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离子交换层析说明书

CM Bestarose Fast Flow
DEAE Bestarose Fast Flow
Q Bestarose Fast Flow
SP Bestarose Fast Flow

CM, DEAE, Q and SP Bestarose 快速离子交换剂属于分离介质的一部分,主要为色谱工作服务, 所有的介质都经过严格的控制生产从而保证其能够满足工业生产的需求。
为了正确操作以便得到最好的分离效果, 请在使用前阅读该手册。

目录

1. Bestarose 快速离子交换剂的特性 3
2. 装柱指南 12
3. 装柱评价 14
4. 保养 17
5. 疑难解答 17-19

1. Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性
Bestarose Fast Flow离子交换剂是以高度交联的琼脂糖为基质, 它的化学、 物理性质稳定, 即离子载量、 洗脱情况、 反压及流量等特性不受层析和清洗过程中溶液的影响, 详见下表。高物理稳定性使它能在低背压下提供快速液流, 在柱高15cm, 1 bar压力下 , 它的流速可达300-700cm/h, 见图1。另外, 刚性介质体积基本不因pH和离子强度的变化而变化。

线性
流速

图1. Bestarose 快速离子交换剂典型的压力/流速曲线。

CM Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性
CM Bestarose Fast Flow是一种弱阳离子交换剂, 离子交换基团是羧甲基, 如下: -O-CH2COO-

表一. CM Bestarose Fast Flow 特性。
项目 指标
离子交换剂类型 弱阳离子
总离子载量 0.09-0.13mmol/ml
排阻限 4×106( 球形蛋白)
骨架 6%交联琼脂糖
颗粒类型 球形, 45-165μm
流速 300–600 cm/h*
工作温度 4–40°C
工作pH 见图2
pH稳定性 2-14(短期, CIP)
4-13( 长期)
化学稳定性 适合所有的缓冲体系
1M NaOH
8M Urea
6M GuHCl
70%乙醇
避免事项 氧化剂
长期暴露( 1星期, 20°C)
pH<4
*15cm柱高, 1 bar压强, 25℃, XK 50/30 柱。

图2的滴定曲线表明CM Bestarose Fast Flow的pH工作范围, 例如CM基团的pH工作范围。

图2. CM Bestarose Fast Flow的滴定曲线

DEAE Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性
DEAE Bestarose Fast Flow是一种弱阴离子交换剂, 离子交换基团是二乙基氨基乙基, 如下: -O-CH2CH2-N+(C2H5)3H

表2 DEAE Bestarose Fast Flow的特性
项目 指标
离子交换剂类型 弱阴离子
总离子载量 0.11-0.16mmol/ml
排阻限 4×106( 球形蛋白)
Matrix 6%交联琼脂糖
颗粒类型 球形45-165μm
流速 300–600 cm/h*
工作温度 4–40°C
工作pH 见图3
pH稳定性 2-14(短期, CIP)
2-12( 长期)
化学稳定性 适合所有的缓冲体系
1M NaOH
8M Urea
6M GuHCl
70%乙醇
避免事项 氧化剂
长期暴露( 1星期, 20°C)
pH<4
*15cm柱高, 1 bar压强, 25℃, XK 50/30 柱。

图3的滴定曲线表明DEAE Bestarose Fast Flow的pH工作范围, 例如, DEAE基团的pH工作范围。

图3 DEAE Bestarose Fast Flow滴定曲线

Q Bestarose Fast Flow的特性
Q Bestarose Fast Flow是一种强阴离子交换剂, 其离子交换活性基团是季铵基, 如下: –O–CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3
表3 Q Bestarose Fast Flow的特性
项目 指标
离子交换剂类型 强阴离子
总离子载量 0.18-0.25mmol/ml介质
排阻限 4×106( 球形蛋白)
骨架 6%交联琼脂糖
颗粒类型 球形, 45-165μm
流速 400–700 cm/h*
工作温度 4–40°C
工作pH 见图4
pH稳定性 2-14(短期, CIP)
2-12( 长期)
化学稳定性 适合所有的缓冲体系
1M NaOH
8M Urea
6M GuHCl
70%乙醇
避免事项 氧化剂
长期暴露( 1星期, 20°C)
pH<4
*15cm柱高, 1 bar压强, 25℃, XK 50/30 柱。

图4的滴定曲线表明Q Bestarose Fast Flow的pH工作范围, 例如Q基团的pH工作范围。

图4 Q Bestarose Fast Flow 的滴定曲线

SP Bestarose Fast Flow的特性
SP Bestarose Fast Flow是一种强阳离子交换剂, 其活性基团是磺丙基, 如下: –O–CH2CHOHCH2OCH2CH2CH2SO-3
表4 SP Bestarose Fast Flow的特性
项目 指标
离子交换剂类型 强阳离子
总离子载量 0.18-0.25mmol/ml
排阻限 4×106( 球形蛋白)
骨架 6%交联琼脂糖
颗粒类型 球形, 45-165μm
流速 400–700 cm/h*
工作温度 4–40°C
工作pH 见图5
pH稳定性 3-14(短期, CIP)
4-12( 长期)
化学稳定性 适合所有的缓冲体系
1M NaOH
8M Urea
6M GuHCl
70%乙醇
避免事项 氧化剂
长期暴露( 1星期, 20°C)
pH<4
*15cm柱高, 1 bar压强, 25℃, XK 50/30 柱。

图5滴定曲线表明SP Bestarose Fast Flow 的pH工作范围, 例如SP基团的pH工作范围。

图5 SP Bestarose Fast Flow的滴定曲线

2.装柱指南
CM, DEAE, Q Bestarose 离子交换剂贮存在20%乙醇中, 而SP Bestarose 离子交换剂则贮存在20%乙醇和20mM的醋酸钠中, 使用前, 将匀浆中的乙醇倒出, 用起始缓冲液代替。
装柱说明
装柱的质量主要影响分离效果, 请参照如下说明来检测, 填装层析柱。首先测量最适流速。下面是用于测量带转接器并固定柱床的层析柱最适流速方法。
测量最适装柱流速:
最适装柱流速与温度、 柱子大小型号、 介质体积有关, 因此, 建议独立的装置都需分别测量最适装柱流速, 测量方法如下:
1. 精确计算所需介质的量( 这对固定柱高的层析柱特别重要) 。1L填充柱所需的介质量大约是1.15L自然沉淀匀浆的量。
2. 参照层析柱使用手册安装柱子。
3. 开始以较低的速度填充柱子( 30cm/h) 。
4. 不断增加压力, 并记下压力稳定时的流速, 不要超过柱子能承受的最大压力, 或介质允许的最大流速。
5.当压力/流速曲线不再变化或层析柱承受的压力达到最大时, 达到最大流速。此时停止装柱, 而且不要超过最大流速。最适装柱流速/压力是最大流速/压力的70-100%。
6. 制作压力/流速曲线见表1, 测得最适装柱流速, 实际操作时的流速/压力应小于最大流速/压力的70%。
3. 装柱的评价
为了检查装柱质量, 并对使用过程中质量监控, 装柱完要立即检测柱效, 然后定时检查, 此时能够检查出分离效果是否正常。我们用等高塔板、 HETP、 峰不对称因子、 As等术语来衡量填充柱的性能, 经过应用样品如1%丙酮, 这些指标是很容易测得。( 有色的化合物和盐溶液避免使用, 它们可能会与介质发生反应)
理论塔板数能够随着检测条件的变化而改变, 因此它只能作为一个参考值。仪器和条件保持不变得到的结果才有可比性, 溶质、 溶液、 洗脱液、 样品体积、 流速、 流动路径、 温度等条件改变都影响结果。为了得到最好的结果, 应该控制样品在最大柱体积的1.0%, 而且线性流速在15-30cm/h。
如果最大装柱量是由柱效来决定的, 那么理论塔板数就能够在使用柱子时做为装柱量的参考。

测量HEPT和As的方法
为了防止样品的稀释, 尽量接近柱子的进口处加入样品。
条件
样品体积: 1.0-2.0%柱体积
样品 conc: 1.0%( v/v) 丙酮水溶液,
0.8M NaCl或10×buffer
洗脱剂: 水, 0.5MNaCl水溶液或者是稀释的缓冲液
流速: 20–30 cm/h
检测:
丙酮: UV 280 nm;
NaCl,buffer: 电导率
根据UV曲线( 或者是电导率曲线) 计算HETP和As, 公式如下:
HETP=L/N
N=5.54(VR/Wh)2
VR=保留体积
Wh=半峰宽
L=柱高
N=理论塔板数
VR和Wh的单位要相同.
为了方便比较柱效, 经常会用到”还原塔板高度”这个概念, 其计算公式是: HCTP/d
其中d是颗粒的直径, 一般来说, 这个指标小于3才是正常的。
峰形应该是对称的, 不对称因子要尽量接近1( 0.8-1.5一般是能够接受的) 。峰形发生变化往往是柱床变差的首要标志。

峰不对称因子的计算:
As=b/a
其中:
a= 在10%峰高处的第一个半峰宽
b= 在10%峰高处的第二个半峰宽
图6表示丙酮典型的UV吸收色谱图, 并从该图中能够计算HETP和As。

图6 在测定HEPT和As时丙酮典型UV吸收图谱。

柱子: BPG300
介质: Bestarose 6 Fast Flow
株高: 57.5cm
柱体积: 40.6 L
样品: 1.05L( 1%丙酮)
洗脱液: 蒸馏水
流速: 19cm/h
Wh=0.9
HEPT=0.024cm
a:0.9
b:0.85
As: 0.94

4. 保养
为了长期保持Bestarose 快速离子交换剂的最佳性能, 请参照以下操作。
平衡
装柱完, 用5倍柱床体积的washing buffer 平衡柱子。
再生
分离后, 用高离子强度的缓冲液( 例如1M NaCl) 和/或增加PH值来洗柱, 然后用至少5倍柱床体积的starting buffer平衡柱子, 或直到柱子流出液的电导率和pH值稳定时。
清洁
在位清洁主要是去除再生后残留在柱子中的污染物, 包括脂质、 沉淀物或变性蛋白。这些污染物可能在分离未预先处理的样品时残留。定期清洁不但能够防止这些污染物的固定, 还能够保持介质的载量、 流速及一般性能。
每次清洁应根据不同的污染物制定清洁措施, 清洁的频率主要由分离样品的性质和条件所决定, 建议分离1-5次后清洁一次。

标准的清洁流程
因离子交换而吸附的蛋白质, 能够用0.5胶床体积的2M NaCl溶液反方向洗柱10-15分钟。
沉淀、 疏水性蛋白和脂蛋白时, 可用1M NaOH溶液以40cm/h的线性流速反方向洗柱1-2小时。
去除吸附性强的疏水性蛋白和脂质时, 用2-4倍柱床体积的0.5%无离子的去污剂( 如1M醋酸) 反向洗柱1-2h。同样能够用2-4倍柱床体积的高达70％的乙醇或30％异丙醇反方向洗柱1-2h。
( *特别说明: 当使用70%乙醇时, 需要在防爆的区域或设备。)
净化
为了降低柱床中微生物污染, 用0.5-1M NaOH反向洗柱1h。
上述的清洁步骤同样能够净化柱子。
灭菌
只能采用高压灭菌处理。用pH7, 0.5M NaCl平衡柱子, 倒出介质, 120℃高压灭菌介质30min。参考层析柱使用手册对柱子的灭菌处理, 然后再重新安装、 填柱并检测。
保存
未用过的介质能够贮存于4-30℃, 确保容器盖子拧紧。填充柱用working buffer平衡后贮存于20%乙醇中, 以防微生物生长。

5．疑难解答
高背压
1. 检查泵与收集管间所有的阀门是否都是完全打开的。
2. 检查所有的阀门是否干净的, 且没有堵塞。
3. 经过清洁, 去除吸附性强的杂质。
4. 按照层析柱使用指南, 检查柱子各个部分如滤器、 滤网等。

未预料的层析结果
1. 检查记录速度/信号。
2. 检查流速。
3. 检查缓冲液。
4. 检查转接器与柱床之间没有间隙。
5. 检查填充柱的性能, 见14页。
6. 检查预处理样品产生的变化情况。
表5. 离子交换层析的实验条件是如何影响分离步骤中的主要参数。优化后的关键参数能够帮助达到理想的分离结果, 而且有助于制定一套经济有效的分离方案。
条件 分离目标
选择性 柱效 载量
( 理论塔板)
产量 结合能力
(g/hg/L介质)
吸附时pH 影响极大 影响 影响极大
解析时pH 影响极大
吸附时传导率( ms-1) 大幅度增加
----- 影响 影响 影响
增加流速( cm/h) 减低 大幅度增加 减低
增加柱高( cm) 增加 增加 减少
增加柱子直径( cm) 大幅度增加
降低颗粒直径( cm) 大幅度增加 增加

微生物侵染
1. 检查接口和预滤器。
2. 检查上样成分如缓冲液、 样品组分等。
3. 检查柱子是否得到恰当的清洁。
气泡
1. 检查缓冲液与柱子温度是否一致。
2. 检查接口是否松懈, 阀门是否漏液。
如果空气进入柱子, 需重新装柱。如果少量空气进入柱床顶部, 或者在转接器网与接口处, 用流动相反向冲洗即可, 然后检查柱效( 见14页) , 并与检查前结果相比较。