水中大肠杆菌的检测方法.doc

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水中大肠杆菌群检测措施－多管发酵法
NIEA E201.54B
一、 措施概要
本措施系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不一样体积或不一样稀释度之水样所产生之成果，以「100 mL水中最大也许数（MPN/100 mL）」表达 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。
二、 合用范围
本措施合用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检查。
三、 干扰
(一) 水样中具有克制或增进大肠杆菌群细菌生长之物质。
(二) 检测使用旳玻璃器皿及设备具有克制或增进大肠杆菌群细菌生长旳物质。
四、 设备
(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。
(二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。
(三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。
(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。
(五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。
(六) 锥形瓶：200至2023 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。
(七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。
(八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。
(九) 天平：待测物重量不小于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不不小于2 g时，须能精秤至0.001 g。
(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。
(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在 121℃（压力约15 lb/in2 或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
(十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用品之灭菌，温度须能保持在 160℃达2小时或170℃达1小时以上者。
(十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，合用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。
(十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。
五、 试剂
(一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在 25 ℃时不不小于2 μ mho / cm（μS / cm）。
(二) 培养基，应使用市售商品化培养基。
１、 硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST）
　　 1倍浓度LST培养基具有下列成分：
胰化蛋白胨（Tryptose） 　　　　　　　　　20.0g
乳糖（Lactose） 　　　　　　　　　　　　　5.0g
氯化钠（NaCl） 　 　　　　　　　　　　　　5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 　 　　　　　　　　2.75g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 　 　　　　　　　　2.75g
硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate） 　　　　0.1g
试剂水 　　　　　　　　　　　　　　　　　　1L
　　　　配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保留在4 ± 2℃，保留期限为14天。可根据检查需求量，依配方配制培养基。
２、 煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB）
　　 1公升旳BGLB 培养基中具有下列成分：
蛋白胨（Peptone） 　　　　　　　　　　　　10.0g
乳糖（Lactose） 　　　　　　　　　　　　　10.0g
牛胆粉（Oxgall Powder） 　　　　　　　　　　20.0g
煌绿色试剂（Brilliant Green） 　 　　　　　　0.0133g
试剂水 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　1L
　　　　取40 g BGLB培养基粉末溶于1 L试剂水，完全溶解后，分取5至10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，其pH值应在7.2 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保留在4 ± 2℃，保留期限为14天。可根据检查需求量，依配方配制培养基。
(三) 无菌稀释液
１、 磷酸二氢钾储备溶液
　　　　取3.4 g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于50 mL旳试剂水中，俟完全溶解后，以1.0 N NaOH 溶液调整其pH值为7.2 ±0.1，然后加试剂水至100 mL，灭菌（过滤灭菌或121 ℃高温高压灭菌15分钟）后储存于冰箱中备用。4 ± 2 ℃下保留期限为3个月。
２、 氯化镁储备溶液
　　　　取8.1 g氯化镁（MgCl2‧6H2O），先溶于少许试剂水，俟完全溶解后，再加试剂水至全量为100 mL，灭菌（过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟）后，储存于冰箱中备用。4 ± 2 ℃下保留期限为3个月。
３、 无菌稀释液
　　　　分别取10 mL氯化镁储备溶液和2.5 mL磷酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至2,000 mL，混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121℃灭菌15分钟，作为无菌稀释液备用。如欲用于水样稀释，分装之无菌稀释液灭菌后体积须为90 ± 2.0 mL。4 ± 2 ℃下保留期限为3个月。
六、 采样与保留
 (一) 盛装水样检查微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋，且于采样时应防止受到污染。水样若具有余氯时，无菌容器中应加入适量之无菌硫代硫酸钠（采用加氯之废水时，每100 mL水样中加入0.1 mL、10%硫代硫酸钠可还原15 mg/L余氯。采用含氯之饮用水水样时，每100 mL之水样如加入0.1 mL之3%硫代硫酸钠，可中和之余氯量约为5 mg / L。）。
(二) 采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。
(三) 运送时水样温度应维持在不不小于10 ℃且不得冻结，而试验室内保留温度应维持在4 ± 2 ℃。
(四) 水样应于采样后24小时内完毕推定试验之水样添加环节（七、环节(一)４、），并置入培养箱中培养。
(五) 水样量须以能做完所需检查为度，但不得少于120 mL。
七、 环节
试验分两阶段进行。首先进行推定试验，若推定试验成果为阳性反应，则继续进行第二阶段之确定试验，如成果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在。各试验环节如下述：
(一) 推定试验
１、 慎选发酵管中没有气泡且未污染之10 mL、2倍浓度LST试管。
２、 水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇摆25次以上，以使样品充足混摇均匀。
３、 视水样中微生物也许浓度范围进行水样稀释环节，使用无菌吸管吸取10 mL水样至90 mL无菌稀释液中，形成10倍稀释度水样，混合均匀，而后自10倍稀释度水样以相似操作方式进行一系列合适之100、1000、10000倍等稀释水样，进行稀释环节时，均需更换无菌稀释吸管，水样稀释环节如图一所示（注1）。
４、 以无菌吸管分别取各稀释度10 mL水样至内含10 mL 2倍浓度旳LST试管中，每一稀释度各作5支，小心混合均匀，混合后发酵管内不可产生气泡。
５、 在35 ± 1℃培养箱中培养48 ± 3小时，观测并记录发酵情形，若有气体产生则推定试验为阳性反应，若无气体产生则推定试验为阴性反应，但若培养液呈混浊状态，虽无产气，亦应进行确定试验。
(二) 确定试验
若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，则使用BGLB进行确定试验：
１、 慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。
２、 运用无菌接种环自产生气体以及混浊之LST培养基试管中，接种一圈培养液至BGLB培养基试管中。
３、 在35 ± 1℃培养箱中培养48 ± 3小时。
４、 在48 ± 3小时内，BGLB 培养基试管如有气体产生，则确定试验为阳性反应。
八、成果处理
(一) 经确定试验确认BGLB试管为阳性反应后，应以「100 mL水中最大也许数（MPN/100 mL）」计算及记录。5支发酵管持续三种稀释度之MPN可查表一。
(二) 表一所示接种之水样量为10 mL、1.0 mL 及0.1 mL，若所用之稀释度有三种以上时，采用最具意义之三种稀释度，查表后再计算100 mL水中大肠杆菌群最大也许数。稀释度之选用方式如下：
１、 先选用5管均呈阳性反应旳最高稀释度（此时稀释度较低之各组试管必须所有呈阳性反应），再选用下两个稀释度（如表二水样别a）。
２、 假如稀释度最低旳一组并非5管均呈阳性反应，则选用稀释度最低旳一组，再选用下两个稀释度（如表二水样别b、c）。
３、 假如根据上述原则（１、及２、）选用3个稀释度后，下一稀释度试管组仍有阳性反应试管，则舍弃原先3组中稀释度最低旳一组，纳入下一稀释度旳数据（如表二水样别d）。
４、 假如根据上述原则（１、至３、）选用3个稀释度后，更高稀释度之试管组仍有阳性反应试管，则把更高稀释度之阳性反应试管数加至原先3组中稀释度最高旳一组（如表二水样别e）。
(三) 100 mL水中大肠杆菌群最大也许数（MPN/100 mL）之计算公式如下：

成果不不小于100时，以整数表达（小数字数四舍五入），菌落数不小于100以上时，只取两位有效数字：例如110以1.1 × 102表达，16,000以1.6 × 104表达。
(四) 检测纪录须注明采样时间、培养起始及终了时间、培养基名称、培养温度及各稀释度旳数据等有关数据。
九、 质量管理
(一) 微生物采样人员及检测人员应具有微生物基本训练及知识。
(二) 每批次采样时应进行运送空白。
(三) 每批次或每10个水样需进行试剂空白试验。
 (四) 新购入之培养基，每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株（如E. coli、Enterobacter aerogenes、Citrobacter freundii）进行测试，以保证数据质量。
(五) 若一季期间水样均未检出大肠杆菌群，则须以大肠杆菌群菌株进行培养基测试，以保证数据质量。
(六) 本措施培养所得之细菌也许具有感染性，检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。
十、 精密度及精确度
略
十一、 参照数据
 (一) APHA. 2023. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9221. American Public Health Association, Washington, D.C.
 (二) Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. 2023. BD Diagnostic Systems.

注1： 水样如须稀释，提议于稀释后30分钟内完毕检测环节，以免导致细菌死亡或增生，影响试验成果。

图一　水样稀释环节

表一
三持续稀释度（10 mL、1 mL、0.1 mL）五试管反复测试时，阳性成果组合之MPN指数及95%信赖区间
阳性反应组合
MPN/100 mL
95%信赖区间
阳性反应组合
MPN/100 mL
95%信赖区间
下限
上限
下限
上限
0-0-0
<1.8
—
6.8
4-0-3
25
9.8
70
0-0-1
1.8
0.090
6.8
4-1-0
17
6.0
40
0-1-0
1.8
0.090
6.9
4-1-1
21
6.8
42
0-1-1
3.6
0.70
10
4-1-2
26
9.8
70
0-2-0
3.7
0.70
10
4-1-3
31
10
70
0-2-1
5.5
1.8
15
4-2-0
22
6.8
50
0-3-0
5.6
1.8
15
4-2-1
26
9.8
70
1-0-0
2.0
0.10
10
4-2-2
32
10
70
1-0-1
4.0
0.70
10
4-2-3
38
14
100
1-0-2
6.0
1.8
15
4-3-0
27
9.9
70
1-1-0
4.0
0.71
12
4-3-1
33
10
70
1-1-1
6.1
1.8
15
4-3-2
39
14
100
1-1-2
8.1
3.4
22
4-4-0
34
14
100
1-2-0
6.1
1.8
15
4-4-1
40
14
100
1-2-1
8.2
3.4
22
4-4-2
47
15
120
1-3-0
8.3
3.4
22
4-5-0
41
14
100
1-3-1
10
3.5
22
4-5-1
48
15
120
1-4-0
10
3.5
22
5-0-0
23
6.8
70
2-0-0
4.5
0.79
15
5-0-1
31
10
70
2-0-1
6.8
1.8
15
5-0-2
43
14
100
2-0-2
9.1
3.4
22
5-0-3
58
22
150
2-1-0
6.8
1.8
17
5-1-0
33
10
100
2-1-1
9.2
3.4
22
5-1-1
46
14
120
2-1-2
12
4.1
26
5-1-2
63
22
150
2-2-0
9.3
3.4
22
5-1-3
84
34
220
2-2-1
12
4.1
26
5-2-0
49
15
150
2-2-2
14
5.9
36
5-2-1
70
22
170
2-3-0
12
4.1
26
5-2-2
94
34
230
2-3-1
14
5.9
36
5-2-3
120
36
250
2-4-0
15
5.9
36
5-2-4
150
58
400
3-0-0
7.8
2.1
22
5-3-0
79
22
220
3-0-1
11
3.5
23
5-3-1
110
34
250
3-0-2
13
5.6
35
5-3-2
140
52
400
3-1-0
11
3.5
26
5-3-3
170
70
400
3-1-1
14
5.6
36
5-3-4
210
70
400
3-1-2
17
6.0
36
5-4-0
130
36
400
3-2-0
14
5.7
36
5-4-1
170
58
400
3-2-1
17
6.8
40
5-4-2
220
70
440
3-2-2
20
6.8
40
5-4-3
280
100
710
3-3-0
17
6.8
40
5-4-4
350
100
710
3-3-1
21
6.8
40
5-4-5
430
150
1100
3-3-2
24
9.8
70
5-5-0
240
70
710
3-4-0
21
6.8
40
5-5-1
350
100
1100
3-4-1
24
9.8
70
5-5-2
540
150
1700
3-5-0
25
9.8
70
5-5-3
920
220
2600
4-0-0
13
4.1
35
5-5-4
1600
400
4600
4-0-1
17
5.9
36
5-5-5
>1600
700
—
4-0-2
21
6.8
40

表二
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　判读阐明
水样别
水样体积（mL）
阳性反
应组合
成果
（MPN/
100mL）
10
1
0.1
0.01
0.001
a
5/5
5/5
2/5
0/5
0/5
5-2-0
4.9×102
b
4/5
5/5
1/5
0/5
0/5
4-5-1
48
c
0/5
1/5
0/5
0/5
0/5
0-1-0
2
d
5/5
4/5
4/5
1/5
0/5
4-4-1
4.0×102
e
5/5
4/5
4/5
0/5
1/5
4-4-1
4.0×102