周邊神經系統和中樞神經系統的治療，是一種有效的新工具。
1988年12月1日通過發行。
Simon Rochking醫生到1989年8月仍屬加拿大，安大略省多倫多市病童醫院神經外科Edna獎計畫的一員。
要求再版請向以色列特拉維夫Weizman街6號特拉維大醫學中心神經外科的Simon Rochking醫生提出。
主宰報告中的效果之機制，曾經由我們的團隊及他人加以探索。但精確的機制並沒有被說明，只有某些可能的片斷部分解釋曾在最近發表。其中有一個團隊發現，低能源雷射照射，在使用特定波長時，可導致在細胞色素的局部治癒效果，從而引起薄膜滲透性的立即增加。細胞薄膜的局部加熱發生於吸收部位處，改變了薄膜對鈣離子的滲透性，且增加其對鉀離子的傳導性[22] 。其他的作者發現，特定的照射被使用於誘發RNA製造、DNA合成、蛋白質新陳代謝、酵素產生和膠原合成速率的改變[5, 7, 23-27]。我們之前的研究[20] 從事對試管中的裸神經照射效果的調查，以排除其周遭組織可能造成的影響。我們發現低能量雷射照射直接影響神經，而它在預防和治療上的效果，並非是熱量也不限於特定的能量(或能量密度)的範圍。溫度的測量指出不超過0.1℃的改變，(在照射期間，探熱器放在神經下)，遠小於影響細胞的活動的最低需求。

我們和其他的團隊就低能量的雷射對周邊神經系統和中樞神經系統，皮膚傷口等等的效果的報導，大部分都和直接照射組織或包含對皮膚的下照射有關。但有些報告指出低能量雷射治療的對組織的可能效果。Kana等人[3]宣稱氬照射，導致施用部位和相對側部位膠原合成的增加。他們將此效果歸因於照射的抑制免疫力的影響，Mester等人[5]的報告對角膜病變施以低能量雷射照射，剌激了其他沒有照射的受傷角膜的癒合。

在目前的研究，我們詳細的說明，過去我們的測試報導所發現的一些效果，並提供證據來支持低能量雷射照射，對皮膚的傷口還有燙傷的癒合，以及受傷的中樞神經與周邊神經的復原治療，都存在有利於組織的效果。

材料與方法
88隻Sprague-Dawley老鼠重量大約300克，每一隻都使用在現今的研究上。所有的老鼠飼養和處理的方式都相同，動物們用稀釋的寧比泰做腹膜內麻醉（依重量每公斤用15毫克），供以下各種手術和治療之用。老鼠被分為12組，像表一顯示的，被利用在以下4種不同的測試中。

低能量雷射對皮膚傷口效果之評估
兩組各10隻的老鼠相互比較，A組是控制組，進行沿著背部中間平行雙邊切開，並將7X1公分的皮膚片從肌肉帶移走開。這些老鼠在未來的21天，都不做進一步的雷射治療。B組有相同的手術，同樣的移除雙邊皮膚，但是右邊的傷口在未來的21天，每天用16mW連續波(CW)和氦氖雷射照射7分鐘(632.8nm, Aerotech公司)，照射點大小直徑3mm2，能源密度7.6 J/cm2(每一點)，沿著傷口邊際送達。沒有實施其他的醫療。所有的傷口，依一定的間隔時間照相並做醫學觀察。

表1：用於目前調查的老鼠組別
傷 口 燙 傷 周邊神經 脊 髓
組別 老鼠數 控制組 雷射組 控制組 雷射組 控制組 雷射組 控制組 雷射組
A 10 X -- -- -- -- -- -- --
B 10 -- X -- -- -- -- -- --
C 10 -- -- X -- -- -- -- --
D 10 -- -- -- X 正常 -- -- --
E1 5 -- -- -- -- -- 正常 -- --
E2 5 -- -- -- -- 壓傷 -- -- --
F1 9 -- -- -- -- -- 壓傷 -- --
F2 9 -- -- -- -- -- -- 壓傷a –
G1 5 -- -- -- -- -- -- -- 壓傷a
H1 5 -- -- -- -- -- -- 壓傷b –
H2 5 -- -- -- -- -- -- -- 壓傷b
a受傷後14天
b受傷後270天

低能量雷射在燙傷上之效果評估
兩組10隻老鼠，每一隻都在一般麻醉下把他們的後腳踝以下浸在98℃的熱水中30秒。控制組C組沒有接受進一步的雷射治療，但是D組實驗組的老鼠的右後腿，在往後的21天接受每天7分鐘(每點10J/cm2)的氦氖雷射治療，氦氖雷射沿著燙傷的腿照射。

所受燙傷的評估經過臨床的觀察，所有的燙傷都依一定間隔時間加以照相。

低能量雷射在正常和受傷周邊神經的效果之電子生理學上之評估
根據以下的分組在這個部分運用了28隻老鼠：
E組，這組有10隻分為兩個次組：5隻不接受雷射治療(E1次組)，其他5隻老鼠接受經由皮膚的右邊坐骨神經的照射（E2次組）。在20天裡氦氖雷射(632.8nm) 每天照射7分鐘，(照射點大小直徑3mm2，能源密度每一點10 J/cm2) 。真正接觸到神經的能源為送達皮膚能源的2到10﹪[15] 。在兩個次組（E1和E2次組）左邊坐骨神經的複合動作潛能，藉由以Grass剌激器[Grass公司，Quincy, MA, 模式(Sye)] 以及針狀電極對神經的刺激來衡量，並用Beckman Dynograph記錄器(Dynograph類型AM紀錄器700) 和另一針狀電極(Medelec公司)來記錄所導致的相對應的腓腸肌的複合動作潛能。在測試一開始對左邊坐骨神經的測試所測量到的複合動作潛能AP0，被當作標準，而在未來30天所量到的複合動作潛能將與之做比較。
F組，這組包含18隻老鼠，全部都有做相同的的手術，以暴露出雙邊坐骨神經。外露的坐骨神經被以止血鉗施以30秒的壓裂傷並施以壓力(6.3±0.7)MP[10] 。傷口在破裂後縫合。一半的老鼠為控制組(次組F1) 且未有任何進一步的雷射治療。其他9隻老鼠(次組F2)根據E組的設定接受雷射治療。所有老鼠的電子生理學的紀錄(複合動作潛能) 在手術後依照前述方式被加以測量360天，並與每條腿完整未受壓傷前的AP0值做比較。
接受雷射治療，衡量所有的老鼠360天和之前的互相比較。

低能量雷射對和受傷的周邊神經相對應的脊隨部分效果的評估
因周邊神經破裂而造成對神經軸索的干擾會伴隨有一系列的細胞體形態學和生物化學上的變化。這些變化會導致在脊隨相對應部份神經細胞（神經元）的退化。
兩組(H和G) 各十隻老鼠被用在這個部份的研究。所有20隻老鼠都受到依照前述方式施予F組老鼠的雙邊坐骨神經破裂的傷害。在G組，五隻老鼠(次組G1)不接受雷射治療，並作為控制組。其他五隻老鼠(次組G2)接受給次組F2所述相同的雷射、方式和劑量的雷射療法。
G組的老鼠在坐骨神經壓傷14天後殺死。脊隨的相對應區段(L4-S1)加以石臘處理成6µm厚的小段，備妥供以Cresyl Fast Violet 來做組織學的研究。
上一組測試組中，H組五隻老鼠為控制組，且沒有接受雷射治療(次組H1)，其他五隻老鼠(次組H2)在右邊破裂的脊隨神經接受和G2次組類似的雷射治療20天，H組的老鼠飼養270天，然後殺死並加以準備，以使用於如G組的組織研究上。

圖1. 典型的皮膚傷口在移除皮膚片21天後的癒合。ａ: 自行癒合，A組。ｂ: 照射傷口，B組。ｃ: 未照射的另一邊傷口，B組。

統計上的分析
在前兩次老鼠的測試中(皮膚傷口和燙傷)，和它們個別的控制組比較，使用Wilcoxon無母數檢定。上一次的測試中電化生理學上的結果，被以裂區因素模式split-plot factorial design[28] ，以及由牛津理工學校發展的變異數分析來加以統計上的分析。

結果

低能量氦氖雷射對皮膚傷口的組織的效果與影響
在第一個未照射控制組A組中(10隻老鼠)，傷口可以自然的復合，圖1a(A組)是受傷後21天後的典型圖。皮膚有輕微發炎的反應和部份的結疤組織冒出，覆蓋在失去皮膚處，但是表面留有一些保持乾燥的且覆蓋黑色疥癬處。收縮和上皮生長讓傷口逐漸的消失到一半的面積。圖1b顯示B組在雷射照射右半背部傷口21天後的典型癒合。由收縮和上皮生長的合口，是完整和幾乎線性的，圖1c表示雷射治療B組在受傷21天後有8隻(80%的)老鼠未經照射的左邊。雖然這些傷口沒有治療，可以從未照射的控制組A組看到巨大的改變(圖1a) 。在B組中剩下的兩隻老鼠顯示和控制組A組無異。所有的組別都發現有顯著差異的(P<0.01)。

低能量氦氖雷射照射對燙傷上的組織的效果及影響
未照射的控制組C組(10隻老鼠)和照射雷射組D組(十隻老鼠)，末端組織隨著滾水的燙傷，而逐漸的壞死和消失。但是，受傷後的21天，所有在控制組中未照射的老鼠C組(圖2a)，承受進一步雙邊腳部的壞疽和兩側的壞疽，而70%受照射的(七隻)老鼠D組(圖2b)，兩隻腳都沒有壞死且乾淨的，且覆蓋新的上皮。未照射的左腳比直接照射腳的復原情況較慢，但是比控制組C組形狀上已有好轉，D組剩下的三隻老鼠，它們的腳和控制組C組無異，C組和D組被發現有P<0.01水準的顯著差異存在。

低能量雷射照射周邊神經的組織的效果
無受傷完整的神經。 低能量雷射照射對完整坐骨神經老鼠在電流活動上(複合動作潛能)的效果，在E組中評估，結果顯示於圖3。未照射控制次組E1的複合動作潛能(5隻老鼠)在圖中由實線和圓點來描述，而在接受照射的次組E2(5隻老鼠)中，左邊的未照射的腳用虛線和黑星來表示。這兩個次組的統計上的比較，只有不顯著的差異。
圖3的範圍(和圖4)，代表群組平均的每邊1標準差。

圖2. 在浸泡熱水21天後，老鼠腳部的典型。ａ: 燙傷未經照射，C組。ｂ: 燙傷經照射，D組。兩隻後腳掌都顯示。

天數
圖3. 坐骨神經完整幼鼠的動作潛能(AP) 和E1控制組AP0啟始值的比較；E2照射組老鼠未被照射的神經。

破裂損傷神經。 雷射照射對未受照射的破裂坐骨神經的組織的效果，表示於圖4，其描述對破裂神經複合動作潛能長達1年的測量。未照射控制組F1組(九隻老鼠，較低的連續線)，其複合動作潛能掉到第一天正常未破裂時的40%(±11%)， 21天後更減低到19%(±4%)。到年底時，複合動作潛能增加到正常未被壓傷的67%(±12%)。經雷射照射的F2組(九隻老鼠，圖四，虛線)，未照射的左腳一天後降低到60%(±22%)，經過三個星期後達到43%(±16%)，然後到年底升到開刀前數值的133%(±10%)。統計分析顯示雷射治療組F2和控制次組F1間的高度顯著差異(P<0.001)，及兩組次組高度的顯著時間依賴(P<0.001)。

天數
圖4. 坐骨神經被壓碎的老鼠的動作潛能AP和被壓碎前數值AP0的比較。F1控制組啟始值的比較；F2照射組老鼠未被照射的神經。

低能量氦氖雷射對脊隨上的組織的效果及影響
圖5表示G組(壓傷14天後) 和H組(壓傷的270天後)取自脊隨部分(L4-S2) 相對應於壓碎受