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标准菌株使用标准操作规程

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2020年4月19日
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标准菌株使用标准操作规程
1 检验目的
对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。
2 范围
微生物实验室保存的标准菌株。
3 职责
微生物组工作人员正确执行本操作规程。
4 术语和定义
4.1标准菌株
其特征进行了分类和描述，有明确的来源。ATCC（American Type Culture Collection）美国标准菌株收藏中心。
4.2标准储备菌株
标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。
4.3 工作菌株
标准储备菌株传代后得到的同种菌株。
4.4 标准培养物
标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。
4.5质控菌株
ATCC最佳，但当无法获得时能够使用ATCC演化的菌株或中国国家菌种库储存的标准菌株。特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌株。室间质评的菌株即可。
5 保存程序
5.1标准菌株
5.1.1商业购买的ATCC标准菌株干粉，-80℃低温保存，能够2年以上。安瓿真空包装的，-80℃可长期稳定保存。将标准菌株进行编号和登记。
5.1.2复苏
用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。酵母菌要求3天，形成孢子的微生物宜保存孢子。
5.2标准储备菌株
5.2.1由复苏后的ATCC标准菌株制备。复苏后的标准菌株要检查其纯度，必要时进行生化试验检查。刮取培养物上的菌体，用足量的菌悬浮于防冻培养基中。防冻液能够是无菌脱纤维羊血、10%甘油肉汤。储存足够量的标准储备菌株，可用1-2年。一年52周需要52支以上。
5.2.2甘油肉汤保存法
成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。相当于20%的甘油。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌能够适当增加菌量。-80℃保存。除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。保存期限1-5年。
5.2.3全血保存法
成分为脱纤维羊血。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌能够适当增加菌量。-80℃保存。主要用于保存链球菌、嗜血杆菌及厌氧菌。保存期限1-5年。
5.2.4标准储备菌株进行编号和登记。
5.3工作标准菌株
由标准储备菌株传代得到的菌株。标准储备菌株对多向下传三代。过多的传种会增加变异的机会。标准储备菌株根据菌种特点选择适宜的培养基和培养条件进行培养18-24h即工作标准菌株。储存在2-8℃，可放四周。个别营养要求高的为2周，例如肺炎链球菌和嗜血杆菌。使用时应编号并登记。
5.4编号方法
每个菌的保存管都要有唯一的编号，签字笔标注，便于查找和管理。
来源
数字
意义
购买的标准菌株
1501ATCC25922
第1株ATCC25922
储备标准菌株
1501ATCC25922-3
由1501ATCC25922传代而来的3号标准储备菌株
5.5记录管理
5.5.1菌种应有严格的登记。每个编号都要有详细的记录包括来源、传代、保存方法、使用记录、使用原因、高压灭菌记录等。附表《标准菌株记录表》《标准储备菌株记录表》
5.5.2菌种保管应有专人负责，保存于专用冰箱中，双人双锁，确保菌种安全。保管人员变动时，必须严格交接手续。
5.5.3各种菌种应按规定时间接种，注意菌种有无污染及变异，如发现变异时，应及时更换
5.5.4一个使用周期结束后，标准菌株、储备菌株、工作菌株都要进行高压灭菌处理，并做好记录。
6 使用流程
购买的标准菌株，编号，-80℃保存

用完第二天高压灭菌
标准菌株

性能验证
复苏接种合适的培养基，孵育出菌落

挑取典型的菌落到合适的稳定剂中，编号，-80℃保存，准备n支

标准储备菌株

月质控
周质控
日质控

每月取出一支标准储备菌株传种合适的培养基，适宜条件孵育出菌落
每周取出一支标准储备菌株传种合适的培养基，适宜条件孵育出菌落
传代培养物
每周取出一支标准储备菌株传种合适的培养基，适宜条件孵育出菌落

储备菌株管用完第二天高压灭菌

直接作为工作菌株使用，第二天高压灭菌
传代培养物能够作为第一天的工作菌株使用。4℃保存。以后6天用。

也能够用最后一天的的工作菌株作为传代培养物继续使用一周。
以后的6天每天都用传代培养物传一个新的菌株，作为工作菌株使用。工作菌株使用后第二天高压灭菌

7天后传代培养物作废，进行高压灭菌

重新取一直标准储备菌株传种，进入下一轮周期，程序如上面几个步骤

购买的标准菌株（可追溯来源，卫生部室间质评菌株可作为质控菌株使用，按照标准菌株管理）

0代

接种传代培养一次，并进行纯度和生化鉴定

1代
作为“储存标准菌株”进行多个分装保存，按照特定条件储存和推荐的储存时间

每天传代平板作为第二天的工作标准菌株，进行室内质控，用完马上高压处理

2代

进行纯度检查和生化鉴定。作为传代物或者第一支“工作菌株”特定的储存条件和推荐储存时间

能够再重复一周，规则同上。但一般来说工作菌株不能超过3代
室内质控

7 质量控制
7.1 观察菌落的典型形态是否符合菌种。有没有杂菌生长。
7.2用氧化酶、触酶、上机等生化试验，鉴定菌种有没有变化。
7.3如果有污染或怀疑有问题时，应准备新的首次传代物或者获取新的标准菌株。
8 参考文献
序号
唯一性编号
文献名称
9.1
ISBN978-7-117-19862-2/R·19863
《全国临床检验操作规程》第四版
9.2
ISBN978-7-5478-1226-6/R·395
《临床微生物学诊断与图解》第三版
9.3
GBT 27405-
实验室质量控制规范 食品微生物检测
9.4
SNT 2632-
微生物菌种常规保藏技术规程
9.5
WST232-
商业微生物培养基质量检测规程