转pGH基因猪的F3代的生长性能的研究.docx

分类号 密 级
U D C 单位代码

硕 士 学 位 论 文

转pGH基因猪的F3代的生长性能的研究
Study on Production Performance of the F3 Generation pGH Genes Transgenic Pigs

研究生 姓名 周云
指 导 教 师 张廷荣 教授
第 二 导 师 徐云华 高级畜牧师
学 科 专 业 农业推广硕士
研 究 方 向 养殖

中国·青岛
二0一五年 月

Study on Production Performance of the F3 Generation pGH Genes Transgenic Pigs

Thesis submitted to
Qingdao Agricultural University

In Fulfillment of the Requirement
for the Degree of
Master of Agronomy

Wang Yousheng
（College of Animal Science and Technology）
Supervisor: Zhang Tingrong

Qingdao. China
June, 2015

独 创 性 声 明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名： 时间： 年 月 日

关于论文使用授权的说明
本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)

研究生签名： 时间： 年 月 日

导师签名： 时间： 年 月 日

转pGH基因猪的F3代的生长性能的研究
摘 要
为了探讨转pGH基因猪的外源pGH基因是否在F3代猪中的稳定遗传表达及其对F3代转基因猪生产性能的影响，探究转基因猪的实际生产效果，实验选择4头F2代转pGH基因母猪及其所生产5窝53头F3代健康仔猪，鉴定F3代仔猪的阳性率并测定其生产性能，同时对四头F2代母猪的产仔、泌乳情况进行测定分析，结果如下：
1.4头F2代转基因母猪5窝共产60头仔猪，其中健仔53头，弱仔4头，死胎3头，健仔率达88.33%。对全部60头仔猪进行耳组织DNA提取，通过PCR及测序检测，结果23头健仔1头死胎为转基因阳性猪，阳性率达40%。
2.通过对F3代猪的生长速度，平均日增重，体尺发育等生产性能进行测定，通过转基因猪与非转基因猪同窝之间对比及总体之间对比发现，F3代转基因猪与非转基因猪在生产性能上有所提高，其结果如下：
(1).F3代猪中转基因猪全期平均日增重比非转基因猪高4.57%，其中在4到5月龄阶段转基因猪ADG达927.1g/d，比非转基因猪ADG提高8.39%；
(2).转基因猪达到100kg体重日龄为169天而非转基因猪需要172.5天。
(3).F3代猪六月龄体尺比较：转基因猪体长、胸围、臀围均大于非转基因猪，其中臀围差异性显著（p＜0.05），转基因猪体高小于非转基因猪但差异不显著。
(4).100kg体重时，转基因猪的背膘厚度小于非转基因猪，眼肌面积大于非转基因猪。
3.F2代转基因母猪与F1代相比平均产仔数相同都为平均每窝12头，F2代转基因母猪的健仔数、平均窝重及泌乳力比F1代母猪有所提高，但差异不显著。
关键词：pGH；转基因猪；F3代；生产性能

Study on Production Performance of the F3 Generation pGH Genes Transgenic Pigs
Abstract
In order to reseach the exogenous pGH gene whether stably inheritance and expression in the F3 generation pigs, the influence of production performance, explore the practical production of generation pigs. The study chose 4 F2 generation sows and their 53 healthy piglets in F3 generation, evaluated their positive, determined their production performance. Also analysis the breeding of the 4 transgenic sows. Results are as follows:
1. Four F2 generation transgenic sows were delivery 5 litter of piglets and get 60 pigs ,53 of them are health ,4 of them are weak and 3 of them stillbirth. The health are rate 88.33%. Extracted all of the 60 piglets’ DNA, through detection method of PCR detection and sequencing, we confirm 23 health pigs and 1 stillbirth are positive transgenic pigs, the positive is rate 40%.
2. Research production performance of the F3 generation pigs, including the growth rate, the ADG, the body-size etc. Contrast the transgenic pigs with the same litter and others ,we found that the F3 generation pGH genes transgenic pigs were better than non-transgenic pigs. Results are as follows:
(1).During the growth period the transgenic pigs’ ADG is higher by 4.57% than non- transgenic pigs. Especially 4 month age to 5month age, the ADG of transgenic pigs reach to 927.1/d, more by 8.39% than non-transgenic pigs.
(2).The transgenic pigs achieve to 100kg need 169 days but the non-transgenic pigs need 172.5 days.
(3).The contrast of body-size between the F3 generation pigs, the SVL, the chest and the hipline of transgenic pigs is better than non- transgenic pigs. Especially the hipline is significant different(p＜0.05). The non- transgenic pigs are higher than transgenic pigs but not significant.
(4).When the pigs were reached to 100kg , the back-fat of transgenic pigs is thinner than non- transgenic pigs but the loin eye muscle area is bigger than non- transgenic pigs.

3. The number of born is same between F1 generation sows and F2 generation sows. But compare with F1 generation sows, the F2 generation sows is better on the side of health piglets, the average litter weight and milkability, but not Significant.
Key word: pGH; transgenic pigs; F3 generation; Production performance

目录
前 言 1
第一章 文献综述 2
1.转基因猪的研究进展 2
1.1转基因猪的研究历史与现状 2
1.2 转基因猪的制备 3
1.2.1 精子载体法 3
1.2.2 显微注射法 3
1.2.3 逆转录病毒感染法 4
1.2.4 体细胞核移植技术 5
1.2.5 胚胎干细胞介导法 5
1.2.6 徒手克隆法 6
1.3 转基因猪的应用 6
1.3.1提高动物生产性能 7
1.3.2改善肉质 7
1.3.3 提高动物的抗病能力 7
1.3.4研究人类疾病的动物模型 8
1.3.5动物生物反应器 8
1.3.5移植器官供体 8
1.4转基因猪的发展前景 9
2. 猪生长激素的研究概况 9
2.1 pGH基因的结构特点 9
2.2 猪生长激素基因调控机理和生理作用 9
2.2.1 猪生长激素的直接作用 10
2.2.2 猪生长激素的间接作用 10
2.3猪生长激素基因的应用及前景 10
第二章 转基因猪的F3代猪阳性鉴定 11
1 试验材料 11
1.1试验主要仪器 11
1.2试验主要试剂 11
1.3主要试剂的配制 12
1.3.1 DNA的提取所用试剂的配制 12
1.3.2电泳所用试剂的配置 12
2.1 绿色荧光蛋白表达的检测 13
2.2组织DNA的提取及检测 13
2.2.1样品组织的采取 13
2.2.2样品组织DNA的提取 13
2.2.3 DNA质量的检测 14
2.3 PCR及产物初步鉴定 14
2.3.2 PCR反应体系及反应条件 15
2.3.3电泳 16
2.4 PCR产物的纯化 16
2.5目的片段与载体的连接 16
2.6 重组质粒的转化 17
2.7 阳性克隆的筛选 17
3.4转基因F3代仔猪测序结果 19
4 讨论 19
4.1 DNA提取纯度的影响因素 19
4.1.1样本的保存 20
4.1.2操作过程 20
4.2外源基因整合及表达检测的方法 20
4.2.1 PCR扩增法 21
4.2.2序列分析 21
第三章 转基因猪的F3代猪生产性能研究 22
1 试验材料 22
1.1试验猪的选择 22
1.2 实验地点 22
1.3试验时间 22
1.4试验用饲料的营养标准 22
1.5实验仪器 23
2 试验方法与内容 23
2.1生长发育的测定 23
2.1.1体重的测量 23
2.1.2体尺指标的测定 23
2.1.3 达到100kg体重的校正日龄 24
2.1.4 转基因猪活体背膘厚度的测定 24
2.2 转基因猪的F2代母猪的繁殖性能测定 24
3.1 转基因猪的F3代猪生长发育分析 25
3.1.1 五窝试验猪同期同批生长发育分析 25
3.1.2 F3代的转基因猪与非转基因猪生长分析 27
3.2 F3代猪活体背膘厚与眼肌面积比较分析 31
3.3转基因母猪繁殖性能分析 32
3.3.1产仔性能的分析 32
3.4.2泌乳力分析 33
4 讨论 33
结论 35
参考文献 36
英文缩写词表 41
导师组意见 41
致谢 41

前 言
猪肉是我国主要的消费动物肉类之一，随着经济的发展，人们对猪肉的需求量也越来越高，养猪业在我国畜牧产业中的地位也日益提高。随着中国梦的提出，安全、环保、高效的健康养猪业成为行业发展的目标和要求。动物转基因技术能够在遗传基础上对猪的生产性能、肉质品质、抗病性进行改良，对促进健康养猪业发展提高、经济效益有着积极作用。
动物转基因技术就是将外源的自然基因或人为改造后基因通过分子生物学技术整合到宿主基因组中使外源基因能够在宿主体内成功表达并稳定地遗传给后代。转基因技术突破了物种间的生殖隔离，实现了不同物种间的遗传物质交换和重组，明显的缩短了育种年限。通过动物转基因技术可以定向的改良和培育猪新品种，例如将菠菜根部的FADZ基因转移到猪体内培育出体内不饱和脂肪酸含量高的FADZ转基因猪、将植酸酶基因转移到猪唾液腺中的植酸酶转基因猪。利用转基因技术生产供人体器官移植的供体转基因猪，也可以用转基因猪作为生物反应器生产医用蛋白等。
本研究就通过对转基因猪的F3代猪进行阳性鉴定及生产性能测定来探讨外源pGH基因的遗传稳定性和对F3代转基因猪生产性能的影响。同时对四头F2代母猪的产仔、泌乳情况等繁殖性状进行测定分析并与F1代转基因母猪进行对比，分析转pGH基因在传代后对母猪繁殖性能的影响。这可以为以后研究转基因猪的遗传稳定性及生产性能的研究提供依据。

第一章 文献综述
随着科学的进步技术的发展，以转基因技术的为核心的农业生物技术发展迅速。转基因技术在农业方面广泛应用于植物育种，提高抗病虫害能力等，截止2015年，全球转基因作物种植面积已经达到1.8亿hm2[1]。转基因技术在动物方面也有广泛的应用，动物转基因技术是指通过基因工程将体外重组的基因结构或者外源基因片段导入动物体内，使其在动物体内进行整合和表达，产生新的性状。动物转基因技术已经运用到生命学科的各个领域，运用转基因技术可以加快动物品种的改良周期，突破物种隔离，带来明显的经济效益，促进畜牧业的迅速发展，通过动物转基因技术可以生产药用蛋白和干细胞治疗人类疾病。
猪肉是我国主要的动物性食品之一，随着生活水平的提高对猪肉的需求量也日渐增加。同时猪仔解剖、组织、生理及营养代谢等方面与人类较为相似，因此也可以用做生物医学研究模型。通过转基因技术可以定向培育食用安全、生长迅速的猪新品种或是改变某些性状用来进行医学研究。对转基因猪的研究从上世纪八十年代经过起步期、平台期到现在发展期已经经过了30余年[2]。近年来，随着研究的不断深入和转基因技术的日趋完善，转基因猪的制备及应用达到了新的高度逐步向产业化方向迈进。
1.转基因猪的研究进展
1.1转基因猪的研究历史与现状
转基因动物试验最早可追溯到1974年，Brackets等将兔的精子与SV40病毒DNA孵育后,进行体外受精获得转基因兔。1980年,Gordon[3]等首次报道使用原核注射技术获得了转基因小鼠。此后，转基因动物的研究得到关注，各国相继展开对转基因动物的研究。第一头转基因猪诞生于1985年，是Hammer[4]等利用显微注射技术人生长激素融合基因( MT/hGH) 注射入猪受精卵中，然后将受精卵移植入发情母猪得到。1989年Prather[5]等以猪卵母细胞为受体介质，以猪四细胞期胚胎卵裂球作为供体核进行移植得到一头克隆猪。2001年，Golovan[6]等将植酸酶转入了约克猪的唾液腺中，使其成功表达获得了能自行生成肌醇六磷酸酶的植酸酶转基因猪。2002 年，Lai[7]等成功制备了转绿色荧光蛋白（EGFP）基因猪。2006年，Kurrome[8]等使用精子介导法与胚胎移植技术成功培育出一头含hALB和EGFP 基因的转基因猪。2013年，Miles[9］等通过构建标记20S蛋白酶的PSMA1-EGFP 通过受精作用成功获得了携带绿色荧光蛋白酶的转基因猪。
我国第一头转基因猪诞生于1992年。 魏庆信等采用显微注射和猪精子载体介导两种方法向湖北白猪体导内入OMT /PGH 基因，获得了首批转生长激素的转基因猪，这揭开了我国对转基因猪的研究序幕［10］。1997年，赵浩斌[11]等将杜洛克猪卵核移植到湖北白猪去核卵母细胞中并最终得到了5头核移植猪。2003年，郑新民等制备出转人血清白蛋白( HSA) 的基因猪［12］；2008年，刘忠华等［13］成功获得了我国首例 EGFP转基因克隆猪。2009年，王铁东等［14］培育出了稳定表达针对猪瘟病毒的shＲNA的转基因克隆猪。2010年，孙金海教授等人利用精子介导法成功获得了转pGH基因猪[15]。2013年，樊娜娜等［16］成功获得了首例piPSC克隆猪。
1.2 转基因猪的制备
转基因技术自产生到现在不过短短几十年，但其发展迅速，技术手段也不断革新，转基因动物的成功率也大大提升。目前转基因动物制备技术有：精子载体法、显微注射法、逆转录病毒感染法、体细胞核移植技术、胚胎干细胞介导法、徒手克隆法等。
1.2.1 精子载体法
精子介导基因转移（sperm-mediated gene transfer ，SMGT）又称精子介导法，是一种简单高效的转基因动物制备技术。将含有目的基因的载体与新鲜的精子混合在一定的温度下培育孵化一段时间，使目的基因结合到精子体内，然后进行人工授精使精子与卵细胞结合形成含有目的基因的受精卵，最终得到转基因动物,此方法是Lavitrano[17]等在1989年创建。此方法的原理是利用精子具有吸附结合外源DNA的能力[18]，将外源目的基因整合到精子体内，然后利用精卵结合生产出转基因动物。此方法成本低，操作简单，整合率高而且不会因为机械操作损伤内核等优点。但精子介导法无法实现定点修饰基因组，其可重复性差，结果不稳定。
1.2.2 显微注射法
显微注射法是当前效果最好、应用最广的制作转基因动物的方法[19]。此方法是由Cordon[20]发明，Lin等在1966年首次报道了此方法[21]。显微注射法是在显微仪器下用微吸管直接将外源基因注射到受精卵的细胞核中，然后将受精卵通过胚胎移植手段移植到母畜体内孕育得到转基因动物。著名的“超级小鼠”便是利用显微注射技术制备，1982年Palmiter[22]将5’调控区缺失后的大鼠GH基因与小鼠的Metallothionein-I基因结合，然后利用显微注射技术将融合基因注射进小鼠雄原核中制备而成。
显微注射法自发明以来广泛应用，当前世界上已经有众多实验室建立了相关的标准试验程序。显微注射法的优点在于外源基因整合到染色体上的效率高；导入的外源基因片段大，可达100Kp；实验所需时间短，可以加快制备转基因动物的周期；可以不需要载体直接进行注射；但是，显微注射技术在实际生产应用受许多因素制约。显微注射需要专门的仪器，其价格昂贵操作繁琐，需要培训专门的技术人员进行操作，成本高。据统计，利用显微注射技术生产一头转基因牛的成本高达30万美元[23]。显微注射会对受精卵造成机械损伤且损伤效应具有不确定性。显微注射进行转基因动物生产，只会增加DNA而不能定点修饰基因片段也不能切除原有的DNA序列，外源基因注射到核内后与染色单体的整合位点是随机的，不能保证遗传的稳定性和基因的表达，得到基因后代概率低，并且存在致癌风险[24]。
1.2.3 逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体法是利用将外源目的基因以RNA病毒作为载体，通过人为感染宿主细胞，使其在宿主细胞体内以其RNA为模板进行反转录得到cDNA，cDNA能够通过其特殊的末端序列整合到宿主基因组中成为宿主基因组的一部分，从而能长期稳定的表达。此方法一般采用将病毒基因用目的基因替换重组产生高滴度的病毒颗粒，然后用其感染受精卵或者处于着床前期或者着床后期的胚胎，也可以采用胚胎与能释放逆转录病毒的单层细胞共同培养的方法使胚胎感染，最后获得转基因动物。该制备转基因动物的方法最早由Janenisch[25]等在1974年开展研究，他们将SV40DNA注入小鼠胚囊腔中，发现SV40DNA在小鼠体内有整合。在这之后，他又以Murine leukosis virus（MLV）作为载体，成功地将外源基因导入到小鼠胚胎中，进而整合到小鼠的基因组[26] 。在转基因猪制备方面，2003年，Hofmann等［27］以该方法成功地将EGFP基因用慢病毒载体LV-PGK转入猪受精卵中，制备了EGFP转基因猪。2009年,Ｒamsoondar等［28］利用逆转录病毒载体法将 anti-gag and-pol shＲNAs基因导入猪基因组中，成功制备了能够表达小干扰ＲNA的转基因猪。2012 年，Zhang等［29］ 通过缺陷型慢病毒载体携带外源基因与精子共同孵育，成功培育了6头转基因猪。
逆转录病毒法的优点在于技术并不复杂，不需要昂贵的精密仪器设备；效率高，是原核显微注射法的近50倍；整合效果稳定，目的基因能够以单拷贝形式插入到宿主染色体内，数量可控；基因表达效率高，出现嵌合体的几率低，整合位点较少发生重排；当前已经有商业化产品，简化了试验流程。但逆转录病毒载体转染法也存在诸多缺陷：逆转录病毒载体的容量小，其携带得外源基因片段长度受到限制，只能在7 kb以下难以实现大片段DNA的转移；外源基因难以突破血胎屏障，血脑屏障，成功效率较低；安全性低，染色体上的整合位置不确定，有插入突变、激活癌基因的潜在危险，不宜用于商业化生产转基因动物[30]。
1.2.4 体细胞核移植技术
1996，首例体细胞核移植哺乳动物，克隆羊“多利”的诞生，引起世界轰动。体细胞克隆技术即体细胞核移植技术是利用细胞核的全能性，将体细胞核移入去核卵母细胞中，使其发生再程序化并发育为新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物个体。转基因动物的制备可以利用体细胞克隆技术，通过转基因技术将外源基因导入到细胞核中，再通过体细胞克隆技术将其移植到去核卵母细胞中，经妊娠分娩最终获得转基因动物。该技术是以克隆技术为基础，优点在于外源基因的整合率极高，能够在细胞水平上对基因组进行特定的改造。通过对导入外源基因的供体细胞进行阳性后再进行核移植可以100%的得到转基因动物，并且不会存在嵌合体问题。其缺点是该技术目前还不成熟，有许多技术上的细节需要完善；另外体细胞核移植克隆的效率不高， 需要大量的受体动物及卵母细胞；成本较高，需要精密的仪器与熟练的技术人员进行操作。体细胞核移植技术自克隆羊多利诞生以来，已被应用并制备出转基因绵阳[31]、奶山羊[32]、牛[33]、猪[34]等克隆动物。在基因打靶技术兴起后，通过与基因打靶技术相结合，使体细胞核移植技术制备转基因动物得到了更迅速的发展。基因打靶绵羊[35]，无疯牛病牛[36]，基因敲除猪等相继诞生，2003年，赖良学等［37］以Fetal Fibroblasts（PGEF）作为供体，通过体细胞核移植技术，成功获得了转基因克隆猪。2009年，潘登科等［38］将 sFat-1 基因转染到大白猪PGEF，然后以得到的转基因细胞为核供体移植到体外成熟的去核猪卵母细胞中构建克隆胚胎，通过胚胎移植将构建的的克隆胚胎移植到妊娠母猪子宫中，最终成功制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因 sFat-1 猪。2010年，Kwang等［39］运用核移植技术，将人的补体调节蛋白 CD59 转入猪原始生殖细胞中，成功得到了能够表达hCD59的转基因猪。2013年，鲁月等［40］成功以五指山小型猪为实验材料得到了转单体红色荧光蛋白的转基因猪。随着科学的发展，去核方法，激活及重建胚培养，供体细胞和受体的融合效率等技术不断进步，有学者认为，转基因动物克隆技术有望成为21世纪创建遗传工程动物主导技术 [41]。
1.2.5 胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类未分化细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。通过将外源目的基因导入ESCs，再将其注入到囊胚中，然后将囊胚植入到妊娠母体子宫内最终得到转基因动物。此方法优点在于人为地可操控性强，可以对转入外源基因的ESCs进行阳性表达的检测，筛选理想的细胞进行移植大大提高转基因动物的生产效率。但是胚胎干细胞介导法技术含量要求高，需要进行细胞培养建立良好的ESCs细胞系才能进行后续操作。另外，胚胎干细胞的分化方向无法人为控制，具有不确定性。当前，只有小鼠的胚胎干细胞可供商业应用，其他胚胎干细胞都处于实验室研究阶段。
1.2.6 徒手克隆法
徒手克隆技术（HMC）是指不借助显微仪器生产胚胎的技术，此技术起源于丹麦，由Peura等[42]在1998年生产牛克隆胚胎时建立。Vajta等对此方法进行了进一步的完善并且其使用该方法在2004年和2007 年成功获取了健康牛犊和7头艾斯海默症的猪[43]。徒手克隆技术于2006年在丹麦奥胡斯大学(Aarhus University)成功应用到克隆猪上[44]。与传统核移植相比，徒手克隆具有操作难度小，不需要昂贵的设备，去核率和融合率高等优势。2007年，深圳华大基因的杜玉涛等［45］ 运用徒手克隆技术成功制备了克隆猪， 并将徒手克隆技术与传统的克隆技术进行比较，最后得出徒手克隆技术获得的克隆猪后代可能比传统的克隆猪后代更为健康。2012年南京农业大学李娟等通过徒手克隆技术得到8头转基因猪[46]。
综上6种方法各有利弊，精子载体法方便简单成本较低，不需要高端的仪器设备，转染的效率高，不会对卵母细胞造成损害但存在可重复性差、转染效果不稳定等弊端。显微注射法试验周期短、方法简单稳定而且对插入的基因片段没有限制，但其操作要求高需要专门的技术人员和昂贵的实验仪器设备，并且不能控制整合拷贝数及拷贝位点。逆转录病毒感染法效率高、整合效果稳定，但存在致癌危险。体细胞核移植技术能够在细胞水平上对基因组进行特定的改造，对外源基因的整合率达到100%，但其技术并不成熟，体细胞核移植克隆的效率也不高。胚胎干细胞介导法可以提高转基因动物的生产效率但技术要求高且胚胎干细胞的分化方向不可控。徒手克隆法作为近几年发展完善转基因动物生产技术，其操作无需借助显微设备、操作简单、去核率和融合率高，但应用范围较窄。
1.3 转基因猪的应用
由于动物的繁殖周期长、繁殖年限短，传统的通过杂交手段进行动物育种需要耗费几年甚至几十年的时间，容易受到外界因素的影响，并且不能打破物种隔离。转基因技术的出现为动物育种提供了全新的方式。动物基因工程育种是利用现代转基因技术，将外源基因导入动物基因组， 使其在动物体内融合并表达， 培育出具有新的遗传特性的转基因动物。转基因技术能够打破物种间的生殖隔离，缩短育种年限，在短期内培育出常规方法难以育成或不能育成的动物新品种，增高了动物新品种选择效率，利用现代中分子生物技术可以将定向的目的基因转入动物体内，加快了动物品种的改良进程提高了动物育种效率，因而转基因技术在动物育种方面具有极高的研究价值。目前动物基因工程的育种方向主要包括改善动物的肉质、提高动物的生产性能、提高动物的抗病能力等。
1.3.1提高动物生产性能
1987年，Pinkert[47]等将牛生长激素基因（BST gene）利用显微注射技术注入到猪的受精卵中，得到了8头转BST基因猪。经过后期的测定对比发现，转基因猪在饲料转化率、生长速度和平均日增重方面较非转基因猪具有明显的优势。1989年，Pursel[48]等将IGF-1基因导入到猪体内首次获得了能够表达IGF-1的转基因猪，其生长速度也有明显的加快。在1998对首个转IGF-1基因猪群的测定表明，转基因猪的瘦肉率增加了6%-8%而脂肪减少了10%。1989年陈永福等将构建融合的OMT/pGH基因转入到湖北白猪受精卵中，成功获得了转pGH基因猪，经世代观察测定，与同窝非转基因猪相比转基因猪饲料效率提高了10%、生长速度提高了11.8%-14.8%[49]。
1.3.2改善肉质
2004年，Saeki等［50］从菠菜根部提取得到FADZ基因，利用显微注射法将其导入到猪的基因组中，成功培育转FADZ基因猪，这种转基因猪体内的Unsaturated fatty acid（UFA）含量与普通猪相比高20% 大大提高了猪肉品质。2006年，Lai[51]等将Caenorhadits elegans的FAT-1 基因导入猪的基因组，通过体细胞克隆技术成功培育出了富含不饱和脂肪酸的转基因克隆猪，其体内不饱和脂肪酸含量明显提升饱和酸含量下降，此技术若用于实际生产将会改善人们的饮食结构，对预防食用饱和脂肪酸引起的疾病有积极作用。另外相关试验研究表明，通过基因敲除技术将调控肉质酸度的Rendement Napole的基因敲除能够改善肉的嫩度[52]。
1.3.3 提高动物的抗病能力
发展健康养殖业是新经济形势下的需求，但养殖过程中猪病频发不仅造成经济损失而且会产生药物残留等食品安全问题。培育抗病能力强的新品种，从遗传本质上提高抗病能力可以减少药物的使用，促进养猪业健康发展，为实现早日中国梦添加动力。通过转基因技术将外源的抗病基因整合到的易感动物体内，或者敲除动物体内的致病基因可以培育出具有抗病能力的动物新品种。此外 , 在深入研究病原体基因组结构的基础上 寻找制备能够抵抗该病原体的反义基因,将反义基因整合到易感动物体内，可以使侵入易感动物机体的病原体所产生的mRNA不能表达，从而起到抗病作用[53]。1993年，Staeheli[54]等将含有编码小鼠黏病毒抗性蛋白的构建基因转移到猪体内，但是未能在转基因猪体内检测到小鼠黏病毒抗性蛋白。1998年，王铁东[55]等，将抗猪瘟病毒的核酸酶基因倒入猪体内，成功制备得到抗猪瘟病毒的转基因猪。2004 年,Kuroiwa[56]等敲除了牛编码的基因，可以用此技术生产无疯牛病牛。另据报道，国外相关研究人员已成功制备转抗体免疫球蛋白基因猪，其能产生抗病活性单克隆抗体[57]。
1.3.4研究人类疾病的动物模型
猪在解剖学、生理学及染色体结构等方面与人类接近，是很好的研究人类疾病的动物模型。通过转基因技术构建人类疾病的基因修饰猪模型，可以在分子水平上研究相关疾病的发病机理、寻找疾病早期的分子标志为疾病的治疗寻找新的方法和药物。2010年，Yang等［58］利用体细胞核移植技术成功制备得到6头亨廷顿舞蹈症转基因猪，并且发现转基因猪的大脑中存在神经细胞凋亡现象，这与人类亨廷顿舞蹈症患者相似。同年，陈立梅等［59］通过体细胞核移植技术成功获得Mxl-Cre 转基因猪， 该研究为利用Cre /loxP系统研究人类疾病发病机制奠定基础。2013年，魏红江[60]等成功制备出敲除抑癌基因P53的小型猪肿瘤模型以及敲除P53基因的同时转入两个致癌基因C-Myc和H-Ras的小型猪模型，这为研究相关基因的功能及相关肿瘤发生机制具有里程碑式意义。
1.3.5动物生物反应器
目前，重组药用蛋白广泛的应用于人类疾病治疗和保健领域，其需求量日益提高。通过利用转基因技术生产能够高效表达外源蛋白的转基因动物可以工业化的生产相关功能蛋白，带来巨大的社会和经济效益[61]。目前，世界上许多国家的公司已经利用转基因动物生物反应器进行医用蛋白的生产如：美国的GTC Biotherapeutics 公司利用山羊乳腺生物反应器生产的阻止遗传性抗凝血酶缺陷症患者体内形成过多血栓的重组人抗凝血酶 III( 商品名: ATryn)；荷兰Pharming公司利用转基因兔生产的治疗遗传性血管水肿病的单克隆抗体药物 Ｒuconest。
1.3.5移植器官供体
随着医学的进步，人体器官移植技术日趋成熟，但是由于人类供体的短缺限制了其发展及应用。猪的器官在体积形状及遗传物质方面与人类十分相似，并且来源广泛不存数量庞大在社会伦理问题，因此作为理想的器官供体受到医学界关注。最早在16世纪初期，人们开始尝试异种间的细胞和组织移植[62]。1905年，Princeteau[63]成功地将健康的兔肾移植到肾衰竭的儿童患者体内，成为首个成功的异种器官移植案例。异种移植的主要问题在于超急排斥反应（hyperacute rejection，HAR）,而通过转基因技术可以对供体动物进行遗传改造可以改善该问题[64]。1995年，Cozzi等［65］将人的的衰变加速因子(human decayaccelerating factor、hDAF)转移至猪的胚胎中， 成功获得27头能够不同程度表达了hDAF的转基因猪并在2000年将转人衰变加速因子基因猪的肾脏成功移植到猕猴体内，发现HAR受到一定程度抑制。
1.4转基因猪的发展前景
随着生命科学和分子生物技术的高速发展，转基因技术日趋成熟，转基因动物及其相关产品显现出广泛的应用前景和巨大的经济价值。通过运用转基因技术可以加速新品种猪的培育，定向生产出人们所需的转基因猪品种。在人类医疗方面，转基因猪也具有不可比拟的优势，利用转基因猪生产医用蛋白，为器官移植提供供体。但是转基因动物的研究仍处于发展阶段，仍有许多问题需要解决和完善。例如外源基因的转化率不高，染色体整合的位置不确定，世代遗传后外源基因的稳定性不确定，转基因猪获得效率低且存在畸形等，另外转基因转基因猪的猪肉需要长期试验验证其安全性。总之，我们要以发展的眼光对待转基因动物技术，相信随着日后研究的深入和技术的发展，转基因动物生产技术将会给生物科学领域带来巨大变革。
2. 猪生长激素的研究概况
猪生长激素（Porcine Growth Hormone，pGH）又称猪促生长素（Pocine Somatoropin，PST），是猪垂体前叶的嗜酸性细胞分泌的一种单链多肽类激素[66]。pGH具有调节动物的生长发育的作用，因此自发现以来便是研究的热点。
2.1 pGH基因的结构特点
1983年，Sccburg等首次成功克隆不含5’端非编码区的pGH基因。1987年，Vize等[67]确定了该基因的全序列。pGH基因全长2231bp，分子量22kD，成熟的pGH含有约190个氨基酸残基[68]。Thomoson[69]通过细胞杂交和猪鼠杂种细胞的方法定位该基因位于12号染色体短臂1区1带。pGH基因包含5个外显子