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固氮酶化学机理研究

摘要: 固氮酶的研究在近来备受重视, 本文着重对近来固氮酶的研究成果进行综述, 特别是固氮酶的组成、 机理和模拟研究。
关键词: 固氮酶; 模拟; 催化
生物固氮过程是微生物界特有的, 它能将空气中的游离氮气还原成氨。依靠生物固氮, 地球上每年能固定1．75亿吨氮素, 而当前的化学工业全世界年产量还只能达到0．6亿吨, 由此足见生物固氮的重要性, 而生物固氮是在固氮酶的作用下进行的, 对固氮酶的研究及模拟将为合成氨工艺改革提供理论依据。本文就所查文献对这方面的研究进展状况进行概述。
1 氮气分子的不活泼性及固氮酶催化的反应
氮气分子是一个化学性质非常不活泼的双原子分子; 其分子轨道排布为: Kx(2ag) (2au) (1au) (3og) (1ag)。它具有一个键长为1．o976A的三重键, 键伸缩频率是2331em～ , 弹性力常数是2．29×10 达因／cm: 它的离解能是9．9ev(955．2千焦／摩尔), 电离能是15．6ev(1505千焦／摩尔), 三重键能和N=N 双重键的平均键能相差5．4ev(521千焦／摩尔)。而固氮酶却能在温和的条件下把N2还原到氨。
2 固氮酶的组成
固氮酶是一种多异核金属原子簇的复合金属酶。固氮酶系由两种对氧敏感的金属蛋白质组成: 一种是铁氧还蛋白, 它的分子量约为60, O0 70, 000, 是含有[4Fe一4S]簇的 双体; 另一种蛋白是钼铁蛋白, 分子量约为200, O0 220, 000, 是 四合体, 含有铁及对酸不稳定的硫, 以及钼或钒。关于这两种蛋白的多肽的编码基因已经搞清楚。在固氮作用中, 两种蛋白必须同时存在, 才具有固氮性能。钼铁蛋白中辅基— — 铁钼辅基, 分子量为 , 是固氮酶的络合催化中心, 而铁氧还蛋白主要是起传递电子的作用。对于铁钼辅基的结构, 中科院福建物质结构研究所固氮小组认为是由一个Mo、 3个Fe和3个s一共7个原子组成, 具有网兜状的不完整类立烷型原子簇结构。1977年有报道Mo: Fe: S=1: 8: 6(原子比); i979年报道Mo: Fe: S=1: 7: 4(原子比．)。到当前, 经过EXFAS(外延x一射线吸收精细结构)测定, 能够证明Mo=0钼氧双键不存在, 在钼原子周围, 有3—4个s, 2—3个Fe, 1—2个SR, 键长测定为Mo一$235pm, Mo—Fe273pm, Mo=SR247pm。
3 固氮酶的机理研究
6O年代以来, 固氯酶的研究已取得了多次突破和重要进展．最近一次突破是1992年Rees等发表了固氮酶钼铁蛋白和铁蛋白的x光晶体结构, 揭示了FeMo—co(铁钼辅基)MoFe S (R高柠檬酸)的本质．在该结构中, Mo原子处于一端的角落位置上, 并和3个P-a-硫配体、 一个组氨酸和一个高柠檬酸配位．形成八面体的络合物．高柠檬酸以 烷氧基和 羧基直接同钼形成双齿配位, 而 羧基和 羧基与金属不成键, 形成1: 1型的高柠檬酸钼簇结构, 如图1_

铁钼(钒)辅基生物合成的化学模拟
从钒的EXAFS谱图中可发现钒固氮酶中的FeV辅基和FeMo辅基相似 , 柠檬酸
(H cit: C。H。O )和其它羟基多羧基酸有可能在如Fc、 V 和Mo这些金属的新陈代谢中起重要的作用 野生型固氮酶含有R构型的高柠檬酸, 高柠檬酸有可 和钼配位的a一羟基、 a一羧酸 口和 羧基#而固氮酶突变种仅含柠檬酸配位的铁钼辅基MoFe S (柠檬酸), 柠檬酸比高柠檬酸少一个亚甲基, 没有光学活性．固氮酶突变种的固氮活性很低, 但能还原乙炔和放氢0 ．当前的研究认为, 在固氮酶辅基的生物合成中, 三羧酸根的功能可能是转移和存储酶中的钼或钒．MoO: 一或V0i一与(高)柠檬酸的复合物经还原、 硫交换和NifB辅基结合等过程形成FeMo—c0, FeMo—CO插入缺辅基的钼铁蛋白形成有活性的固氮酶, 在固氮酶的固氮过程中, 高柠檬酸发挥了重要的作用、 研究钼(钒)酸盐同(高)柠檬酸问的反应, 对于阐明铁钼(钒)辅基生物合成的第一步和其中包含的钼(钒)转移作用具有重要的意义。
3．1 钒酸盐和(高)柠檬酸体系的研究
对于钒酸盐和(高)柠檬酸的反应, 我们最早分离和表征了柠檬酸钒(V)酰钾的结构几乎是同时, MIT的研究小组也独立地分离 该络合物n ．络合物的典型结构待征是柠檬酸配体经过桥联的 烷氧基和单齿的 羧基双配位到钒原子上．这种独特的配位形式代表着第一个固氮酶辅基中三元羧酸配位到金属原子的模型, 它的配位模式与FeMo-co中的高柠檬酸配位相似．之后, 我们分别从弱酸性和中性溶液中, 分离了含柠檬酸钒(V)酰负四价和负六价阴离子络合物．两个阴离子同样含有心对称的四元环v。0。二聚体, 柠檬酸经过 -烷氧基、 ．羧酸与v 进行配位, 而另两个羧酸基团未参与配位, 钒原子保持五配位．其中负四价中间体可视为由强氢键组成的配位聚合物(图5)．对于这类柠檬酸钒(V)酰络合物, 羧酸基团的质子分步加台与离解并不影响双核物种的结构和配位形式, 柠檬酸钒(V)酰络合物呈现多元羧酸的基本陛质 ．这些性质为羟基多元羧酸在固氮酶反应体系中作为质子传递链提供了可能性[ , 也为固氮酶中高柠檬酸搭桥的质子(电子)传递途径提供了依据。
3．2 钼酸盐和(高)柠檬酸体系的研究
我们从自然界的钼源出发, 以比R一高柠檬酸少一个亚甲基的柠檬酸为模拟物, 研究了钼酸盐与柠檬酸在pH为3～9之间的反应行为, 化学模拟了固氮酶突变种生物合成中的钼源转移过程的第一步．柠檬酸既是反应物又是缓冲剂, 经过控制反应物比例、 溶液的pH值和反应温度, 能够实现单体和二聚络合物的转化．结果发现, 在接近固氮酶体系的pH(7～8)环境下, 柠檬酸配体以a一烷氧基、 羧基和 羧基唰钼三齿配位, 形成一比一的单核柠檬酸络合物, 其中 羧基为弱配位, 其钼氧单键键长较长[O．241 1(3)nm]．而且, 三齿配位的钼络合物可进一步转化为仅含a一烷氧基和a一羧基的双齿配位柠檬酸钼络合物, 这种配位形式与高柠檬酸在铁钼辅基中钼的配位类似．进而说明羟基多羧酸钼(vI)络合物的形成可能是钼源转移的第一步．也就是说, 柠檬酸钼(VD络合物可能是突变种型铁钼辅基生物合成的前驱体, 其突出的结构特征如下(图7)l2 :

4 固氮酶模拟及展望
固氮酶模拟报道比较多。钼铁硫原子簇已合成出20多类, 300多个化合物, 还有钼一硫醇(钼一半胱胺酸)钼一二硫代氨基甲酸, 钼一氰负离子等等的研究报道。对MoFe原子簇化合物的研究表明, 合成该类物质的结构分为立方烷和线型, 组成能够是双核, 也能够是三核。在测定反应性能时, 把人造的辅基与不含MoFe辅基的固氮酶混合也有固氮作用。对自兜反应机理的研究, 使人们运用自兜法成功地合成了许多新的Mo—Fe—S立方烷类和立方烷型簇合物。其它模拟体系如:
Mo(V)+Mo(V)一Mo(IV)+Mo(VI)
Mo,O3(s2CNEt2)4 =±MoO(s2CNV,t~)4+MoO2(S2CNEt2)2
Mo(VI)——, Mo(IV)
以及Mg—ATP能否与铁蛋白活性中心Fe4s4原子簇配合可经过模型化合物来检验。模拟实验研究表明: ATP 与[Fe4s4(SPh)] 的配合, 增加了Fe4s4 簇骼上的配位数和配位场, 模拟体系具有Mg— ATP与铁蛋白相互作用时相似的物理化学性质等。
固氮酶的生物化学和化学模拟工作的进展, 已使我们能够对固氮酶的活性中心结构和作用机理提出一些看法, 说明了一些问题。可是关于这一方面仍有不少细节问题需要进一步弄清。化学模拟生物固氮工作的主要目的不在于检验几个活性中心模型, 而在于拿这种对于生物固氮客观规律的认识, 去指导配位催化方面的实践, 首先是寻找催化效率较高的合成氨催化剂。 作为比较远期的设想。将来可望利用光催化方法, 以水为氢源, 以太阳能为能源, 使分子氮还原为NH3。
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