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第九章第九章 吸光光度法吸光光度法学时数：学时数：6学时学时2024/4/9 周二2第九章第九章 吸光光度法吸光光度法(Spectrometer)9.1 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理 1 物质对光的选择性物质对光的选择性吸收吸收 2 光的吸收基本光的吸收基本朗伯比尔朗伯比尔定律定律定义定义 3 偏离比尔定律的偏离比尔定律的原因原因9.2 目视比色法及光度计的基本部目视比色法及光度计的基本部件件 1 目视比色法目视比色法 2 光度计的基本部件光度计的基本部件9.3 显色反应及显色条件的显色反应及显色条件的选择选择 1 显色反应的选择显色反应的选择 2 显色条件的选择显色条件的选择 3 显色剂显色剂4 三元络合物在光度分析中三元络合物在光度分析中的应用特性简介的应用特性简介9.4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择 1 入射光波长的选择入射光波长的选择 2 参比溶液的选择参比溶液的选择 3 吸光度读数范围的吸光度读数范围的9.5 吸光光度法的吸光光度法的应用应用 1 高含量组分的测定高含量组分的测定示差法示差法 2 多组分分析多组分分析 3 光度滴定光度滴定 4 酸碱离解常数的测定酸碱离解常数的测定 5 双波长分光光双波长分光光 2024/4/9 周二3作业作业:P271:1、2、4、5、9、10、132024/4/9 周二4前前 言言n基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法吸光光度法。n包括包括比色法比色法、可见分光光度法可见分光光度法及及紫外分光光度法紫外分光光度法等。等。比色法比色法(Colorimetey)：比较颜色深浅来测定物质浓度的方法比较颜色深浅来测定物质浓度的方法。分光光度法分光光度法(Spectrophtometer)：应用分光光度计来进行比色分析的方应用分光光度计来进行比色分析的方法。（又称吸光光度法）法。（又称吸光光度法）n分光光度法特点：分光光度法特点：1 灵敏度高：灵敏度高：达达10-510-6 mol/L。适用于微量组分的测定。适用于微量组分的测定。2 准确度高：准确度高：相对误差为相对误差为2 5%，满足微量组分测定的要求，满足微量组分测定的要求 。3 速度快、仪器操作简单、价格便宜。速度快、仪器操作简单、价格便宜。4 应用广泛应用广泛:分析对象有无机物质和许多有机物质的微量成分。分析对象有无机物质和许多有机物质的微量成分。用于化学平衡等理论的研究。用于化学平衡等理论的研究。2024/4/9 周二59.1 9.1 吸收光度法基本原理吸收光度法基本原理(Basic Principle of Spectrophotometer)Basic Principle of Spectrophotometer)10.1.1 光的基本性质光的基本性质光的电磁波性质光的电磁波性质 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光2024/4/9 周二6光的波粒二象性光的波粒二象性波动性波动性粒子性粒子性 E光的折射光的折射光的衍射光的衍射光的偏振光的偏振光的干涉光的干涉光电效应光电效应E：光子的能量（光子的能量（J,焦耳）焦耳）：光子的频率（：光子的频率（Hz,赫兹）赫兹）：光子的波长（：光子的波长（cm）c：光速（光速（2.9979 1010 cm.s-1）h：Plank常数（常数（6.6256 10-34 J.s 焦耳焦耳.秒秒）2024/4/9 周二7单色光、复合光、光的互补单色光、复合光、光的互补 单色光单色光复合光复合光光的互补光的互补单一波长的光单一波长的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到到白光白光，那么就称这两种单色光为，那么就称这两种单色光为互补色光互补色光，这种，这种现象称为现象称为光的互补光的互补。蓝蓝黄黄紫红紫红绿绿紫紫黄绿黄绿绿蓝绿蓝橙橙红红蓝绿蓝绿2024/4/9 周二8表表1 物质颜色与互补光颜色的互补关系物质颜色与互补光颜色的互补关系物质颜色物质颜色（透射光）（透射光）吸收光吸收光颜色颜色波长波长/nm黄绿黄绿黄黄橙橙红红紫红紫红紫紫蓝蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿紫紫蓝蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿绿绿黄绿黄绿黄黄橙橙红红4004504504804804904905005004605605805806006006506507802024/4/9 周二99.1.2 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收(Selectivity Absorption)物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光2024/4/9 周二10 当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，于是当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，于是产生反射、散射、吸收或透射。产生反射、散射、吸收或透射。如下图如下图，如被照射的是均匀如被照射的是均匀溶液，则光的散射可以忽略。溶液，则光的散射可以忽略。界面界面反射反射损失损失入射光束入射光束透射光束透射光束界面界面反射反射损失损失溶液散溶液散射损失射损失2024/4/9 周二11物质对光吸收的本质物质对光吸收的本质一束光一束光能量能量分子分子+h(原子原子)M +h=M*(基态基态)(激发态激发态)分子分子(原子原子)(离子离子)基态基态能级能级1能级能级2能级能级3h2(E)h332h11 仅当照射光光子提供的能量仅当照射光光子提供的能量(h)与被照物质的基态与被照物质的基态与与激发态能量之激发态能量之差差EE相等相等时才能发生吸收。不同的物质微粒由于时才能发生吸收。不同的物质微粒由于结构不同结构不同而具有不同的而具有不同的量子化能级，其量子化能级，其能量差能量差也不相同。所以物质也不相同。所以物质对光的吸收具有选择性对光的吸收具有选择性。E=h物质或物质或溶液溶液2024/4/9 周二12吸收光谱或吸收曲线吸收光谱或吸收曲线(absorption,spectrum)固定被测物质的固定被测物质的浓度浓度和吸光和吸光厚度厚度，在不同的波长处测定其吸光度。，在不同的波长处测定其吸光度。以吸度为纵坐标，以测定波长为横坐标作图，即为吸收曲线。以吸度为纵坐标，以测定波长为横坐标作图，即为吸收曲线。定性分析与定量分析的基础定性分析与定量分析的基础定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收 不同物质吸收光谱不同不同物质吸收光谱不同 相同物质吸收光谱相同相同物质吸收光谱相同ABA 在一定条件下，物质对光的吸收在一定条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。与物质的浓度成正比。一定的物质，浓度增加，一定的物质，浓度增加，max不变，不变，吸收程度成比例增加吸收程度成比例增加A C增增大大2024/4/9 周二13吸收光谱吸收光谱 Absorption Spectrum纯纯 电子能态电子能态 间跃迁间跃迁S2S1S0S3h E2E0E1E3S2S1S0h A h h h 分子内电子跃迁分子内电子跃迁带状光谱带状光谱锐线光谱锐线光谱 A2024/4/9 周二14(a)(b)(c)(d)220 240 260 280 nm A0000(a)联苯联苯(己烷溶剂己烷溶剂)；一些典型的紫外光谱一些典型的紫外光谱(b)苯苯(己烷溶剂己烷溶剂)；(c)苯蒸汽；苯蒸汽；(d)Na蒸汽。蒸汽。2024/4/9 周二159.1.3 9.1.3 光的吸收基本定律光的吸收基本定律朗伯朗伯-比尔定律比尔定律A A：吸光度；吸光度；I I0 0：入射光强度；入射光强度；I I：透射光强度；透射光强度；k k1 1 ：比例常数；比例常数；b b：液层厚度液层厚度（光程长度（光程长度）17291729年，年，BouguerBouguer首先发现物质对光的首先发现物质对光的吸收吸收与吸光物质的与吸光物质的厚度厚度有关。有关。1760 1760年他的学生年他的学生LambertLambert更明确地指出：如果溶液的更明确地指出：如果溶液的浓度一定浓度一定，则光的，则光的吸吸收程度收程度与液层的与液层的厚度厚度成正比，这个关系称为成正比，这个关系称为朗伯定律朗伯定律。表示。表示 为为：一、吸光度一、吸光度(absorbance)入射光入射光 I0透射光透射光 Ib2024/4/9 周二16 18521852年，年，BeerBeer指出：光的吸收与吸光物质的指出：光的吸收与吸光物质的数量数量有关；如吸光物质溶有关；如吸光物质溶于不吸光的溶剂中，则吸光度与吸光物质的于不吸光的溶剂中，则吸光度与吸光物质的浓度浓度成正比。即成正比。即当单色光当单色光通通过液层厚度一定的过液层厚度一定的有色溶液有色溶液时，溶液的时，溶液的吸光度吸光度与溶液的与溶液的浓度浓度成正比。这成正比。这个关系称为个关系称为比尔定律比尔定律。式中式中c c：有色溶液浓度有色溶液浓度 k k2 2：比例常数比例常数2024/4/9 周二17 a-为为吸光系数吸光系数，单位为，单位为 L/g cm,b单位单位cm,c单位单位g/L。-为为摩尔吸光系数摩尔吸光系数，单位为，单位为 L/mol.cm,c单位为单位为mol/L两项合并得：朗伯两项合并得：朗伯-比尔定律比尔定律与与a 的关系的关系式中式中M为物质的摩尔质量。为物质的摩尔质量。经研究：当一束单色光，通过任何均匀、非散射的经研究：当一束单色光，通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质固体、液体或气体介质时，其吸光度与吸光厚度和物质浓度成正比。时，其吸光度与吸光厚度和物质浓度成正比。是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数特征常数，数值上等，数值上等于于1mol/L吸光物质在吸光物质在1cm光程中的吸光度，是吸光物质吸光能力的量度。光程中的吸光度，是吸光物质吸光能力的量度。它可作为定性鉴定参数，也可反映方法它可作为定性鉴定参数，也可反映方法灵敏度灵敏度。测定。测定波长不同时，波长不同时，不同不同。2024/4/9 周二18二、透光度二、透光度二、透光度二、透光度T(transmittance)T(transmittance)吸光度与透光率的关系吸光度与透光率的关系T：透光率透光率A：吸光度吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%2024/4/9 周二19四、四、工作曲线工作曲线工作曲线工作曲线 工作曲线又称工作曲线又称标准曲线标准曲线或或较正曲线较正曲线。绘制时先配制一系列具有不同。绘制时先配制一系列具有不同浓度吸光物质的浓度吸光物质的标准溶液标准溶液，然后在确定的波长和吸光厚度，然后在确定的波长和吸光厚度(光程光程)等条件等条件下，分别测量其下，分别测量其吸光度吸光度。以吸光度。以吸光度A为纵坐标为纵坐标，标准物质的浓度，标准物质的浓度c为横坐为横坐标标作图，即为工作曲线。作图，即为工作曲线。AccxAx 在多组分体系中，如果各种吸收物质之间在多组分体系中，如果各种吸收物质之间没有相互作用没有相互作用，体系的总吸，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和。光度等于各组分吸光度之和。三、吸光度的加和性：三、吸光度的加和性：三、吸光度的加和性：三、吸光度的加和性：2024/4/9 周二20例：例：Fe(II)的质量浓度为的质量浓度为5.010-4 g/L的溶液，与的溶液，与1，10-邻二氮杂菲反应，生成橙红邻二氮杂菲反应，生成橙红色配合物。该配合物在波长色配合物。该配合物在波长508nm，比色皿厚度为比色皿厚度为2cm时，测得时，测得A=0.19。计算计算1，2-邻二氮杂菲亚铁的邻二氮杂菲亚铁的 a 和和 解：解：已知已知 c=5.0 10-4 g/L,A=0.19,MFe=55.85或：或：2024/4/9 周二219.1.4 偏离朗伯比尔定律的原因偏离朗伯比尔定律的原因 实际测定时，标准曲线往往不成直线，如图实际测定时，标准曲线往往不成直线，如图4，发生正偏，发生正偏移或负偏移，这种现象称为对朗伯移或负偏移，这种现象称为对朗伯-比尔定律的偏移。比尔定律的偏移。一、物理因素一、物理因素LB定律基本假设：入射光为单色。定律基本假设：入射光为单色。实际上仪器发出的入射光是波长范围较窄的光带组成的复合光。实际上仪器发出的入射光是波长范围较窄的光带组成的复合光。设由设由1和和2两束光组成，其吸光度分别为两束光组成，其吸光度分别为A和和A”对对1对对2偏离的原因有：偏离的原因有：1 1 非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离2024/4/9 周二22 测定时入射光的总强度为测定时入射光的总强度为(I0+I”0）,透射光的总强度透射光的总强度 为为(I1+I2)，因此所得吸光度值为：因此所得吸光度值为：将将I1和和I2代入得：代入得：可见，可见，1=2 时，时，A=bc，A与与c成直线关系。成直线关系。如果如果12 ，A与与c则不成直线关系则不成直线关系。1，2 差别愈大，差别愈大，A与与c之间的线性关系偏离也愈大。之间的线性关系偏离也愈大。2024/4/9 周二23 尽量选取吸光度随波长变化不大的谱带尽量选取吸光度随波长变化不大的谱带A的复合光进行测的复合光进行测量，则量，则A随波长变化小，随波长变化小，的变化小，引起的偏离小的变化小，引起的偏离小，A与与c基基本为直线本为直线。若选用谱带。若选用谱带B的复合光进行测量，的复合光进行测量，的变化大，的变化大，A与与c的线性关系也差。的线性关系也差。选取谱带选取谱带A处作入射波长，还可保证吸光度最大，处作入射波长，还可保证吸光度最大，灵敏度灵敏度最好最好。故在选用入射光波长时，我们应考虑：故在选用入射光波长时，我们应考虑：2024/4/9 周二242 2、非平行入射光引起的偏离、非平行入射光引起的偏离 朗伯朗伯-比尔定律要求入射光比尔定律要求入射光平行垂直入射平行垂直入射。若入射光束。若入射光束为非平行光，可能导致工作曲线产生为非平行光，可能导致工作曲线产生正偏离正偏离。bb3 3、介质不均引起的偏离、介质不均引起的偏离 朗伯朗伯-比尔定律要求吸光物质溶液：比尔定律要求吸光物质溶液：均匀的、非散射的均匀的、非散射的。若溶液不均，如产生胶体或浑浊，当入射光通过该溶液时，若溶液不均，如产生胶体或浑浊，当入射光通过该溶液时，除了一部分光被吸收外，还有一部分因散射而损失，使实测的除了一部分光被吸收外，还有一部分因散射而损失，使实测的吸光度吸光度偏高偏高，从而使工作曲线产生，从而使工作曲线产生正偏离正偏离。2024/4/9 周二25 L-B定律的基本假设要求溶液中吸光质点是独立的，彼定律的基本假设要求溶液中吸光质点是独立的，彼此间此间无相互作用无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。，因此稀溶液能很好地服从该定律。高浓度时高浓度时(0.01 mol/L)，由于吸收组分粒子之间的由于吸收组分粒子之间的平均平均距离减小距离减小，相互相互影响邻近粒子的影响邻近粒子的电荷分布电荷分布，使吸光能力发，使吸光能力发生变化。生变化。即改变物质的即改变物质的摩尔吸光系数摩尔吸光系数()。其相互作用的程度与浓度有关，浓度增大，吸光度与浓其相互作用的程度与浓度有关，浓度增大，吸光度与浓度之间的关系偏离线性关系度之间的关系偏离线性关系越大越大。所以。所以一般认为比尔定律一般认为比尔定律仅适用于稀溶液。仅适用于稀溶液。二、化学因素引起的偏离二、化学因素引起的偏离1 1、高浓度引起的偏离、高浓度引起的偏离2024/4/9 周二26Cr2O72-+H2O=2H+2CrO42-（橙色橙色）（黄色黄色）L-B中浓度中浓度(c)应指吸光物质的应指吸光物质的平衡浓度平衡浓度，即吸光型体的平，即吸光型体的平衡浓度。衡浓度。实际常用吸光物质的实际常用吸光物质的分析浓度分析浓度。只有当平衡浓度。只有当平衡浓度等于或正比等于或正比于分析浓度于分析浓度时，其吸光度符合比尔定律。但溶液中吸光物质常时，其吸光度符合比尔定律。但溶液中吸光物质常因因缔合、离解、互变异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的缔合、离解、互变异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的相互作用相互作用等而形成新的化合物或改变吸光物质浓度，这些都将等而形成新的化合物或改变吸光物质浓度，这些都将导致偏离比尔定律。如导致偏离比尔定律。如2 2、化学反应引起的偏离、化学反应引起的偏离2024/4/9 周二279.2 9.2 目视比色法及光度计的基本部件目视比色法及光度计的基本部件c c1 1c c2 2c c3 3c c4 4以以眼眼睛睛比比较较溶溶液液颜颜色色的的深深浅浅以以测测定定物物质质含含量量的的方方法法，称称为为目目视视比比色色法法。常常用用的的目目视视比比色色法法是是标标准准系系列列法法比色管比色管优点优点：设备简单，操作简便，不要求有色溶液服从比尔定律，广泛设备简单，操作简便，不要求有色溶液服从比尔定律，广泛用于准确度要求不高的常规分析中。用于准确度要求不高的常规分析中。缺点缺点：准确度不高，如溶液中存在第二种有色物质，无法测定。许准确度不高，如溶液中存在第二种有色物质，无法测定。许多有色溶液不稳定，标准系列不能久存，经常用时配制，麻烦。多有色溶液不稳定，标准系列不能久存，经常用时配制，麻烦。c cx x一、一、目视比色法目视比色法2024/4/9 周二28二、光度计及基本部件二、光度计及基本部件 两种方法的测定原理相同，只是获得单色光的方法不同，前者用两种方法的测定原理相同，只是获得单色光的方法不同，前者用滤光滤光片片，后者用，后者用棱镜或光栅棱镜或光栅等单色器。等单色器。由于两者均基于吸光光度测定，统称为由于两者均基于吸光光度测定，统称为光度分析法光度分析法。国产分光光度计类型主要有：国产分光光度计类型主要有：72、721和和725型。其主要部件和光路示型。其主要部件和光路示意图如下。意图如下。光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测系统检测系统参比池参比池光电比色法光电比色法：使用使用光电比色计光电比色计测定溶液测定溶液A进行定量分析的方法进行定量分析的方法分光光度法分光光度法：使用使用分光光度计分光光度计测定溶液测定溶液A进行定量分析的方法进行定量分析的方法2024/4/9 周二292024/4/9 周二30比色池盒比色池盒2024/4/9 周二31紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计2024/4/9 周二32 光度计的基本部件和光学示意图光度计的基本部件和光学示意图1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212图图6 72型分光光度计光学系统图型分光光度计光学系统图 1-光源光源 2-进光狭缝进光狭缝 3-反光镜反光镜 4,7-透镜透镜 5-棱镜棱镜 8-出光狭逢出光狭逢 9-比色皿比色皿 10-光量调节器光量调节器 11-硒光电池硒光电池 12-检流器检流器2024/4/9 周二33各部件各部件的作用的作用及主要及主要性能性能1光源光源可见光区：可见光区：使用使用钨灯钨灯，加热到白炽时发出波长约，加热到白炽时发出波长约为为32032025002500nmnm的连续光谱。光强度与温度成正比，的连续光谱。光强度与温度成正比，一般工作温度为一般工作温度为2600260028702870K(K(熔点熔点3680K3680K)。温度与温度与电源电压有关，电压稳定，光强度稳定。电源电压有关，电压稳定，光强度稳定。近紫外光区：近紫外光区：使用使用氢灯或氘灯氢灯或氘灯，产生，产生180180375375nmnm连连续光谱。续光谱。2024/4/9 周二34将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。由棱镜或光栅等由棱镜或光栅等单色单色元件及狭缝和透镜组成。元件及狭缝和透镜组成。2 单色器单色器棱镜棱镜 棱镜单器由棱镜单器由棱镜、透镜和狭缝组棱镜、透镜和狭缝组成成。单色的纯度决定于棱镜的色散率。单色的纯度决定于棱镜的色散率和出射狭缝的宽度。和出射狭缝的宽度。玻璃棱镜对玻璃棱镜对40040010001000nmnm波长的光波长的光色散较大，适用于可见光分光光度计。色散较大，适用于可见光分光光度计。光栅光栅 光栅是利用光的衍射和干涉原光栅是利用光的衍射和干涉原理而进行分光作用。理而进行分光作用。具有色散均匀、工作波长范围具有色散均匀、工作波长范围宽、分辨率高等特点，一般用于中宽、分辨率高等特点，一般用于中高档仪器中。高档仪器中。2024/4/9 周二35滤光片三棱镜分光2024/4/9 周二36各部件各部件的作用的作用及主要及主要性能性能3吸吸收收池池有玻璃和石英两种。有玻璃和石英两种。可见光区可见光区：用无色透明、耐腐蚀的：用无色透明、耐腐蚀的玻璃玻璃比比色皿；色皿；紫外光区紫外光区：用：用石英石英比色皿。其厚度分别为比色皿。其厚度分别为 0.5、1、2、3 cm的长方形或园柱形。的长方形或园柱形。2024/4/9 周二374检测检测系统系统 测吸光度时，透过比色池的光强度先转为测吸光度时，透过比色池的光强度先转为电流，这种光电转换器件称为电流，这种光电转换器件称为检测器检测器。要求检。要求检测器对测定波长范围的光有快速、灵敏的响应。测器对测定波长范围的光有快速、灵敏的响应。且产生的光电流与光强度应成正比。且产生的光电流与光强度应成正比。光电比色计及可见光分光光度计常使用光电比色计及可见光分光光度计常使用硒硒光电池光电池或或光电管光电管作检测器，采用检流计作读数作检测器，采用检流计作读数装置，两者组成检测系统。装置，两者组成检测系统。123e-e-+e-4图图7 硒光电池示意图硒光电池示意图1-Fe片片 2-半导体硒半导体硒 3-金属薄膜金属薄膜 4-入射光线入射光线常用硒光电池，如图常用硒光电池，如图7。一般可产生一般可产生10-100A光光电流。电流大小与照射光电流。电流大小与照射光强度成正比。长时间强光强度成正比。长时间强光照射时，会产生照射时，会产生“疲劳疲劳”。具有。具有坚固、价廉和无需坚固、价廉和无需外接电源外接电源等等优点。优点。光电池光电池由一个阳极和一个光敏阴极由一个阳极和一个光敏阴极组成的真空二极管。阴极表组成的真空二极管。阴极表面镀有碱金属或碱金属氧化面镀有碱金属或碱金属氧化物等光敏材料，有足够能量物等光敏材料，有足够能量光子照射时，能发射电子。光子照射时，能发射电子。当两极间有电位差时，有电当两极间有电位差时，有电流。其大小与光照强度有关流。其大小与光照强度有关.为光电池的为光电池的1/4.光电管光电管光电二极光电二极管阵列管阵列2024/4/9 周二38三、分光光度计的类型三、分光光度计的类型单色器单色器参比池参比池R样品池样品池S检测器检测器光源光源1 单光束单光束单色器单色器RS检测器检测器光源光源2 双光束双光束I0It单色器单色器单单色色器器样品池样品池检测器检测器12光源光源123 双波长双波长2024/4/9 周二399.3 9.3 显色反应及显色条件的选择显色反应及显色条件的选择9.3.1 9.3.1 显色反应的选择显色反应的选择 待测组分转变为有色化合物的反应叫待测组分转变为有色化合物的反应叫显色反应显色反应。与待测组分反应形成。与待测组分反应形成有色化合物的试剂叫有色化合物的试剂叫显色剂。显色剂。显色反应可分为两大类：显色反应可分为两大类：络合和氧化还原络合和氧化还原反应。前者是主要的。反应。前者是主要的。1.灵敏度高灵敏度高 一般一般为为10104 410105 5时，可认为反应较灵敏。时，可认为反应较灵敏。2.选择性好选择性好 显色剂仅与一个组分或少数几个组分反应显色。显色剂仅与一个组分或少数几个组分反应显色。3.显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收 通常把两种有色物质最大吸收波长之通常把两种有色物质最大吸收波长之差称为差称为“对比度对比度”，一般要求显色剂与有色化合物的对比度，一般要求显色剂与有色化合物的对比度在在6060nmnm以以上上。显色剂应具备条件显色剂应具备条件:4.反应生成的有色化合组成恒定，化学性质稳定反应生成的有色化合组成恒定，化学性质稳定2024/4/9 周二401 1 显显色色剂剂用用量量图图8 吸光度与显色剂浓度的关系吸光度与显色剂浓度的关系Mo(V)与与SCN-反应情况就如图反应情况就如图8(3)。9.3.2 9.3.2 显色条件的选择显色条件的选择 M +R MR （待测组分）待测组分）（显显色剂）色剂）（有有色络合物）色络合物）2024/4/9 周二412 2 酸酸 度度 酸度改变引起酸度改变引起平衡移动平衡移动，影响显色剂及有色配合物的，影响显色剂及有色配合物的浓度浓度，还可能，还可能引起引起配位基团配位基团(R)数目的改变，数目的改变，从而改变溶液的颜色。从而改变溶液的颜色。酸度还与金属离子酸度还与金属离子水解水解有关。有关。适宜酸度范围是通过实验来选择的。适宜酸度范围是通过实验来选择的。3 3 显色显色温度温度显色反应一般在室温下进行，有时加热可使显色反应显色反应一般在室温下进行，有时加热可使显色反应完全，一般是通过实验找出适宜温度。完全，一般是通过实验找出适宜温度。4 4 显色显色时间时间大多数显色反应需要一定时间，时间长短有时与温度大多数显色反应需要一定时间，时间长短有时与温度有关，一般可由吸光度有关，一般可由吸光度时间关系曲线得到。时间关系曲线得到。R-+Mn+=MRn+H+HR显色剂显色剂有色配合物有色配合物ApH吸光度与吸光度与pHpH值关系值关系At吸光度与时间关系吸光度与时间关系2024/4/9 周二42 光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，都将干扰测定。生成有色化合物，都将干扰测定。消除方法：消除方法：(1)(1)加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色络合物或无色离子。络合物或无色离子。(2)(2)选择适当的显色条件以避免干扰。选择适当的显色条件以避免干扰。(3)(3)分离干扰离子。分离干扰离子。(4)(4)可选择适当的光度测定条件可选择适当的光度测定条件(波长和参比波长和参比)，消除干扰离子，消除干扰离子的影响。的影响。5 5、干扰的消除、干扰的消除2024/4/9 周二439.3.3 显色剂显色剂无机显无机显色剂色剂与金属离子生成的配合物不稳定，灵敏度和选择性不高，应用不与金属离子生成的配合物不稳定，灵敏度和选择性不高，应用不多。多。与金属离子可形成螯合物，显色反应与金属离子可形成螯合物，显色反应 的选择性和灵敏度都较无机的选择性和灵敏度都较无机 显色反应高。研制高灵敏度和选择性的显色剂仍是吸光光度法研显色反应高。研制高灵敏度和选择性的显色剂仍是吸光光度法研 究中的重要课题。究中的重要课题。有机显色剂一般都含有有机显色剂一般都含有生色基团生色基团和和助色基团助色基团。生色基团生色基团是指某些是指某些含不饱键含不饱键的基团。如偶氮基的基团。如偶氮基(-N=N-)、醌基、亚硝基醌基、亚硝基(-N=O)、硫羰基硫羰基(=C=S)等基团。等基团。助色基团助色基团是某些含孤对电子的基团，如是某些含孤对电子的基团，如-NH2、-NR2、-OH、-OR、-SH、-Cl及及-Br等，影响生色基团对光的吸收，使产物的等，影响生色基团对光的吸收，使产物的max向长波方向移向长波方向移动，颜色加深。这种现象称为动，颜色加深。这种现象称为“红移红移”。其影响见表。其影响见表3。有机显有机显色剂色剂表表3 铁（铁（III）与有与有助色团和无助色团助色团和无助色团的有机试剂反应所的有机试剂反应所得产物颜色的比较得产物颜色的比较2024/4/9 周二44有机显色剂的类型有机显色剂的类型1。偶氮类显色剂。偶氮类显色剂：分子中含有偶氮基。这类化合物都是有色的。具有分子中含有偶氮基。这类化合物都是有色的。具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性质稳定、显色反应灵敏度高、选择 性好、对比度大等优点。是目前应性好、对比度大等优点。是目前应用最为广泛的一类显色剂。如偶氮胂用最为广泛的一类显色剂。如偶氮胂III和和PAR。偶氮伸偶氮伸III 偶氮胂偶氮胂特别适合于特别适合于铀、钍、锆等元素总量铀、钍、锆等元素总量的测定。其衍生物偶氮氯的测定。其衍生物偶氮氯膦膦III是我国目前广为采用的测定微量稀土元素的较好的试剂。是我国目前广为采用的测定微量稀土元素的较好的试剂。PAR在不同条件下，与很多金属离子生成红色或紫红色的络合物，在不同条件下，与很多金属离子生成红色或紫红色的络合物，如用于如用于银、银、Hg、Ga、U、钢铁中的铌、钒、锑等元素钢铁中的铌、钒、锑等元素的比色测定。也应的比色测定。也应用于三元配合物。用于三元配合物。PAR：4-(2-吡啶偶氮吡啶偶氮)-间苯二酚间苯二酚2024/4/9 周二45铬天青铬天青S结构式结构式2。三苯甲烷类显色剂：。三苯甲烷类显色剂：这是一类应用很广的分析试剂，种类很多。这是一类应用很广的分析试剂，种类很多。铬天青可与许多金属离铬天青可与许多金属离子形成三元配合物，用于吸光度测定，常用来测铍和铝子形成三元配合物，用于吸光度测定，常用来测铍和铝。2024/4/9 周二46多元配合物及应用特性简介多元配合物及应用特性简介特性特性1、比较稳定，可提高分析测定的准确度和重现性。比较稳定，可提高分析测定的准确度和重现性。2、对光有较大的吸收容量，进行光度测定时，它比二元络合物具有更高的、对光有较大的吸收容量，进行光度测定时，它比二元络合物具有更高的灵敏度和更大的对比度。灵敏度和更大的对比度。3、形成三元配合物的显色反应比二元体系具有更高的选择性。、形成三元配合物的显色反应比二元体系具有更高的选择性。多元络合物是多元络合物是三种或三种以上的组分三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配体所形成的三元络合物。的是由一种金属离子与两种配体所形成的三元络合物。1、三元混配配合物、三元混配配合物2、离子缔合物、离子缔合物3、金属离子、金属离子-络合剂络合剂-表面活性剂体系表面活性剂体系4、杂多酸、杂多酸其主要类型其主要类型2024/4/9 周二479.4 9.4 吸光度测定条件的选择吸光度测定条件的选择一、入射光波长的选择一、入射光波长的选择原则：原则：1、最大吸收、最大吸收max 2、吸收最大，干扰最小、吸收最大，干扰最小A配合物配合物显色剂显色剂max配合物配合物显色剂显色剂二、参比溶液的选择二、参比溶液的选择 测定时，用参比溶液调节仪器零点，可消除由于吸收池壁及溶剂对入射测定时，用参比溶液调节仪器零点，可消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并扣除干扰的影响。光的反射和吸收带来的误差，并扣除干扰的影响。参比类型：参比类型：1、纯溶剂作参比纯溶剂作参比。(只有待测物质与显色剂的只有待测物质与显色剂的反应产物反应产物有吸收有吸收)2、试剂空白作参比试剂空白作参比。(除试样外的其它溶剂除试样外的其它溶剂)3、试样溶液作参比试样溶液作参比。(显色剂无吸收，试样中显色剂无吸收，试样中其它组分其它组分有吸收，但不与有吸收，但不与显色剂反应显色剂反应)此时此时通过参比溶液通过参比溶液的透射光的透射光2024/4/9 周二48三、吸光度读数范围的选择三、吸光度读数范围的选择0 20 40 60 80 100 0.10.30.200.50.41.00.6 1.5AT 在不同吸光度范围内读数对测定带来不同程度的误差。可推证如下：在不同吸光度范围内读数对测定带来不同程度的误差。可推证如下：设试液服从比尔定律，设试液服从比尔定律，微分，得：微分，得：(2)/(1)，整理后得，整理后得：以有限值表示，可写为：以有限值表示，可写为：(2)(1)式中：式中：c/c表示浓度的相对误差表示浓度的相对误差;T表示透光度的读数误差表示透光度的读数误差.即浓度的相对误差取决于透光率的读数误差即浓度的相对误差取决于透光率的读数误差T和透光度和透光度T的大小。的大小。2024/4/9 周二49假设假设T为常数，上式可以写为：为常数，上式可以写为：当当T=36.8%T=36.8%时，时，A=0.434A=0.434时测量误差最小。百分透光度在时测量误差最小。百分透光度在101080%80%（即（即A A在在0.10.11.01.0）范围内的）范围内的C/CC/C比较小。因此测定时应使被测试液的吸光度在比较小。因此测定时应使被测试液的吸光度在此范围内才能得到较好的结果。此范围内才能得到较好的结果。C/C与与T的关系的关系C/C0.368T2024/4/9 周二509.5 9.5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用 主要用于主要用于微量组分微量组分的测定，也用于高含量组分的测定、的测定，也用于高含量组分的测定、多组分分析及化学平衡、络合物组成等理论研究。多组分分析及化学平衡、络合物组成等理论研究。一、高含量组分的测定一、高含量组分的测定示差法示差法方法原理方法原理：若测定试液浓度为若测定试液浓度为(Cx)，用，用稍低于稍低于试液浓度的试液浓度的(Cs)标准溶液作标准溶液作参参比溶液比溶液，调节仪器透光度读数为，调节仪器透光度读数为100%（A=0)，然后测定其吸光度然后测定其吸光度(Ar)(相对相对吸光度吸光度)，对应的透光率称相对透光率，对应的透光率称相对透光率(Tr)，则有：则有：示差法要求示差法要求：仪器光源有足够的发射强度或能增大光电流放大倍数仪器光源有足够的发射强度或能增大光电流放大倍数,以便以便能调节参比溶液透光率为能调节参比溶液透光率为100%。100%T%Tr%TS%普通光度法普通光度法示差光度法示差光度法Tx%2024/4/9 周二51二、多组分分析二、多组分分析(1)吸收光谱不重叠吸收光谱不重叠，或至少可以找到某一波长时，或至少可以找到某一波长时X有吸收而有吸收而Y不吸收，在不吸收，在另一波长时，另一波长时，Y吸收而吸收而X不吸收。不吸收。如图如图12-1，可分别在波长，可分别在波长1和和2时，测定组分时，测定组分X和和Y而相互不干扰。而相互不干扰。(2)吸收光谱重叠：吸收光谱重叠：找出两个波长，在该波长下，二组分的找出两个波长，在该波长下，二组分的A较大，如图较大，如图12-2，在波长，在波长1和和2时测定吸光度时测定吸光度A1和和A2，由加和性得方程式：由加和性得方程式：解方程可得：解方程可得：cx 和和 cy 假定溶液中同时存在两种组分假定溶液中同时存在两种组分X和和Y，它们的吸收光谱一般有如下两它们的吸收光谱一般有如下两种情况：种情况：2024/4/9 周二52三、络合物组成及稳定常数的测定三、络合物组成及稳定常数的测定1 1、摩尔比法、摩尔比法M+nL MLn 固定固定Cm，逐渐增加，逐渐增加CL，测定一系列测定一系列Cm一定、一定、CL不同的溶液的吸光不同的溶液的吸光度度A。以以A为纵坐标，为纵坐标，CL/Cm为横坐标作图为横坐标作图。当当CL/CMn时，时，A不再改变。不再改变。两条切线的交点所对应的横坐标两条切线的交点所对应的横坐标CL/CM比值为比值为n，则络合物的络合比为则络合物的络合比为1:n。122024/4/9 周二532 2、等摩尔连续变化法、等摩尔连续变化法方法原理：方法原理：保持保持(cM+cR)一定，连续改变一定，连续改变cR/cM，配制出一系列显色溶液，分，配制出一系列显色溶液，分别测定系列溶液的吸光度别测定系列溶液的吸光度A，以，以A对对cM/(cM+cR)作图作图(下图下图)。曲线的折点所对应的曲线的折点所对应的cR/cM值就等于络合物的络合比值就等于络合物的络合比n。当络合物较稳。当络合物较稳定时，曲线的折点明显，反之，则应用切线外推法得