HPLC方法建立和优化.pptx

,绪论,目录,分离的基础,2,色谱柱,3,样品分离的系统方法,4,梯度洗脱,5,1,定性和定量分析,目录,6,方法的完善,7,绪 论,色谱仪器介绍,色谱仪器：,控制器,输液泵,储液瓶,溶剂组织器,进样器,色谱柱（柱温箱）,检测器,色谱仪器介绍,原理图：,输液泵,进样器,色谱柱,检测器,色谱工作站,储液瓶,HPLC,方法建立的步骤,HPLC,方法建立的步骤,一、样品的性质，确定分离目的,二、是否需要特殊的,HPLC,步骤、样品预处理等,三、选择合适检测器并确定检测参数,四、选择液相色谱法，进行预实验，估计最佳分离条件,五、优化分离条件,HPLC,方法建立的步骤,六、检查出现的问题或所需的特殊步骤,七、分析,A,、回收纯化物,B,、定量校正,C,、定性方法,八、论证方法使之进入常规实验室,样品的性质，确定分离目的,了解样品的相关情况：,所含化合物的数目；,化学结构（官能团）；,分子量；,pKa,值；,UV,光谱图；,被测组分在样品中的浓度范围；,样品的溶解度、沸点及其稳定性；,可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。,要分离的化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物,1.1,样品具有什么样的性质？,定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定？,是否分析所有组分？定性？一种条件有困难？分组分析？,定量分析的准确度和精密度？（主成分精密度在,12）,不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等）,分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。,实验室的条件，如,HPLC,仪器的配置和档次；色谱柱系统；是否有恒温？是否可以做梯度？分析成本？实验室人员的操作技能如何？方法是否具有可移植？等等。,1.2,明确分析目的,可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）,需稀释、,pH,缓冲、加内标或其它操作,固体样品选择合适的溶剂溶解后进样,需提取分离的样品,预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。,总之，将样品溶于合适的溶剂；或者用合适的溶液提取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意被测组分的稳定性和提取率,1.3,样品的预处理与检测,按照样品的特性分为以下二类：,A,一般样品（分子量2000,）,可采用基本标准的方法。,（,中性的、离子的）反相、离子对、非水反相、正相、离子交换,B,特殊样品,无机离子：离子色谱,异构体：手性分析,对映体、,生物样品：肽类、核苷酸,大分子：蛋白质、核酸、糖类，合成聚合物。需要大孔径色谱柱填料（,10nm,孔径）等等,1.4 HPLC,方法建立,1.5,HPLC,首选方法建立,方法,/,特点,/,色谱柱,适用范围,反相,HPLC,流动相：水有机溶剂,能溶于水有机溶剂的大部分样品，中性或非离子化合物,色谱柱：,C18,、,C8,、苯基、,三甲基硅烷,（,TMS,）、氰基,离子对,HPLC,流动相：,缓冲液（加离子对试剂）有机溶剂,离子或可电离化合物，尤其是碱或阳离子样品,色谱柱：,C18,、,C8,、氰基,正相,HPLC,流动相：,有机溶剂混合液,不溶于水有机溶剂的亲脂样品，异构体等样品,色谱柱：,氨基、硅胶、氰基、二醇基,方法特性：,1.5,HPLC,首选方法建立,分离条件,较好的首要选择,色谱柱,尺寸（长度，,ID,）,1504.6mm,粒度,5m,固定相,C18,流动相,溶剂,A,和,B,缓冲液乙腈,%B,80100%,缓冲液（化合物、,pH,、浓度）,25mM,磷酸钾，,2.0pH 1.5,样品保留值,0.5,k,20,分离时间,小于,5,10min,较为理想,定量,一般：,2%(RSD),要求不高：,5%(RSD),痕量：,15%(RSD),压力,2000Psi,（新柱）,2000(,理论踏板数）,溶剂消耗,越少越好,目标：,1.6,HPLC,方法优化,合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，方法的稳定性。,对出现的各种色谱现象，包括仪器和样品的稳定性等提出切实可行的办法。,建立合理的数据处理方法等。,1.6,方法的优化,1.7,完善,HPLC,方法,定性与定量方法的建立及论证。,对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定的分析方法。,解决出现的问题,方法的可移植性,1.7,完善,HPLC,方法,1.7,完善,HPLC,方法,问题,1,、柱效低,2,、色谱柱寿命短,3,、保留值变化,4,、定量精度差,5,、出现干扰峰,6,、峰严重拖尾或前趋,7,、分离度不够，峰不能完全分开,经常出现的问题：,二、色谱柱基础知识（一）,2.1,色谱柱的性能指标,1,、,柱效率,:,N,实际工作中一般取,1/2,峰高处计算柱效（保留时间）,：,N,=5.54,（,t,R,/t,1/2,）,2,基本理论踏板数计算公式：,N,V,R,/W,2,W,Method,W,tan,16,切线法,W,1/2h,5.54,半峰高,W,3,9,3,w,4,16,4,w,5,25,5,V,R,t,R,v,R,50%,32.4%,13.4%,4.4%,W,W,3,W,1/2h,W,5,W,4,t,R,2.1,色谱柱的性能指标,1,、,柱效率,:,N,W,5,W,4,W,5,W,4,从图上可以看出，如果峰拖尾，采用,N,1/2h,和,N,4,的方法测柱效时，拖尾的影响反应不出来，而如果采用,N,5,时，,2,号图的柱效就可以反应出来,W,1/2h,W,1/2h,1,2,2.1,色谱柱的性能指标,2,、,死体积,V,0,/,保留体积,V,R,/,相对保留体积,V,R,死时间,t,0,/,保留时间,t,R,/,相对保留时间,t,R,:,V,R,v,R,t,R,V,R,t,R,t,0,v,0,V,0,:,包括色谱柱死体积、管路以及接口的死体积。死体积的大小体现了色谱柱和仪器系统的好坏。,2.1,色谱柱的性能指标,2,、保留因子,k,:,V,R,v,R,t,R,V,R,t,R,t,0,v,0,k,:,用来描述色谱柱中溶质的迁移速度,k,V,R,/V,0,2.1,色谱柱的性能指标,3,、分离因子（,a,）,:,V,R,v,R,t,R,V,R,t,R,t,0,v,0,a,:,用来描述和表征两种不同的溶质在色谱柱里的分离过程,a,k,2,/k,1,2.1,色谱柱的性能指标,4,、峰的对称性（,A,S,）,:,A,S,:,用来描述和表征两种不同的溶质在色谱柱里的分离过程,A,s,：,0.95,1.3,（一般）,1.5,好,不好,很差,干净样品：,溶液均质，其成分在每次进样之间都能完全流出色谱柱,2.2,色谱柱常见问题,1,、保留值与分离度重复性不好,结果,原 因,主 要 变 化,柱间差异,基体、键合的不同,k,、,a,使用期间柱变化,柱床扰乱,N,键合相丢失,k,、,a,硅胶基体溶解,k,、,a,非流出物质堆积堵塞,k,、,a,柱外效应,进样量大,N,死体积,N,分离控制不好,流动相组分改变,k,、,a,流速改变,N,、,a,温度改变,k,、,a,、,N,柱平衡慢,再平衡时间不足,k,、,a,柱超载,样品质量过大,k,、,N,2.2,色谱柱常见问题,保留值重现性不好,整个应用中都使用同一固定相、粒度、尺寸色谱柱,良好的流动相条件（,pH,、缓冲液种类及浓度）,用流动相充分平衡色谱柱,整个试验过程尽量保持试验环境一致,2.2,色谱柱常见问题,2,、峰不对称：,导致分离的质量和精密度下降,不对称峰的原因,色谱柱不好；塞板堵塞或凹陷,柱进口积聚了“污物”,样品超载,样品的溶剂不匹配,柱外效应,化学或二次保留（规羟基）效应,缓冲不足或不合适,重金属污染,金属杂质如铁和铝等，会导致硅胶表面活性增加，使碱性化合物和螯合物的色谱峰严重拖尾。,2.2,色谱柱常见问题,2,、峰拖尾解决方法,色谱柱问题,用强溶剂低速冲洗色谱柱,20,倍柱体积的用,95,二氯甲烷：,4,甲醇：,1,氢氧化铵混合液冲洗,反冲色谱柱,更换塞板（不推荐清洗！），如果填料塌陷应用同样规格的填料填充,更换新色谱柱,样品过载,降低样品进样量或浓度,样品的溶剂不匹配,采用流动相溶解样品,用强溶剂溶解样品后用流动相稀释,柱外效应,更换合适的接头,减小管路的长度和直径,重金属污染,更换好的高纯度基质的色谱柱,流动相缓冲液不合适（离子样品）,采用,30mM,的三乙胺或二甲基辛胺（碱性化合物）,醋酸胺或醋酸辛胺（酸性化合物）,2.2,色谱柱常见问题,3,、色谱柱寿命,色谱柱失效的现象,反压增高,柱效降低,峰拖尾,分离度降低,保留值减小（碱性化合物在硅胶基质柱上增大）,2.2,色谱柱常见问题,3,、色谱柱寿命,色谱柱失效的原因,塞板堵塞或凹陷,柱进口积聚了“污物”,吸附了样品中的强保留物质,柱头坍陷或柱填充不良,基质或固定相遭化学侵蚀,超出合理,pH,值范围的流动相,低,pH,流动相中寿命缩短的主要原因是键合相在酸性条件下水解，这会导致保留时间和峰形的明显改变,2.2,色谱柱常见问题,3,、色谱柱的维护,1,、使用保护柱和在线过滤器、每天冲洗保护柱（现使得保护柱脱离色谱柱,!,）,2,、经常使用合适的强溶剂冲洗色谱柱（卸下保护柱！）,3,、避免大的压力脉动以及机械和热冲击（采用具有平稳启动和平稳停止功能的泵）,4,、采用合理的,pH,范围的流动相（色谱柱厂家推荐,pH,值，一般,C18,柱：,2.5pH40,度后，固定相流速加速）,三、色谱分离基础,3.1,溶剂的基础知识,Acetone,THF,MeOH,MeCN,EtOH,MeOH,溶剂粘度,：,3.1,溶剂的基础知识,溶剂强度,：,水,乙醇,甲醇,正己烷,异丙醇,二氯甲烷,四氰呋喃,乙酸乙脂,非极性,极性,乙腈,3.2,液相色谱的分离度,分离度,R,s,：,色谱的根本目的是将混合物分离成单一的化合物！,评价一个,HPLC,方法的标准之一：分离度。,下面两个图哪个分离更好些？,3.3,液相色谱的分离度,图,1,图,2,3.4,不同的分离度,不同的分离度,R,s,：,1,、一般认为,R,s1.5,时达到基线分离,2,、,R,s2,时可以保证有好的可移植性,3,、,R,s0.5,时,峰重叠,分离度的方程,k,是保留因子，表达了样品与柱填料的作用强弱。,K,=(t,R,-t,0,)/t,0,;,a,是分离因子（选择性），描述两化合物分离的好坏程度。是化学因素。受流动相和固定相影响。,a,=,k,2,/,k,1,;,N,是理论塔板数（柱效），描述色谱峰的谱带展宽程度。受柱长短和颗粒度大小以及流速影响。,3.5,影响分离的因素,K,、,a,、,N,初始,改变,k,增加,a,增加,N,K,、,a,、,N,对分离度的影响,改变,k,值的方法,调节流动相的溶剂强度,pH,、离子强度、温度等（温度每升高,1,度，,k,减少,1,2,）,梯度淋洗,改变,K,、,a,、,N,的途径,HPLC,方法,手段,结果,反相,有机溶剂比例增加,K,变小,改为溶剂强度更强的溶剂,K,变小,增加温度,K,变小,正相,极性有机溶剂增加,K,变小,离子对,与反相相反,离子交换,离子强度增加,K,变小,改变,a,的途径,改变流动相,改变温度,改变样品的本身性质,改变固定相,改变,K,、,a,、,N,的途径,条件（流动相）,结果,改变,B%,（所有）,a,改变,改变有机溶剂（所有）,a,改变,混合有机溶剂（所有）,a,改变,改变,P,H,（离子）,a,改变,改变离子对试剂浓度（离子）,a,改变,改变缓冲液或缓冲液浓度（离子）,a,改变,改变添加剂浓度（离子）,a,改变,加络合试剂（可络合时）,a,改变,改变,a,的途径,改变流动相,改变,K,、,a,、,N,的途径,改变,N,值的方法,减小填料的颗粒度,找到最佳的流速（根据不同内径）,合适的温度：粘度低、温度高,降低溶剂的粘度,增加柱长,减小柱外效应,改变,K,、,a,、,N,的途径,改变,N,值的方法,减小填料的颗粒度,找到最佳的流速（根据不同内径）,合适的温度,降低溶剂的粘度,增加柱长,改变,K,、,a,、,N,的途径,范德米特,(van Deemeter),曲线,体积超载：,质量超载（高浓度）,进样量的影响,四、液相色谱的分离机理,4.1,液相色谱的分离机理,吸附色谱,根据样品各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离,分配色谱,正相色谱：固定相极性大于流动相,反相色谱：固定相极性小于流动相,离子色谱,根据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别实现分离。,体积排阻色谱,凝胶过滤，凝胶渗透,亲和色谱,按溶质在两相分离过程的物理化学原理可分为：,4.1.1,吸附色谱,分离基于,样品在固定相上的吸附能力由大到小,。一般为正相,洗脱次序,极性低的先被洗脱,常用流动相,非极性有机溶剂，如己烷,乙酸等为添加剂,常用固定相,硅胶、氧化铝、极性键合相硅胶等,4.1.2,分配色谱,分离基于分子的极性，一般为反相色谱,洗脱次序,极性高的先被洗脱,常用流动相,有机溶剂如甲醇、乙腈，水,应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法,常用固定相,C18,、,C8,、胺基等基团,无机基质,硅胶、氧化铝、氧化锆等,有机基质,多糖型基质材料：葡聚糖系凝胶和琼脂糖系材料,聚合物型基质材料：交联聚苯乙烯数值和交联聚甲基丙烯类树脂,4.1.3,离子色谱,4.1.4,体积排阻色谱,分离基于分子量大小达到分离效果,洗脱次序,分子量大的先被洗脱,常用流动相,常用固定相,无机基质,硅胶等,有机基质,以乙烯基苯交联的聚苯乙烯,4.1.5,亲和色谱,分离基于分子量大小达到分离效果,洗脱次序,分子量大的先被洗脱,常用流动相,常用固定相,无机基质,多孔硅胶、可控孔径玻璃等,色谱柱（二）,色谱柱,色谱柱是,HPLC,分离过程的核心,一支稳定，高效的色谱柱对建立普适性强，重现性好的方法是必不可少的,柱子的类型不同，选择性也不一样,从柱子类型上分,分配,/,吸附,离子交换,凝胶,亲合,4.1,色谱柱填料,3.2,色谱柱与塔板数的关系,色谱柱的塔板数越高，柱效越高，分离效果越好。,理论塔板数的计算：,3.3,好色谱柱应具备的性能,好的峰形,尤其对于碱性化合物,可以不加额外的流动相添加剂,减小拖尾因子以提高分离度和定量准确性,高的柱效,1.8um,3.5um,和,5um,，不同的粒径可以满足任何分离的柱效要求,柱效,N,采用柱效进一步优化分离度,好的选择性,C18,是最受欢迎的键合相，且适用于大部分化合物的分离,在较宽的流动相范围内均可使用,简化方法开发,；,适于更多的应用,出色的重现性,不同批次的色谱柱都有很好的重现性,好的使用寿命,至少能分析,1000,个样品,3.4,保证柱寿命和性能良好,1.,针对不同的样品选择合适的填充柱,2.,减小压力波动，避免猛烈撞击,3.,溶剂和样品严格过滤，使用保护柱和在线过滤片。,4.,间断性地用强溶剂冲洗柱子：正相用氯仿,/,异丙醇,1,：,1,；反相用甲醇,5.,复杂样品进行前处理，尽量减少无谓的强滞留成份和微粒,6.,不要超过柱子使用的,PH,值范围，一般,2-7,，防止键合相流失,7.,不用的柱子要冲洗掉里面的缓冲液，用乙睛保存，避免高浓度的水和醇类。,3.5,色谱柱问题及解决办法,保留值与分离的重现性,1,.,选择色谱柱时，应考虑其化学性质,2,.,在流动相中用缓冲剂，以除去化学的或硅羟基效应，,尽量减少谱峰拖尾。,3.,保证温度，流速，压力和溶剂成分的恒定。,4.,流动相上机要脱气,5.,保证上样不超载,谱峰拖尾,柱外效应,4.,样品分离的系统方法,充分用已知样品结构确定以哪种方法开始,普通反相,?,离子抑制,?,离子对,?,还是其他,观察流动相条件改变时色谱峰的移动,根据变化的方向及大小决定下一步干什么,改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！,色谱柱的改变影响最大,4.1,分离前的准备,想办法得到各种信息,向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法,查文献，如,CA(,化学文摘,),仪器制造商的文献，如,Waters,对色谱柱有足够的了解,掌握分离机理，自己开发方法,充分了解您自己的样品,4.2,首先要了解的内容,分析前要知道：,灵敏度的要求有多高,?,样品的本底是否很复杂,?,有多少组份要分析,?,对分析的精确度、准确度等有多高要求,?,是否因是日常检验，而要求方法容易使用,?,分离的目的和要求：,要分离（即制备）的样品量有多大,?,要分离的组份在样品中的含量很高,?,还是微量,?,是否需要保持生物活性,?,对分离产物纯度的要求有多高,?,纯度或活性的鉴定如何完成,?,灵敏度的要求有多高,?,4.3,一般的具体步骤,先用一根短的色谱柱,用相对较高的流速,使用尽可能纯度高的标准品,先用高强度的洗脱液,调节,k,值改变保留值,调节,a,值改变选择性,调节柱长度改变柱效及分离速度,4.4,尽量采用文献方法,色谱柱填料的种类、品牌是否相同,?,注意文献方法的流动相,是否损害色谱柱,?,如色谱填料品牌不同，需要调整流动相,注意色谱柱的规格：内径、柱长,需要调整流速、进样量,注意梯度条件,了解系统的滞后体积（梯度）,4.5,反相色谱的方法开发,开发过程实例,色谱条件,色谱柱：,C18,，,4mm30mm,流动相：乙腈,/,水，不同的溶剂强度，,60/40,、,50/50,、,40/60,，由强渐弱,流速：,2ml/min,样品：,对羟基苯甲酸甲酯,(Methyl Paraben),对羟基苯甲酸丙酯,(Propyl Paraben),对羟基苯甲酸丁酯,(Butyl Paraben),反相色谱条件的改变,改变容量因子,K,改变色谱柱,改变选择性,a,：,通过改变流动相改变选择性,4.6,离子型化合物的分离方式,使用离子交换柱离子交换法,主要用于“强”阴、阳离子,使用反相柱,离子抑制色谱法,通过改变流动相的,pH,值，使样品成中性,离子对色谱法,加入“对离子”，使样品呈中性,4.7,离子抑制色谱,离子型化合物在反相色谱柱上不保留,改变流动相的,pH,值，抑制样品离子的电离,一些酸在,pH,低于,2,时还保持离子化,一些碱在,pH,高于,7,时还保持离子化,适用于弱酸性化合物的分离,降低流动相的,pH,值，使样品降低离子化,使用硅胶基质,C,18,填料,使用条件应在填料基质的范围内,硅胶柱的,pH,在,2-8,（较保险值,3-7,）内,4.8,离子对色谱法,在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂,与样品中可电离的组份形成“对离子”,在反相色谱柱上分离离子型化合物,离子对试剂的类型,PIC A,：磷酸季丁铵，适用于弱酸,PIC B,：烷基磺酸盐，适用于弱碱,烷基长度不同，形成对离子的能力不同,通常有：,B5,，,B6,，,B7,，,B8,PIC D4,：磷酸二丁胺，适用于弱碱,4.9,其它影响因素,流速对柱效的影响,不同内径的色谱柱有自己的最佳流速,样品的进样量,(,浓度,),对柱效的影响,样品的进样体积对柱效的影响,溶剂粘度对柱效的影响,以上因素均影响分离度,5.,梯度洗脱,定义：使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，,在洗脱过程连续或间断改变流动相的组成，以调节,它的极性，使每种流出的组分都有合适的容量因子,k,并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，,以适用的分离获得圆满的选择性分离。,适用于：当样品中的第一个组分的,k,值和最后一个组分的,k,值相差几十倍至上百倍时，使用梯度洗脱效果,特别好。,5.1,梯度洗脱的特点,优点,单位时间的分离能力增加,检测灵敏度提高,缺点,仪器设备要求高,不适合某些检测方式,柱需再生,定量分析的重复性较低,5.2,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,5.3,梯度洗脱的可变参数,A,及,B,液的成分和化学特性,梯度的陡度,梯度的变化形状,5.4,梯度曲线的变化凹线,梯度曲线的变化凸线,5.5,梯度条件的优化,5.6,梯度平衡时间的影响,5.7,有机污染物的影响,超纯水的有机物污染最少。尽量使用其做梯度洗脱,典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析,“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析,5.8,梯度方法开发实例,-,第一步,开发一个有,9,个烷基苯酮化合物的梯度方法，用,C18,柱，,在最初的条件下,(0-100%,水,-,乙腈,),，分离不理想。整个,色谱峰组保留时间太长，分离度也不好,梯度方法开发实例,-,第二步,为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（,50-100%,，水,-,乙腈），分离得到改善。但是,9,个化合物出了,10,个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的,梯度方法开发实例,-,第三步,梯度方法开发实例,-,第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂（共两个峰）中的第一个小峰对第,8,个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确,梯度方法开发实例,-,第五步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用,#5,曲线使,3-9,号峰提前,(,曲线,5,，,50-100%B),，但是小峰仍没有分出来,梯度方法开发实例,-,第六步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用,#5,曲线使,3-9,号峰提前，改用,50-95%B,见到好的现象,梯度方法开发实例,-,第七步,最后用,50-90%B,，曲线,4,，得到好的结果。,6.,定性和定量分析,定性和定量方法的建立及论证,对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、,偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳,定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定,的分析方法,6.1,色谱峰定性,鉴别每个色谱峰,通过比较保留值,(,通常是保留时间,),的方法，找到各色谱峰所对应的组份,大多数情况下用比较保留时间来定性,即所谓：,保留时间相同，可能是同样的组份,保留时间不同，肯定不是同样的组份,6.2,色谱峰的确认,用“标样”的保留值定出被测组份的位置,进一步的确认,标准加入,同时用其他方法,其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）,其他检测器,PDA,，光谱图比较、谱库检索,MS,，质谱图解析、谱库检索,其他仪器方法,6.3,定量分析的具体内容,确定样品的类型，主要成分,/,痕量成分,使分析条件的分离度（,R,）大于：,1.5,色谱峰的定性，峰一致性测定,检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围,用标样建立标准曲线,检查方法的准确度及精确度,用标样定期检查方法,6.4,痕量分析,如信,/,噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：,分析前浓缩样品,选择高灵敏度检测器,用衍生法,使色谱体系最优化,使用短的微径柱（减少样品的稀释）,使用高效色谱柱,使,k,值尽可能小,增加进样体积和浓度,使用低流速（,N,增加）,采用梯度淋洗,6.5,液相色谱定量精度的计算,测量精度的计算,6.6,常用的定量方法,峰面积百分比法,由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用,外标法,在液相色谱中用的最多,内标法,准确，但是麻烦,在标准方法中用的最多,6.7,峰面积百分比法定量,公式：,特点：,各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点,与进样量无关,不需标样,简单,6.8,外标法定量,配制一系列已知浓度的标样,外标法定量（二）,实际色谱图,外标法定量（三）,计算公式,特点,无需各组份都被检出、洗脱,需要标样,标样及样品测定的条件要一致,进样体积要准确,6.9,内标法定量（一）,配制一系列浓度的标样，其中加有内标样,内标法定量（二）,实际色谱图,标准曲线,内标法定量（三）,计算公式：,特点：,无需各组份都被检出、洗脱,需要标样，需要内标样,结果与进样体积无关,内标法定量（四）,对内标物的要求,化学结构与待测组分相似,(,同系物、异构体,),在样品中不存在,不与样品中组份发生任何化学反应,保留值与待测组分接近,浓度（响应值）与待测组分相当,其色谱峰与其他色谱峰分离好,6.10,定量校正曲线,曲线,A,：,因在零浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开,曲线,B,：,在此浓度内，检测器的响应值是非线性的,曲线,C,：,可接受的理想状态，实际情况应是其延长线到零点,曲线,D,：,表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能是样品制备时的损失,7,方法的完善：论证和移植,一个良好的论证方案，通常先进行那些重要的研究，,并预测将来的需要。,其次进行稳定性和普适性的全面研究（也就是移植）。,方法研究的各组成部分包括：准确度，精密度，,线性，范围，检测限，定量限，专属性。,7.1,论证标准（一）,1.,准确度,：测定值和真值的接近程度。,以回收实验表示和确定；（,1,）与参比标准品比较；（,2,）被测物,的标准品加入法；（,3,）回收测定掺入空白基质中的被测物,2.,精密度：重复该方法对均匀样品多次测定，各结果间,的一致程度。,（,1,）重复性 （,2,）中间精密度 （,3,）重现性,3.,线性：衡量响应值与浓度的校正曲线近似为一条直,线的程度。,4.,范围：方法有足够准确度，精密度和线性的最高和,最低浓度。,论证标准（二）,5.,检测限和定量限：被认为是任何方法的论证的重要组成部分。两者受分离条件的影响：色谱柱，试剂，尤其是仪器设备与数据系统。,6.,专属性：大多数方法中最重要的指标：可定义为在其它物质存在的条件下可准确测定被测物浓度的能力。,确保专属性的步骤,（,1,）掺入已知干扰物,（,2,）样品降解研究,（,3,）峰收集后，再用其它技术对其分析,（,4,）,使用另外的色谱分离模式,（,5,）改变该,HPLC,方法的条件（如溶剂或梯度）,7.2,方法移植,1.,方法的普适性：方法在实际应用条件下运行时，其结果的重现性。包括不同的分析人员，实验室，色谱柱，仪器，化学试剂和溶剂来源等等。,2.,稳定性：方法中使用的样品，标准品，试剂在一定时间内必须保持稳定。流动相和色谱柱的稳定。,已论证的方法要在其它实验室使用，因此要进行正式的方法移植或实验室间的交叉研究。其中一个重要内容是测定结果是否等同。,Thank you,！,