杂交棉与亲本的基因差异表达毕业设计论文.doc

石河子大学本科毕业论文

杂交棉与亲本的基因差异表达

学 院： 生命科学学院
专 业： 生 物 技术
班 级： 生技2010-2班
学 号：
学生姓名：
指导教师：

中国·新疆·石河子
二〇一四年六月

12
石河子大学本科毕业论文 杂交棉与亲本的基因差异表达
杂交棉与亲本的基因差异表达

摘要 杂种优势是指两个性状不同的亲本杂交产生的杂种后代在生长势，生活力，繁殖力，适应性以及产量，品质等性状方面超过双亲的现象。通过实验室培养箱种植棉花，测定北疆棉区高产杂交棉新陆早43号及其亲本苗期（三片真叶期）的干物质重量，发现新陆早43号苗期杂种优势表现明显，其干物质的量明显高于双亲；采用cDNA-AFLP（扩增片段长度多态性）技术，扩增杂交棉新陆早43号及其亲本的基因，发现差异片段明显，表明杂交棉和亲本之间基因表达存在明显差异，新陆早43号杂交棉的杂种优势与其亲本的基因的差异表达有关。

关键词 新陆早43号； 杂种优势； 基因差异表达

Differential expression gene in hybrids cotton and parents
Abstract: Heterosis refers to produce F1 hybrid fecundity traits of two different hybrids in growth, life force,adaptability and yield, quality and other characters than the parents phenomenon. Incubator cotton through laboratory, determination of North Xinjiang cotton high yield hybrid cotton Xinluzao 43 and its parents at seedling stage (three leaf stage) and the dry matter weight, found that performance Xinluzao 43 seedling heterosis, the dry matter weight was significantly higher than that of parents; using cDNA-AFLP technology, amplification of hybrid cotton Xinluzao 43 and its parental gene fragments, found that obvious, between hybrid cotton and parental gene expression differences, differences in Heterosis of hybrid cotton Xinluzao 43 and its parental gene expression.
Key words: Xinluzao 43；Heterosis ; Differential Expression gene

前 言
杂种优势可以大幅度提高农作物的产量、品质和抗逆性，具有巨大的经济效益和社会效益。利用杂种优势也较易将高产、优质和抗逆几者结合起来，组合选配周期短，能较快满足棉花产量提高和纺织工业改进对棉纤维的需要。随着耕地不断减少，粮棉争地矛盾突出，对棉花高产研究是形势所需。杂交棉可显著提高棉花产量，棉花杂种一代平均每公顷增产15%左右，使棉花单产显著上升，为棉花增产起着至关重要的作用。自杂交棉种植以来，其种植面积逐年上升，杂交棉的利用已经成为进一步提高棉花产量的重要途径。因此，迫切需要研究棉花杂种优势的高产机理以促进优良杂交棉的选育利用。
棉花杂种优势是客观存在的，半个多世纪以来，人们试图从棉花配合力分析、生理生化变化及亲本遗传距离等方面揭示棉花杂种优势表达的内在规律，预测棉花杂种优势。尽管研究取得了可喜的进展，也得出了一些外在性状和生理生化指标与杂种优势大小存在着一定的相关性的结论。但杂种优势表达是复杂的，多数有利性状是由多基因控制，不同材料性状差异较大，性状表现与环境存在着互作关系等，仅靠有限的一些外观性状和一些生理生化指标进行预测杂种优势是很难全面的，这就是为什么有些研究结果不尽一致，甚至相矛盾的原因。基因型杂合化是杂种优势产生的物质基础，杂交种体内酶的变化和外在性状表现是亲本基因经过重组、互作、表达和调控等多个过程形成的结果，多数产物在形成过程当中又受到环境的影响，所以从基因到性状表现的过程是非常复杂的，因此研究杂种优势从源头—基因开始，可以克服一些干扰因素，能较直观地反映杂种优势形成的机理。
迄今为止，有关棉花杂种基因差异表达研究也有一定的进展，其中，汪保华等（2006）用DDTT-PCR技术对棉花杂交品种湘杂2号的强优势组合杂种育亲本进行了基因差异表达分析。研究结果显示，显性效应和超显性效应在湘杂2号的杂种优势中起到重要的作用，而显性效应的作用可能更大；并且经过BLAST结果表明，差异表达的基因涉及光合作用、呼吸作用、信号传导和纤维发育。赵云雷等（2007）研究了棉花杂交种与亲本间DNA胞嘧啶甲基化及其基因差异表达分析，结果表明，在棉花发育的整个阶段，杂交种与双亲相比，基因表达发生了明显的改变，并且在高优势杂交组合中的差异表达基因的比例要高于低优势的杂交组合。并且，差异表达的基因在不同的生长阶段是不同的[2]。虽然有以上的关于基因差异表达的研究，但是有关基因差异表达的内在机制尚不清楚。杂种一代与亲本之间确实存在基因表达差异，而有些差异与杂种优势存在一定的相关性，如果将这些差异性基因片段进行测序再与控制代谢过程中一些关健酶的基因进行同源性分析，建立酶和基因之间的联系，从分子水平上分析基因差异表达的内在机制，这将能更准确地揭示杂种优势的成因。
以上的有关基因差异表达的研究就都是用的DDTT-PCR技术，但是该技术有明显的缺点是假阳性比较高，可重复性较差，且对高强度的mRNA具有很强的倾向性，扩增差别条带的分子长度比较短小，一般在110-450之间仅代表mRNA的3’端，多为非编码区功能信息含量少。本实验采用cDNA-AFLP技术，该技术具有灵敏度高，重复性好，而且实验设备也相对比较简单，是目前筛选差异表达基因最有效的方法［6］。
至今为止，有关新疆高产杂交棉的基因差异表达的分析还很少，新陆早43号是石河子农科中心棉花研究所选育，是早熟高产型陆地杂交棉新品种，在2009年3月通过审定，是新疆第一个通过审定的高产杂交棉[13]。自新陆早43号审定通过，2009年、2010年在北疆棉区都名列第一，达到国内先进水平，同时可利用杂种二代且适宜机械采收，2010年被新疆兵团农八师石河子市政府列为“十二五”重点推广棉花品种，同年还申报国家科技部农业成果转化基因项目“早熟机采型杂交棉新品种中试与示范”项目。到2012年，新陆早43号已推过广70万公顷。所以有必要对新疆杂交棉—新陆早43号与亲本的基因差异表达进行有效的分析。
1． 材料与方法
1.1 材料：
杂交种：新陆早43；父本：Ⅱ-2品系；母本：4-14品系
1.2方法
1.2.1棉花的种植
将新陆早43号及其亲本的种子浸泡过夜，待发芽后，转入盛有Hoagland 营养液的塑料盒中培养。培养条件为：25℃下白天16h，晚上8h，作物产量形成的物质基础是光合物质的生产，叶片是进行光合物质生产的主要器官，因此当幼苗长至两叶一心时，本研究就剪取新陆早43号及其亲本叶片作为实验材料，于液氮中速冻，-70℃冰箱保存备用。
1.2.2苗期干重测定
将棉花植株烘干后（80℃），测定干重，并计算其杂种优势。
中亲优势=（F1-双亲平均）/双亲平均X100%
超亲优势=（F1-HP）/HPX100% HP：高值亲本
1.2.3总RNA的提取和纯化
1.2.3.1 总RNA的提取
运用改良的CTAB法[9]：
（1）取1g棉花幼嫩叶片（三片真叶期）于研钵中，加液氮充分研磨成粉末状，转移到10mL离心管中；
（2）往离心管中加入5mL的RNA提取缓冲液[1.4M NaCl，0.1 M Tris•HCl（pH＝8.0），20mM EDTA，2%CTAB，2%PVP，1%β-巯基乙醇]，振荡混匀，65℃水浴约20min，中途混和2-3次；
（3）加入0.6体积的氯仿，来回充分混匀，然后冰浴10min；
（4）4℃，8000rpm离心20min，将上清液转移到另一新10mL离心管中；
（5）上清液中加入1/3倍体积的8 M LiCl溶液，混和均匀，-20℃放置1-2h；
（6）4℃，8000rpm离心20min，弃去上部溶液，沉淀用70%乙醇洗涤，并转移到一个2 mL离心管中；
（7）4000rpm离心5min，吸去乙醇溶液，用真空泵将沉淀抽干；
（8）加2mL的H2O-DEPC溶解沉淀，并将溶液平均分装入两个2mL离心管中；
（9）每管中加0.8倍体积的酸酚/氯仿溶液（1∶1），充分混和均匀，然后室温静置5min；
（10）4℃，12000rpm离心20min，将上清液转移到另一新的2mL离心管中；
（11）上清液加0.8倍体积氯仿抽提一次；
（12）上清液中加入1/3倍体积的8M LiCl溶液，混和均匀，-20℃放置1-2h；
（13）4℃，12000rpm离心20min，收集RNA沉淀；
（14）RNA沉淀用70%乙醇洗涤两次，真空干燥后再加入100μL的DEPC H2O，使之充分溶解，取1μL用琼脂糖电泳检测RNA质量，其余RNA于-70℃下保存。
所用试剂和塑料耗材均需预先用0.1%DEPC处理，然后高温灭菌。研钵等物品则经过240℃高温烘烤8h左右。
1.2.3.2总RNA中DNA的消化
反应体系如下：
试剂
体积
总RNA
10-100μg
RNA酶抑制剂
1μL（20U/μL）
不含RNA酶的DNA酶I
1μL（10 U/μL）
5×DNAseI Buffer
10μL
加H2O-DEPC至
总体积50μL
37℃温育20-30 min，加DEPC H2O450μL，加入500μL酚/氯仿（3:1），漩涡混匀， 4℃静置片刻，12000rpm，15min。将上清移至一个干净的微量离心管中，加入氯仿，振荡，4℃静置片刻，12000rpm，15min。取上清加入3M PH5.2的乙酸钠、2V 100%乙醇。-70℃放置30min-2h以沉淀RNA，12000rpm，15min，弃上清。用500μL 70%乙醇洗沉淀，离心，晾干。用35μL DEPC H2O溶解沉淀，用BACKMAN DU-640核酸-蛋白分析仪测定OD260、OD280吸光度，定量RNA的浓度与纯度，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量。
1.2.4cDNA的合成及模板的制备
以提取的总RNA 为模板，参照Takara cDNA Synthesis Kit User Manual中M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit ( M-MLV versio n )( Code No.D6130) 中介绍的方法，先以Oligo(dT)18 Primer 为引物，合成cDNA 第一链，然后通过E.coli RNaseH 使杂合链中RNA 形成单链切口，在E.coli DNA Polymerse I 与E.coli DNA ligase 的作用下合成cDNA 第二条链。本研究选择一对在棉花各组织cDNA 中都可扩增出500bp产物的棉花组成型表达基因EF1α的引物(F: 5’-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3’， 5’-CCACCAATCTTGTACACATCC-3’) 对合成的双链cDNA进行RT-PCR检测。
1.2.4cDNA-AFLP技术的实施
用识别序列为6 个碱基和4 个碱基的2 种限制性内切酶进行切割。其中识别6个碱基的为稀有切点酶( rare cutter ) , 识别4 个碱基的为常见切点酶( frequent cutter ) , 要达到的理想效果是,前者对于系统中每一种cDNA 应该只切1 次, 而后者在前者切点的临近位置进行切割, 使产生100 bp 至1000bp 长度的片段, 以便被测序胶可以有效地分辨。切割后添加双链锚定接头, 使酶切后的片段与接头相连接, 产生初级扩增模板, 再加入与接头序列互补的预扩增引物进行预扩增, 产生次级扩增模板。预扩增过程可为后来进一步的选择性扩增提供了大量的次级扩增模板, 这也是cDNA- AFLP 只需要很少量的起始材料( 大约为100 ～200 mg ) 即可进行的原因。在选择性扩增阶段, 使用比预扩增引物添加1 至多个碱基并带有放射性或荧光标记的引物有选择的扩增限制性片段, 扩增的产物TDF 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 从电泳图谱中找出差异表达的片段［5］。
接头与扩增引物
接头与引物
序列EcoRⅠ（E）5，-3，
MseⅠ（M）5，-3，
接头
GTCGTAGACTGCGTACCAATTGGTACGCAGTC
GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT
预扩增引物
GACTGCGTACCAATTCA(E0)
GATGAGTCCTGAGTAA(M0)
选择性扩增引物
GACTGCGTACCAATTCACA(E1)
GATGAGTCCTGAGTAAAC(M1)

GACTGCGTACCAATTCAAC(E2)
GATGAGTCCTGAGTAAAG(M2)

GACTGCGTACCAATTCAAG(E3)
GATGAGTCCTGAGTAACA(M3)

GACTGCGTACCAATTCACT(E4)
GATGAGTCCTGAGTAACT(M4)

GACTGCGTACCAATTCACG(E5)
GATGAGTCCTGAGTAATC(M5)

GACTGCGTACCAATTCACC(E6)
GATGAGTCCTGAGTAATG(M6)

GACTGCGTACCAATTCAGC(E7)
GATGAGTCCTGAGTAATA(M7)

GACTGCGTACCAATTCAGA(E8)
GATGAGTCCTGAGTAAGA(M8)

2．结果与分析
2.1 棉花苗期干重分析

表一 棉花苗期干重
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
P1（g）
0.289
0.371
0.28
0.387
0.343
0.347
0.261
0.297
0.297
0.303
P2（g）
0.336
0.31
0.246
0.259
0.216
0.36
0.288
0.295
0.289
0.297
F1（g）
0.411
0.321
0.341
0.337
0.347
0.329
0.311
0.348
0.348
0.336
从表一可以看出，所测得的10组棉花苗期干重数据，杂交种（F1）的苗期干重都普遍高于双亲。
可以计算出杂种优优势：
中亲优势=（F1-双亲平均）/双亲平均X100%=12.8%
超亲优势=（F1-HP）/HPX100%=7.9%
算出的中亲优势为12.8%，超亲优势为7.9%。这说明杂交种的物质积累量要普遍高于其亲本，进一步可以设想杂交种的基因表达量可能高于双亲，即亲代与子代的基因表达存在差异，从而进行下面的实验。
2.2 总RNA提取与纯化效果分析
如图一所示的为RNA的琼脂糖电泳，可以看到出现出现28S和18S两条亮带，并且28S大概为18S的两倍，表明所提取的RNA效果良好，污染较少。让后在经过进一步的紫外分光光度计检测得出OD260/OD280值为1.93，表明所提RNA无DNA或蛋白质污染。

2.3cDNA的合成与检测
图二是对合成的cDNA的检测结果，以EF1α为内参扩增的目的片段，用琼脂糖电泳检测在500bp处出现亮的条带，说明反转录成功，可以用于AFLP 标记的分析。
2.4cDNA-AFLP技术
2.4.1双酶切效果检测与预扩增
cDNA-AFLP技术的关键步骤就是双酶切，这是实验成败的关键。如图三所示，cDNA在双酶切之后，条带处于弥散状态，说明整个胶版上都分布有不同量的DNA，从而可以表明双酶切效果良好，可以进行预扩增。
预扩增的产物可以从图四中看出，整个胶版中都有不同量的扩增产物，即预扩增产物出现弥散条带，说明不同大小DNA片段都得到了预扩增，预扩增效果良好，可以稀释后作为选择性扩增的模板。

图三 双酶切

图四 cDNA预扩增
2.4.2 选择性扩增分析
选择性扩增总共用到了8对引物，总共64对引物组合用于cDNA-AFLP的选择性扩增。在这里只选择了其中一部分条带进行分析。
如图六所示，我们明显可以看出杂交棉与亲本之间的基因表达的差异，并且这些差异性的表达不在少数。如（D）从右往左数第四、五、六条带上有单亲显性表达类型，扩增强带在双亲之一和杂交棉中出现，而在另一亲本中不出现；（B）从左到右第一、二、三条带上有杂交种上调表达类型，杂交种上调表达，扩增强带仅出现在杂交棉，双亲无；（A）从左往右数第一、二、三条带上有杂交种下调表达类型，扩增强带仅出现在双亲，而杂交种不表达；（C）从左往右第四、、六条带也为单亲显性表达。从这里可以明确的得出，杂交棉-新陆早43号与亲本之间存在基因的差异表达，基于这样的分析，我们就可以做出进一步的研究，找出其差异基因等一系列后续工作。

图五 cDNA-AFLP(选扩)
根据差异条带的版本不同，在这里我们将杂交棉与亲本的基因表达差异分为5种类型（图六）。I：杂交种上调表达，扩增强带仅出现在杂交棉，双亲无；II：单亲显性表达，扩增强带在双亲之一和杂交棉中出现，而在另一亲本中不出现，包括母本、杂交棉中有而父本无和父本、杂交棉中有而母本无两种类 型；III： 单亲沉默表达，扩增强带仅出现在亲本之一 ，包括仅母本有而其他无和仅父本有而其他无两种类型 ；Iv ：杂交种下调表达，双亲都有扩增强带而杂交棉没有；V：基因单态表达，扩增强带在双亲和杂交棉中均出现 。 其中I～IV型为差异表达基因类型 。

图六 基因差异表达类型[1]
根据基因差异表达的类型，统计64对引物扩增结果，建立杂交棉基因表达谱（图七），结果显示：差异性表达的基因在测定的棉花幼苗cDNA片段中占31.22%，其中杂交种上调表达型占5.80%，杂交种下调表达型占3.62%，单亲显性表达型占12.65%，单亲下调表达型占9.15%。

图七 杂交棉与亲本的基因差异表达
3．结论与讨论
3.1结论
杂交棉与亲本的基因表达存在明显的差异。在这些差异表达中基因单态表达类型最多，单亲显性表达和单亲下调表达这两种类型较多，有少数杂交种上调表达和单亲下调表达，。所以杂交棉表现出的杂种优势与亲本之间的基因差异表达所有关。
3.2讨论
杂种优势可能表现在植物生长和发育的各个阶段，幼苗可以在严格控制生长条件下生长并表现出杂种优势，因此选择这一时期检测基因表达差异可以避免外界环境等因素对杂种优势基因表达的影响。
叶和根是代表棉花植株地上部分和地下部分的重要营养器官，根作为植株唯一 的地下器官，生长模式始终如一，它的生长和发育与地上部分存在很大差异，没有茎、叶和花等器官分化与转换，因此根和叶在基因表达模式上既可能存在共同性也 可能存在差异性。本实验主要是对于棉花幼苗三片真叶期的叶片进行差异表达分析，并没有对地下部分—根作进一步的分析，因此，对于根部和叶片的基因表达差异是否一致并没有提供依据，还需要对根部的基因表达做进一步的研究才能知道根部和叶片的基因表达差异是否一致。

参 考 文 献
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