南京大学分子生物学13讲.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,Nanjing,University,分子生物学,授课教师：张敏跃,办公室：分子楼,4,楼,电话：,3595108,第一章 绪 论,第一节 分子生物学发展的基础,一、创世说和进化论,（一）三个与一切生物学现象有关的,问题：,生命是怎样起源的？,为什么,“,有其父必有其子,”,？,动、植物个体是怎样从一个受精卵发育而来的？,（二）创世说,上帝创造了世间万物，包括人类。,（三）达尔文学说,1859,年,达尔文,发表了著名的,物种起源,一书，提出了进化论学说。其进化论思想的精髓可概括为,“,物竞天择，适者生存,”,几个字。他认为世界上的一切生物都是可变的，物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的。,二、细胞学说的建立,十七世纪末十八世纪初,，荷兰的,Leeuwenhoek,制作了世界上第一台显微镜，并观察了诸多生物样本。,大约与其同时代的,Hooke,第一个提出,“,细胞,”,一词。,十九世纪，,德国植物学家,Schleiden,和动物学家,Schwann,建立了细胞学说。他们认为：,所有组织的最基本单元是形状非常相似而又高度分化的细胞。细胞的发生和形成是生物界普遍和永久的规律。,三、经典的生物化学和遗传学,进化论和细胞学说的结合，产生了现代生物学。而以研究动、植物遗传变异规律为目标的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。,（一）经典的生物化学的成就,十九世纪，,人们就已经发现了蛋白质。到,二十世纪初,，组成蛋白质的,20,种氨基酸被相继发现。,Fisher,还论证了连接相邻氨基酸的,“,肽键,”,的形成。细胞的其他成分，如脂类、糖类和核酸也相继被认识和部分纯化。,1869,年，,Misescher,首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到,DNA,。,1910,年，德国科学家,Kossel,首先分离得到了腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸。,（二）经典遗传学的建立和发展,1865,年，奥地利科学家,孟德尔,（,Gregor,Mendel,）发表了,植物杂交试验,一书，提出了遗传学的两条基本规律：,统一律,和,分离律,。他认为：,生物的每一种性状都是由遗传因子控制的，这些因子可以从亲代到子代，代代相传。,1909,年，丹麦遗传学家,W.Johannsen,首先使用,“,基因,”,一词。,二十世纪初,，美国遗传学家,Morgan,提出了基因学说。他指出：,种质必须由独立的要素组成，我们把这些要素称为遗传因子，或者简单地称为基因。,Morgan,及其助手发现了,连锁遗传规律,，并且第一次将代表某一性状的基因，同某一特定的染色体联系起来。,第二节 分子生物学发展简史,分子生物学的定义：,是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。,1928,年英国科学家,Griffith,等人发现肺炎链球菌可以引起肺炎，导致小鼠死亡。,1944,年美国,微生物学,家,Avery,通过肺炎链球菌对小鼠的感染实验，证明,DNA,是遗传信息的载体。,1953,年,Watson,和,Crick,提出,DNA,右手双螺旋模型，于,1962,年和,Wilkins,共享诺贝尔生理医学奖。,同年，,Sanger,首次阐明了胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河，他于,1958,年获诺贝尔化学奖。,1954,年,Crick,提出遗传信息传递的中心法则。,1958,年，,Meselson,和,Stahl,提出了,DNA,的半保留复制。,1961,年，法国科学家,Jacob,和,Monod,提出了调节基因表达的操纵元（,operon,）模型，,1965,年获得诺贝尔生理医学奖。他们还首次提出了信使核糖酸（,mRNA,）的存在及作用。,同年，,Nirenberg,等人应用合成的,mRNA,分子,poly(U),破译出第一批遗传密码。,1966,年，美国科学家,Nirenberg,等人破译了全部的,DNA,遗传密码，,1969,年与,Holley,和,Khorana,分享了诺贝尔生理医学奖。,1967,年发现了可将,DNA,连接起来的,DNA,连接酶。,1970,年,Smith,、,Qilcox,及,Kelley,分离到第一种可以在,DNA,特定位点将,DNA,分子切开的限制性核酸内切酶。同年，美国的,Temin,和,Baltimore,发现,RNA,肿瘤病毒中存在逆转录酶，他们于,1975,年共享诺贝尔生理学奖。,1972,年，,Berg,、,Boyer,等人第一次成功地完成了,DNA,重组实验。,1974,年，首次实现了异源真核生物的基因在大肠杆菌中的表达。,19751977,年，美国人,Sanger,和,Gilbert,发明了快速,DNA,序列测定技术，并于,1977,年完成了噬菌体,X174,基因组（,5386bp,）的序列测定。,1980,年,Sanger,和,Gilbert,与,Berg,分享了诺贝尔化学奖。,1982,年,Prusiner,提出,“,感染性蛋白质颗粒,”,的存在；次年将这种蛋白颗粒命名为阮病毒蛋白（,prion protein,PrP,）。,1997,年，,Prusiner,因为发现朊病毒而获得诺贝尔生理医学奖。,1984,年，德国人,Kohler,、美国人,Milstein,和丹麦科学家,Jern,由于发展了单克隆抗体技术而分享了诺贝尔生理医学奖。,1986,年，,Mullis,发明了,PCR,技术。,1993,年,Mullis,与第一个设计定点突变的,Smith,共享了诺贝尔化学奖。,1988,年,Waston,出任,“,人类基因组计划,”,首席科学家，举世瞩目的人类基因组测序工作开始启动。,1993,年，美国科学家,Roberts,和,Sharp,由于在不连续基因方面的工作而获得诺贝尔生理医学奖。,1996,年，酵母基因组,DNA,的全部序列测定工作完成。,2000,年,6,月,26,日,，人类基因组工作框架图绘制完成,第三节 人类基因组计划,（,Human Genome Project,，,HGP,）,一、问题的提出,70,年代对人类基因组的研究已具有一定的雏形；,1986,年著名遗传学家,Mckusick V,提出从整个基因组的层次研究遗传学的科学称,“,基因组学,”,；,同年，诺贝尔奖获得者,Dulbecco,R,在,Science,杂志上发表了题为,“,癌症研究的转折点,人类基因组的全序列分析,”,，得到了世界范围的响应；,1986,年美国能源部宣布实施这一草案；,1987,年美国能源部（,DOE,）和国家健康研究院（,NIH,）为,HGP,下拔了经费,1.66,亿美元，开始筹建,HGP,实验室；,1988,美国成立了,“,国家人类基因组研究中心,”,由诺贝尔奖获得者,Watson J,出任第一任主任。,二、世界的行动,1987,年，意大利的国家研究委员会（,NRC,）组织了,15,个（后来发展到,30,个）实验室，开始,HGP,的研究；,1989,年,2,月,，英国的,HGP,开始启动,;,1990,年,6,月,，法国的国家,HGP,开始启动；,同月，欧共体通过了,“,欧洲,HGP,研究计划,”,，主要资助,23,个实验室；,1990,年,10,月,1,日,美国国会正式批准美国的,“,HGP,”,启动，计划在,15,年内投入至少,30,亿美元进行人类全基因组的分析；,1994,年初，在吴旻、强伯勤、陈竺院士和杨焕明教授的倡导下，中国的,HGP,开始启动；,1998,国家科技部在上海成立了,中国南方基因中心,，由陈竺院士挂帅；,1998,年,1999,年成立了,中国科学院北京人类基因组中心,和,北方人类基因组中心,，由中科院遗传所的杨焕明教授，强伯勤院士等人牵头；,1995,年,6,月，德国正式开始,HGP,。,三、任务与进展,（一）遗传图谱（,genetic map),：,，定义,又称,连锁图谱,（,linkage map),或,遗传连锁图谱,（,genetic linkage map),，是指人类基因组内,基因,以及,专一的多态性,DNA,标记,(marker),相对位置的图谱，其研究经历了从经典的遗传图谱到现代遗传图谱的过程。,，,经典的遗传图谱,（以基因表型为标记）,，,现代遗传图谱,（以,DNA,为标记）,第一代多态性标记：,限制性片段长度多态性,（,restriction fragment length polymorphism,RFLP),，位点数目可达,10,5,以上。,第二代多态性标记：,小卫星,/,可变数量串联重复,（,minisatellite,/variable number tandem repeat,VNTR),及微卫星,/,简短串联重复,（,microsatellite/simple tandem repeat,STR),。个数在,6000,个以上。其中,STR,具高度多态性，有的可形成几十种等位片段，是目前在基因定位的研究中应用最多的标记系统。,第三代多态性标记：,单核苷酸多态性,（,single nucleotide polymorphism,SNP),。这种标记在人类基因组中多达,300,万个。,，构建遗传图谱的基本原理：,真核生物在,减数分裂,过程中染色体进行,重组,和,交换,，染色体上任意两点之间发生重组和交换的概率随着两点之间相对距离的远近而发生变化。,，构建遗传图谱的意义：,通过,连锁分析,，可以找到某一致病基因或表型的基因与某一标记邻近（即紧密连锁）的证据，从而可把这一,基因定位,于染色体的特定区域，再对基因进行分离和研究。,（二）物理图谱（,physical map):,：,，定义,用物理学方法构建的由不同的,DNA,结构,按其在染色体上的,原始顺序,和实际距离排列的图谱。,，内容,基因组的,细胞遗传学图,（,cytogenetic map,，即染色体的区、带、亚带）；,序列标签位点,(sequence-tagged site,STS),图谱,；,DNA“,重叠群,(contig),”,图谱,：把基因组文库中含有相同,STS,序列的,DNA,克隆按照其在原始基因组上线形顺序进行排列，连接成相互重叠的,“,片段重叠群,(contig),”,。是构建物理图谱的主要任务；,大片段限制性内切酶切点图,；,cDNA/EST,图谱,；,基因组中广泛存在的,特征性序列,（如,CpG,序列、,Alu,序列等）,的标记图,等。,（三）序列图谱：,2003,年之前完成。,（四）基因图谱：,目标：在人类基因组中鉴别出全部基因的位置、结构和功能；,定位方法：,cDNA/EST,的染色体定位,（实验手段，电子杂交）；,完成时间：,200,？,年完成。,（五）模式生物基因组：,酵母,1996,年,大肠肝菌,1997,年,线虫,1999,年,果蝇,2000,年,拟南芥菜,2000,年,小鼠,2005,年之前完成,第四节,分子生物学的研究内容,一、,DNA,重组技术,（基因工程）,（一）,DNA,重组技术的含义：,指在,体外,将核酸分子插入病毒、质粒或其他,载体,分子，构成遗传物质的新组合，并将之,导入,到原先没有这类分子的,寄主,细胞内，从而使接受者产生,新的遗传性状,的技术。,关键技术：,限制性内切酶,、,DNA,连接酶,及其他,工具酶,的发现和应用。,（二）,DNA,重组技术的建立,（三）,DNA,重组技术的应用,可用于大量,生产,某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽；,可用于定向,改造,某些生物基因组结构,可用于基础,研究,二、基因表达调控研究,生物个体在生长发育过程中，基因表达是按一定的时序发生变化（,时序调节,），并随着内外环境的变化而不断加以修正（,环境调控,）的。基因表达调控研究的主要方面有：,（一）信号转导,（,singnal,transduction),研究,信号转导,：指外部信号通过细胞膜上的受体传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能方面的应答过程。,（二）转录因子研究,转录因子,：是指一群能与基因,5,端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。,（三）,RNA,剪接研究,三、生物大分子结构功能研究,（又称结构分子生物学）,（一）概念：,是研究生物大分子特定的,空间结构,及结构的,运动变化,与其生物学,功能,关系的科学。,（二）结构分子生物学的研究方向：,结构测定；,结构运动变化规律；,结构与功能关系的建立。,（三）结构分子生物学的研究手段,物理和化学手段,：射线衍射的晶体学（蛋白质晶体学）；二维和多维核磁共振；电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法；化学合成；,分子生物学手段,第五节分子生物学的展望,对,神经生物学,的影响,对,遗传学,的影响,对,分类和进化,研究的影响,对,发育生物学,的影响,对,现代医学,的影响,其他,一、分子生物学对生命科学各个领域的渗透,统一生物学,（,general biology),：,生物学范畴内所有学科在,分子水平,上的统一。,二、人类基因组计划的延伸,人类后基因组（功能基因组）研究,（一）蛋白质组（,proteome,）和蛋白质组学（,proteomics),，蛋白质组：由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。,，蛋白质组的动态性,（,1,）,原因：,同一个机体的不同组织和不同细胞；,在同一机体的不同发育阶段；,机体的生理状况；,机体所处的外界环境。,（,2,）,结果：,基因,mRNA,表达种类的改变；,基因表达的不同形式（基因剪接，蛋白质翻译修饰，蛋白质剪接等）。,测定一个有机体的基因组所表达的全部蛋白质。,3,，蛋白质组学的任务：,（二）后基因组研究的研究内容：,人类基因组多样性计划,（,Human Genome Diversity Project,）,环境基因组学,（,Enviromental Genomics,）,肿瘤基因组解剖计划,（,Cancer Genome Anatomy Project,）,药物基因组学,（,Pharmacogenomics,）,核心问题：,基因组的多样性；,遗传疾病产生的起因；,基因的表达调控作用；,蛋白质产物的功能。,第二章 遗传的物质基础,第一节 遗传物质的本质,一、,DNA,是遗传物质,（一）、,DNA,是遗传物质的证明,1928,年,Griffith,等进行的肺炎球菌,转化,（,transformation,）实验,1944,年,Avery,证明,DNA,是遗传物质,（二）,DNA,携带两类不同的遗传信息,1，负责基因结构的信息,2，负责基因选择性表达的信息,二、,RNA,也可作为遗传物质,（一）,RNA,病毒,病毒颗粒,（,viron,）：由病毒,RNA,基因组和包被在外的蛋白质外壳组成,病毒的生存方式,：病毒编码包装基因组所需的蛋白，以及一些在感染循环中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白质由宿主提供。因此病毒不能独立生存。,（二）类病毒,（,viroid,）,类病毒,:,是使高等植物产生疾病的有传染性的因子，由很小的,环状,RNA,分子构成。与病毒不同，类病毒的,RNA,本身就是感染因子。,类病毒,只由,RNA,组成，其中广泛存在不完全的碱基配对，形成一种特有的,棒状结构,。类病毒的基因组,不能,编码蛋白质。,类病毒的复制,：必须由宿主的酶来完成，其,RNA,作为模板。,类病毒对宿主的影响,：类病毒可通过复制占有宿主细胞中关键的酶，从而影响宿主细胞的正常功能；类病毒也能影响必需的,RNA,的产生而引发疾病；它们还可以作为一个不正常的调控分子，对个别基因的表达产生特殊的影响。,三、是否存在核酸之外的遗,传物质？,（一）朊病毒,（,prion,）：,是一个,28KDa,的疏水性糖蛋白，由细胞的核基因编码，在,正常,动物的脑组织中有表达。,（二）朊病毒的存在形式：,朊病毒以,感染性形式（,PrP,SC,),，,和,非感染性形式（,PrP,C,）,两种形式存。,（三）两种形式的朊病毒的异同：,PrP,C,PrP,SC,功能,：不详 导致退行性神经疾病,分 布,：正常脑 被感染脑,抗蛋白酶性,：可被完全降解 只能被部分降解,溶解性,：可溶 难溶,一级结构,：两者相同,二级结构,：,40%,螺旋,20%,螺旋,，,50%,折叠,（四）朊病毒的感染方式,PrP,SC,作用需要,PrP,C,的参与,PrP,SC,蛋白的,错误折叠,形式可以,催化,天然,PrP,C,分子从正常的可溶性的,螺旋,构象向不溶性的,折叠,构象,转化,，最终导致了疾病和感染。,（五）朊病毒的多株现象,不同,PrP,SC,株可使,一种,PrP,结构转化为,不同,的构型；而,同一种,PrP,SC,可以在具有,不同,PrP,蛋白的多种生物中传代，即使经过多次传代仍然保持自身的生物学特征。,（六）朊病毒是遗传物质吗？,多株现象难以解释,其感染方式能否被视为遗传复制？,第二节,DNA,的一级结构,一、,DNA,一级结构的组成,一级结构：,4,种核苷酸的连接及其排列顺序,(,一）含氮碱基（,nitrogenous bases,）,DNA,中的常见碱基有：胞嘧啶（,cytosine,C,）、胸腺嘧啶（,thymine,T,）、腺嘌呤（,adenine,A,）和鸟嘌呤（,guanine,G,）,（二）脱氧核糖核苷,（,nucleoside,）,由碱基和戊糖（,D-,脱氧核糖）缩合而成。有,4,种脱氧核糖核苷：,胞嘧啶,脱氧核糖核苷,、胸腺嘧啶,脱氧核糖核苷,、腺嘌呤,脱氧核糖核苷,）和鸟嘌呤,脱氧核糖核苷,+,+,H,2,O,（三）脱氧核糖核苷酸,（,deoxyribonucleotide,）,脱氧核糖核苷和磷酸缩合形成的磷酸酯,所有的核苷酸的,5,位置可以连接一个以上的磷酸基团。从戊糖开始的第一、二、三个磷酸残基依次称为,、,、,核苷三磷酸缩写为,NTP,，核苷二磷酸缩写为,NDP,。,（四）脱氧核糖核酸,（,deoxyribonucleic acid,DNA,）,脱氧核糖核苷酸以,3,，,5,磷酸二酯键,聚合成为脱氧核糖核酸（,DNA,）链。链的一端的核苷酸有自由的,5,磷酸基团,，称,5,端,；另一端核苷酸具有自由的,3,羟基,，称,3,端,DNA,链的方向就是从,5,端到,3,端。,DNA,分子通常以,线性,或,环状,的形式存在。,大多数,DNA,由,两条,互补的单链构成。,少数,生物的,DNA,，如某些噬菌体或病毒是以,单链,形式存在的。,二、,DNA,的碱稳定性,DNA,对碱相对稳定,RNA,在碱性溶液中易降解为,2,，,3,环式单核苷酸中间产物，然后很快转变为,2,单核苷酸和,3,单核苷酸。,三、序列测定方法,（一）小片段重叠法,（二）凝胶直读法,1,，酶法,（,1,）加减法（,Sanger,1975,）,（,2,）末端终止法,(,双脱氧法,/,间接拷贝法,),（,Sanger,1977,）,末端终止法的应用,循环测序（,cycle sequecing),实验及原理,a.,测序反应的设定,体系中包括：,DNA,模板，,TaqDNA,聚合酶，寡核苷酸引物，,4,种,dNTP,和荧光,ddNTP,（,4,种荧光）等；,b.,反应,包括：,DNA,变性，引物与模板配对，,DNA,聚合酶使引物延伸（在引物,3,末端接上,dNTP,或,ddNTP,）；,c.,反应的终止,20-30,个循环后，新合成所有可能的,DNA,片段，每个片段的,3,末端都被接上,ddNTP,，延伸终止；,d.,反应产物电泳分离及检测,在聚丙烯凝胶中，不同大小的,DNA,片段在高压电场作用下迁移，小分子迁移速度快，先被位于凝胶底部的装置检测到。,e.,结果的处理及输出,根据被检测到的,DNA,片段的顺序及颜色，绘出,DNA,片段的电泳图谱。,DNA,序列中的每个核苷酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来,2,，化学法（,Maxam/Gilbert,1977,）,适用于,DNA,短片段的测定,四、一级结构的重要性,携带遗传信息,决定,DNA,的二级结构,决定,DNA,的空间结构,第二节,DNA,的二级结构,一、,DNA,螺旋的几种构象及其动态平衡,（一）,Watson,Crick,右手双螺旋结构,（,B-DNA,构象）,相对湿度为,92%,时，,DNA,钠盐纤维为,B-DNA,构象。在天然情况下，绝大多,数,DNA,以,B,构象存在。,1,，主链,:,2,，碱基对,3,，螺距,4,，大沟和小沟,（二）,A-DNA,构象,为相对湿度改变（,75%,以下）或由钠盐变为钾盐、铯盐，,DNA,的结构可成为,A,构象。它是,B-DNA,螺旋拧得更紧的状态。,DNA-RNA,杂交分子、,RNA-RAN,双连分子均采取,A,构象。,（三）,Z-DNA,构象,在一定的条件下（如高盐浓度），,DNA,可能出现,Z,构象。,Z-DNA,是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈,Z,字性走向。不存在大沟，小沟窄而深，并具有更多的负电荷密度。,B-DNA,、,A-DNA,及,Z-DNA,结构特征比较,B-DNA A-DNA Z-DNA,每圈,bp,数,10-10.6 11 12,每,bp,转角（度）,+34.6 +34.7 -30,每,bp,上升距离（,A,）,3.38 2.56 5.71,螺旋直径（,A,）,19 23 18,B-DNA,是,活性最高,的,DNA,构象，,B-DNA,变成,A-DNA,后，仍有活性，但若局部变构为,Z-DNA,后，,活性明显降低,。,二、决定双螺旋结构状态,的因素,（一）氢键,1,，碱基的氢供体,氨基、羟基,2,，碱基的氢受体,酮基、亚氨基,3,，,G,C,对及,A,T,对之间的氢键,在一定范围内,DNA,的稳定性与,G,C,百分含量成正比（图,1-2,）,4,，氢键数对,DNA,双链稳定性的影响,5,，,碱基之间形成氢键的条件,互补性,方向性,（二）碱基堆集力,1,，碱基堆集力,同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力,2,，碱基堆集力的来源,疏水作用,累积的,Van der Waal,的作用力,3,，碱基堆集作用的证据,单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则螺线结构,破坏疏水作用和双链的氢键可降低,DNA,的稳定性,（,三）带电荷的磷酸基的静电斥力,磷酸集团的负电对,DNA,双链的稳定性起负作用。阳离子可对之产生屏蔽。,DNA,溶液的离子浓度越低，,DNA,越不稳定。,（四）碱基分子内能,碱基内能越高，氢键和碱基堆积力越容易被破坏，,DNA,双链越不稳定,第三节,DNA,的高级结构,一、正超螺旋和负超螺旋,（一）形成超螺旋的原因和条件,原因,：因某种原因引入了额外的螺旋,条件,：,a,DNA,双螺旋闭合或被蛋白结合，末端不能自由转动；,b,DNA,双链上无断裂,（二）正超螺旋,（二）负超螺旋,二、描述,DNA,螺旋状态的带子模型,(,一）,L=T+W,1,，,L,：连接数,（,linking number,）；,specifies the number of times that the two strands of the double helix of a closed molecule cross each other in toto.,2,，,T,：初级螺旋数,（,twisting number,）；,represents the rotation of one strand about the other.,3,，,W,：超螺旋数,（,writhing number,）；,represents the turning of the asis of the duplex in space.,有相同的一级结构，而,L,值不同的,DNA,分子叫做拓扑异构体。在,DNA,双链不发生断裂的前提下，,L,值不变。,（二）,L=W+T,（三）比连接差,（,specific linking difference),；,1,，表达式：,=,（,L-L,0,）,/L,0,（,L,0,：表示松弛环型,DNA,）,2,，含义：,用来表示超螺旋的程度；当初级螺旋数不变时，,代表超螺旋密度。,三、影响,DNA,高级结构的酶,L,值的改变需要至少一条,DNA,链断裂一次。断裂造成的,DNA,自由末段的一断可绕着另一端旋转，随后被重新连接，,DNA,拓扑异构酶,通过催化此类反应将,DNA,从一种拓扑结构转变成另一种。,（一）,I,型,DNA,拓扑异构酶,（图,1-25,）,底物：,DNA,单链,ATP,：不需,酶活性：,DNA,内切酶和连接酶活性,代表：,E.Coli,的,DNA,拓扑异构酶,I,：,可催化,负超螺旋,DNA,转化为,松弛环型,鼠,DNA,拓扑异构酶,I,：对,正、,负超螺旋,有相同的松弛能力,原理：,E.coli,拓扑异构酶识别部分解螺旋的,DNA,分子，与,DNA,单链部分结合后，切断一条链，并以其酪氨酸残基与,DNA,的,5,磷酸相连。磷酸二酯键从,DNA,转移蛋白质上。酶将完整的,DNA,链拉过缺口后（,L,=+1,），重新连接原先单链上磷酸二酯键。,上述过程除了改变,DNA,的超螺旋结构外，还可使单链环状分子形成三叶结构，以及使两个单链环状分子成为环连体分子。（图,1-24,）,（二）,II,型,DNA,拓扑异构酶,底物,DNA,双链,ATP,需要,酶活性,DNA,内切酶和连接酶活性,代表,E.Coli,旋转酶,（,DNA gyrase,DNA,拓扑异构酶,II,），可引入负,超螺旋。无,ATP,时，此酶只能缓,慢地松弛负超螺旋。,E.Coli,的旋转酶还具有,形成和拆开,双链,DNA,环连体和成结分子的能力。,此类酶无碱基序列特异性。,（三）,DNA,拓扑异构酶催化,反应的实质：,其本质是先,切断,DNA,的磷酸二酯键，改变,DNA,的链环数后,再连接,，兼具,DNA,内切酶和,DNA,连接酶的功能。然而这些酶并不能连接事先已经存在的断裂,DNA,，即其断裂及连接反应是,相互偶联,的。,第四节,DNA,的变性、复性、杂交和,Cot,曲线,一、,DNA,的变性,DNA,变性（熔解）：,DNA,被加热或某些试剂的作用下，配对碱基之间氢键和相邻碱基之间的堆集力受到破坏，逐步变为近似于无规则的线团构型即变性,DNA,的过程。,（一）单、双链,DNA,的紫外光吸收,双链,DNA,：,A260=1.0,时，,50,g/ml,单链,DNA,：,A260=1.0,时，,33,g/ml,（单链,RNA,：,A260=1.0,时，,40,g/ml,）,（二）,DNA,的熔解曲线,1,，,Tm,值,：缓慢而均匀地,DNA,溶液的温度，当,A260,增加到最大增值的一半时的温度，叫做,DNA,的熔解温度或熔点，用,Tm,表示。,2,，计算,Tm,值的经验公式,在,0.15mol/L NaCl+0.015mol/L,柠檬酸钠溶液中，当,DNA,长链,G+C,百分含量在,30%,70%,时,Tm,=69.3+0.41,（,G+C,）,%,当,DNA,链长度为,14,70nt,时,Tm,=81.5+16.6lgNa,+,+0.41,（,G+C,）,%,-0.6,甲酰胺,%-600/L-1.5,错配,%,当,DNA,链长度,18nt,时，可近似认为,Tm,=4,（,G+C,）,+2,（,A+T,）,二、复性,DNA,复性：变性,DNA,在一定条件下恢复天然,DNA,的结构的过程。,（一）复性的条件,1,，消除磷酸基的静电斥力；,2,，破坏连内氢键,（二）复性的机制,1,，随机碰撞,取决于,DNA,浓度、溶液温度、离子强度等,2,，成核作用（,nucleation),3,，拉拉链作用（,zippering,）,三、杂交,重要的杂交技术：,Southern Blotting,Northern Blotting,3.In Situ Hybridization,4.Colony,Hybridization,四、,Cot,曲线,（一）,DNA,复性的动力学,1,，单链消失的速度：,-dc/dt=kc,2,C/C,o,=1/(1+kCot),k,：为二级反应常数（单位：,L/mol,秒），,受,DNA,分子,序列的复杂性、阳离子浓度、温度的影响,C:,单链,DNA,的浓度（核苷酸摩尔数,/L,）,当,C=1/2C,0,(,即,DNA,复性一半）时,Cot,（,Cot,）,=,1/k,DNA,分子序列的,复杂性,X,：最长的没重复序列的核苷酸对的数值。,Cot,X,：在,DNA,总浓度相同的情况下，,X,值越小，片段浓度越高，复性时间越短，,Cot,越小。,X=K Cot,（影响,K,值的因素：阳离子浓度、温度、片段大小）,2,，,Cot,曲线,不同物种核酸的,Cot,曲线,3,，原核生物,DNA,的复性动力学（图,1-10,）,原核生物,Cot,曲线,形状,：不同生物曲线形状相似，都是单一序列；,原核生物,Cot,曲线,跨度,：一般只有两个数量级；,原核生物,Cot,曲线,位置,：基因组越大越靠右。,4,，真核生物,DNA,复性动力学,（,1,）真核生物的,DNA,复性曲线（图,2-8,）,真核生物,Cot,曲线,特点,：阶梯状，跨度,7-8,个数量级。,真核生物,Cot,曲线的,组成,：快复性组分,/,中间复性组分,/,慢复性组分,（,2,）,3,种复性组分复杂性的计算,X=KC,0,t,1/2,每种复性成分的实际,C,0,t,值,=,测得的,C,0,t,值,该组分占总,DNA,的百分比,待测样品,DNA,的复杂长度,=,标准,DNA,的复杂长度,待测样品,DNA Cot,/,标准,DNA Cot,化学复杂长度和动力学复杂长度,化学复杂长度,：通过化学方法测量得到的,DNA,长度,动力学复杂长度,：按照复性动力学计算出来的,DNA,复杂长度,基因组的化学复杂长度,单一序列的动力学复杂长度,/,单一序列的百分比,（,3,）每一组分拷贝数（,重复频率,）的计算,重复频率,f,=,化学复杂长度,/,动力学复杂长度,=,（基因组化学复杂度,标准,DNA C,0,t,）,/,（待测,DNA,样品,C,0,t,标准,DNA,样品,动力学复杂长度）,（,4,）同一复性曲线各组分的,Cot,与重复频率的关系,C,0,t,（,1,）：,C,0,t,（,2,）,=f,（,2,）：,f,（,1,）,f,（,2,）,=f,（,1,）,C,0,t,（,1,）,/C,0,t,（,2,）,第三章 基因与基因组,一、基因概念的历史演变,1909,年,W.Johannsen,首先使用,“,基因,”,一词，其含义与孟德尔的,“,遗传因子,”,完全一致。此阶段基因只是逻辑推理的产物。,第一节基因,20,世纪初，,T,H.Morgan,等人提出连锁交换规律和伴性遗传，指出基因在染色体上直线排列。,1926,年,Morgan,在,基因论,中指出基因代表着一个有机的,化学实体,。,1941,年,Beade,和,Tatum,提出了“,一个基因一个酶,（,one gene:one enzyme hypothesis,）,”的假说，认为：基因是一个,DNA,片段，负责编码一个蛋白酶（蛋白质）。当一种蛋白质是由异源亚基构成时，该假说应修正为“,一个基因一条多肽链,”。,1955,年，,S.Benzer,提出了,顺反子,（,cistron,），,突变子,（,muton,）和,重组子,（,recon,）等术语。顺反子学说认为，顺反子是一段编码一种多肽链的核苷酸序列，是一个功能单位。该学说否定了基因是决定遗传形状的功能单位，同时也是,突变,和,重组,的,最小单位,的看法。而突变子和重组子最终被证明是以,单核苷酸对,为单位的。,目前对基因的认识是：,基因,是能够表达和产生基因产物（蛋白质或,RNA,）的,核苷酸,序列。其内容可扩展至包括两侧对基因表达的,起始,和,终止,所必需的,调控序列,。,Gene,(cistron)is the segment of DNA involved in producing a polypeptide chain;it includes regions preceding and following the coding region(leader and trailer)as well as intervening sequences(introns)between individual coding segments(exons).,二、基因的现代概念,1,，,转座成分,（,transposable elements,）又叫做,移动基因,（,movable genes,）,是一些可以在染色体基因组上从一个位置转移到另一个位置，甚至在不同染色体之间跃迁的,DNA,成分。有人将之形象地称为,跳跃基因,（,jumping genes,）。,跳跃基因是由美国女科学家,B.McClintock,于上个世纪的,40,年代后期在玉米中首先发现的。当时称为,激活,-,解离因子,（,activator-dissociation element,，即,Ac/Ds,因子,）。（,P449,）,2,，,断裂基因,（,spliting gene,）,真核基因的核苷酸序列中间有与氨基酸编码无关的,DNA,间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。这种编码序列不连续的间断基因称为,断裂基因,。现已证实，除了真核生物外，少数原核生物，如大肠杆菌,T4,噬菌体中也存在断裂基因。,3,，,假基因,（,pseudogene,）,是一些核苷酸序列与其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成出功能蛋白质的失活基因，通常积累了较多的突变。现已在大多数真核生物中发现了假基因的存在。假基因数量一般较少。,4,，,重叠基因,不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的，即这些基因的核苷酸序列是彼此重叠的，这样的基因称为,重叠基因,（,overlapping genes,）或,嵌套基因,（,nested genes,）。目前已在病毒、噬菌体和少数真核基因中发现了重叠基因。,三、基因的分类,基因按其产物的功能可分为,结构基因,、,调控基因,和,RNA,基因,：,1,，,结构基因,：可被转录形成,mRNA,，并进而翻译成多肽，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等；,2,，,调控基因,：指某些可调节控制结构基因表达的基因。,3,，,RNA,基因,：是一些只转录不翻译的基因，包括核糖体,RNA,基因，专门转录,rRNA,；以及,tRNA,基因，专门转录,tRNA,。,第二节 原核生物的基因组,一、大肠杆菌（,E.coli,）的染色体及其基因,（一）,E.coli,的染色体,类核,：大肠杆菌中可有,2-4,个,DNA,相对集中的区域，即,类核,染色体结构：,E.coli,的染色体,DNA,是一个由,4.2X10,6,碱基对组成的,双链环状分子,。多种,DNA,结合蛋白和,RNA,可使染色体压缩成一个,脚手架,（,scaffold),结构,分成大约,100,个,小区,（,domain,）（图,2-2,）。,（二）,E.coli,的基因组的特点,1,，功能相关的结构基因通常构成,操纵元,操纵元,（,operon,）：大肠杆菌功能上相关的几个结构基因前后相连，由一个共同的调节基因和一组共同的控制位点，即启动子（,promoter,）和操作子（,operator,）对其表达过程实行协同调节控制。细菌基因表达调控的这样一个完整的单元，称为,操纵元,调控元（,regulon,）：,几个操纵元和它们共同的调节基因所构成的基因表达调控单元,2,，蛋白质基因通常以单拷贝形式存在,3,，,RNA,基因通常是多拷贝的,大多数大肠杆菌菌株都有,7,个,核糖体基因（,rrn,）操纵元,，多数,rrn,操纵元分布在,DNA,复制起始位点附近,4,，其他基因的调控形式多样,二、噬菌体,174,的基因组及其基因,（一）,174,噬菌体概况,20,面体，无尾。其,DNA,为单链环状，含,538