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分光光度计使用注意事项剖析

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2020年4月19日
文档仅供参考
分光光度计的使用

一．使用及维护
1. 安装环境
1.1 温度要求：装在不受阳光直接曝晒的房间；最好装空调，使室温维持在（20±2℃）；仪器附近不应有高温的暖气管或其它电热器具；仪器后面板与墙之间应留一定空间。
1.2 湿度要求：水蒸气在（1 350～1 450）nm和（1 800～1 950）nm两个波长区域内有光吸收，会严重干扰测定。潮湿会导致分光器反射膜层斑剥、脱落等。故相对湿度最好保持在（40～75）％。高档紫外－可见－近红外分光光度计要用高纯氮气冲洗。干燥筒内的变色硅胶应及时更换。
1.3 防震、防尘、防腐和防电磁干扰：
2. 光源灯
2.1 拿灯时不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照射后，形成结痕难以去掉.倘若不小心而碰触，应及时用无水乙醇抹擦干净。
2.2 灯有寿命，要节约使用.但工作间歇时间短，不要关灯和停机.
2.3 在灯虽然能点亮，但不稳定或强度大大减弱而影响测量时，就应更换新灯.
2.4应待灯冷却后，再重新启动.启动后预热15-30min才能读数.
2.5不要用眼睛直视灯，因为紫外辐射会损伤人的眼睛。
3. 单色器
3.1单色器是仪器的心脏部分.不要轻易装、拆，也不要去摸触镜面.
3.2 平时要保持内部干燥，及时更换干燥剂，以防止色散元件和反射镜受潮而发霉，测定挥发样品必须使用密封吸收池，以免样品蒸气进入单色器，腐蚀反射镜、透镜及色散元件的镜面.
3.3 如果选定波长和狭缝宽度是用旋钮，则要按说明书规定的方向转动到欲测的位置，切勿来回转动，以防回衡误差.
4. 样品室
4.1 样品室是存放吸收池的地方，防止样品的交叉污染，决不可将样品留在样品室中过夜.
4.2 吸收池的光学面一定要维护好，不能用刷子刷.否则光学面发毛会增加散射而影响测定准确度.保护吸收池最重要的一条是使用后及时清洗，否则留下液痕，日后再洗，事倍功半.用完的吸收池可放在中性肥皂水中(将十二烷基硫酸钠用蒸馏水配制成透明的稀溶液)，或放在8 mol／l盐酸加45％乙醇的等量混合液中浸泡，然后用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，放在无灰尘的地方凉干备用.如果急于使用，可在真空中抽干.但不要用热吹风吹干。
4.3 对于盛过蛋白质和核酸的样品池最好不要用市售的烷基磺化型的清洗剂，因为它们有类似蛋白质的吸收光谱，清洗不慎会引入误差，因此此时最好使用非离子型清洗剂(如triton)浸泡.如果吸收池实在太脏，质量好的吸收池可放在洗液中稍加处理，但要随即取出冲洗，不宜浸泡过长的时间。洗液必须冲洗干净，因为它也有类似蛋白质和核酸的吸收光谱。
4.4 为了精确的定量测定，吸收池应事先进行校正.校正的办法是在池中加入欲测浓度的溶液，读出各吸收池的吸光度.以一个池为标准读出其它各池的吸光度.然后在读取样品吸光度后，再予校正.市售常规光径(10mm)的吸收池一般匹配到0.Olmm.为了某种工作的需要(如差示光谱测定)必须寻找匹配池时，可在池中装入高吸收的样品，读数后加以挑选。一台仪器上的比色皿不得与其它仪器上的比色皿单个调换。比色皿每次用完后应立即用蒸馏水洗净，用软布或擦镜纸擦干，放于比色皿盒内。
5. 倾注溶液时要小心，不要弄湿外壁.如不慎弄湿，可用滤纸轻轻吸干后，再用绸布或擦镜纸擦净(最好用白绸，擦镜纸常有纸毛)。
6. 检测器：检测器室要保持干燥，以保证绝缘良好.在使用光电倍增管时，最重要的一点是通电后避免不必要的曝光。在仪器的光电倍增管的前面(一般在样品室的上方)常有暗闸（微动开关)，这是光电倍增管的保护装置，用来保护其在开启样品室盖时，不受日光照射.否则通电后的光电倍增管，受强光照射，会造成永久性的损坏，或至少因“疲劳"而降低灵敏度。
7.硫化铅光电池忌受紫外线照射，否则会降低其灵敏度。
8.仪器用完后应用罩布盖好，以防落入灰尘。
9.仪器应每半年左右或搬动后应检查波长精度等，以确保仪器性能正常。
二．分光光度计的性能检查
1．波长范围
指分光光度计上限波长和下限波长之间的工作范围，在这个范围内的所有波长应具有足够的能量进行工作.这种检测波长极限是与光源、单色器及检测器的光谱响应特性有关的.如波长范围为190-900nm的紫外-可见分光光度计必须具备氘灯和碘钨灯两个光源，而只有碘钨灯的分光光度计的工作范围，在短波侧不能低于340nm.有时在说明书规定的工作波长范围的两端由于缺乏足够的能量，不能正常工作.如在两端表现为100％T或A设定困难，或基线在两端不平直等，就需要检查可能发生的原因，如光源位置需要调整、光源需要更换、样品室窗口有溶液污染、光路需要调试、检测器疲劳等等。
2．波长准确度
波长准确度(有时被误称为波长精度)是指仪器波长指示器上所指示的波长值与仪器给出的实际波长值之间的符合程度，可用二者之差(即波长误差)来衡量其准确性.如某分光光度计的波长准确度为±1.Onm，那么测定253.65nm汞灯辉线的最大能量应落在252.65nm和254.65nm之间.
波长准确度对分光光度测定是有很大影响的，因为任何分光光度定量分析工作都是依靠在一定波长下测量吸光度值 (此波长大都选在样品的吸收峰位)来完成的.如波长有误差，则由于峰两旁陡坡处吸光度值随波长的变化极为迅速，会造成明显的吸光度误差.如在定性分析时单纯依靠样品的吸收峰来确定波长，可能会造成错误的判断.在有机物质的结构分析中，需要研究吸收峰波长位置与物质结构的关系.如仪器的波长误差较大，显然会影响结构分析的正确性.波长准确度对于窄带分析是非常重要的，但对于宽吸收带则影响不大.常见的检查方法如下：
2．1.用氘灯(或氢灯)的辉线检查
氘灯(或氢灯)为紫外-可见分光光度计必备的光源，因此用它来标定波长最为方便.氘灯虽然在紫外区发射连续光谐，但在可见区有一条辉线，656.1nm(氢灯有两条：656.3nm和486.1nm).
待仪器和氘灯稳定后，选择合适的测定条件：单光束、纵坐标用能量表示、狭缝尽可能小、响应尽可能快、扫描速度慢、图纸速度快.在上述波长附近扫描，或按说明书规定的波长旋转方向慢慢旋转波长钮，读出结果显示最大能量的波长.如果超出允许波长误差，就需进行校正.
2.2 用汞灯的辉线检查
上述用氘灯检查波长只能在少数波长点进行，但对仪器作精密的波长校正，应在整个波长范围的不同区域进行.在紫外-可见区，理想的波长校正基准工具是低压汞灯.
低压汞灯发射不连续光谐(线光谐).在紫外-可见区有很多辉线可供仪器波长校正.方法与用氘灯检查相同.
作为紫外-可见分光光度计任选附件的汞笔灯是进行波长准确度检查的最合适的工具.汞笔灯体积小，携带方便，便于在分光光度计中安放.
2．3 用标准玻璃滤光片检查
对于低档分光光度计(谱带半宽度在10nm左右)只需用标准玻璃滤光片来检查.如钕滤光片，它的最大吸收峰在585nm.只要把滤光片放在样品室中，按操作程序扫描吸收光谱即可.
如果用氧化钬滤光片来检查，则效果会更好.氧化钬滤光片最大吸收波长241.5nm、360.8nm、536.4nm.
2.4 用样品溶液的吸收光谱检查
-些样品的吸收光谐，如氯化钬溶液(最大吸收波长为241.1nm、333.4nm、361.5nm)、硫酸钴、硫酸铜、铬酸钾、重铬酸钾溶液都可用作波长校正的参比.但用样品溶液校正不及用光源的谱线校正精确.
仪器引起波长误差的原因大致如下：工作环境温度变化太大、单色器受震后引起色散元件移位、波长扫描系统机械零件磨损、仪器积尘太多使转动受阻、光谱记录纸受潮伸缩变形等.
3. 波长重复性
波长重复性是定性分析的重要因素，由于波长位置不能准确重复，就不能准确判定吸收峰的位置，甚至引起判断错误.
用一个已知样品吸收峰或灯的辉线作标准，在相同条件下多次重复读取峰位.计算每次观察的波长对平均值的偏差，这些偏差的平均值就是此分光光度计的波长重复性.
引起波长重复性下降的原因与引起波长误差的原因相似，当然电子系统工作不稳定也是原因之-。
4. 谱带半宽度
谱带半宽度又称有效带宽，这里是指离开单色器的出射狭缝的辐射光谱的峰高的一半处的谱带宽度.光源辉线或锐的吸收光谱都可用于分光光度计谱带半宽度的检查.
谱带半宽度这个性能指标直接影响样品测量的准确度.使用2nm谱带半宽度的检测效果显然要比20nm好得多.如使用微量池，必须使用谱带半宽度小的分光光度计，否则从出射狭缝来的光斑会超过样品池的宽度，而给测定带来误差.
分光光度计谱带半宽度不符合性能指标常常是由于单色器中狭缝系统或狭缝伺服系统的故障，应请专业人员协助修理。
5. 杂散光
杂散光是指由检测器接收到的任何由仪器单色器分离的光谱范围以外的辐射.
杂散光能够分成两种形式，一种是杂散光波长与测定波长相同.它是由于测定波长因种种原因偏离正常光路，在不经过样品的情况下，直接射到检测器上.引起这种杂散光的原因是由于光学、机械零件(包括吸收池或样品本身)的反射和散射所引起的.这种杂散光能够经过一个不透明的样品来检查.当发现放在样品池中的不透明样品的透光度不为零时，说明仪器中有上述杂散光存在.但必须注意不要与光度刻尺的零位误差混淆.
第二种杂散光是指测定波长以外的偏离正常光路到达检测器的光线，一般由光学系统中的缺陷所引起，如不必要的反射面、光束孔径不匹配、灰尘的散射、光学元件表面被擦伤、不均匀色散等都会降低光线的单色性，使杂散光增加.仪器光学系统设计不良、零件加工不良、位置错移等也是造成杂散光的原因.一般指的是第二种杂散光.
杂散光的影响使测量结果偏离比尔定律.当杂散光被样品吸收时，偏离是正的，即观察值大于真实值.当杂散光不被吸收时，偏离是负的、观察值小于真实值.杂散光对吸光度的影响是在吸光度愈大时愈明显.如1％的杂散光强度能够使吸光度从1.000降到O.9629，但可使吸光度从3降到1.963.
由于杂散光强度在边缘波段比较大，因此在波长小于220nm进行光谱扫描时，必须小心有无“假吸收峰"出现.原来样品随波长变短而吸收增大，可是由于杂散光在短波时急剧增大，因而使原来逐渐增大的吸光度反而变小，就会出现不应有的“假吸收峰".
当被测定的波长的能量降低时，杂散光比例就相应增加.对仪器输出的边缘波长来说，单色器的透光度、光源强度和检测器的灵敏度都是比较低的，这时杂散光影响就更为明显.因此在紫外-可见分光光度计中应该先检查200-220nm、340nm处的杂散光.
简便的杂散光测试方法是测定在规定波长下几乎完全不透明的溶液或滤光片的透光度.选择一种材料，它对于边缘波长的光能是完全吸收的，而对中间波长的透光度却相当高.测定这种材料在边缘波长的透光度，直接就反映了杂散光的强度.这种材料称为长、短波截止材料.截止材料的截止性能应尽可能尖锐，溶液截止的尖锐程度比固体好.
在测定杂散光时，注意不要把试样室的漏光与仪器的杂散光相混淆.由于漏光而引起的杂光将会随着狭缝宽度的增加而迅速下降.而仪器本身的杂散光并不会因为狭缝的开闭而产生明显的变化.
6.分辨率
分辨率是指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔，是衡量分光光度计性能的重要指标之一.单色器输出的单色光的光谱纯度、强度及检测器的光谱灵敏度等是影响仪器分辨率的主要因素.
分辨率的实际测试方法有许多种，这些方法的原理都是观察可分辨的最小波长间隔，在不同波长范围使用的材料及方法皆不同.造成分辨率下降的原因可能有如下-些。测定条件选择不当(狭缝宽度太宽、记录速度太快、响应速度太慢等)、光学系统失调(光源、反射镜、检测器移位)、电子系统故障等等.发现仪器分辨率下降应仔细检查，进行调整.如调整单色器，一定要请专业人员，千万不可随意乱动.
7. 光度准确度
光度准确度是指仪器在吸收峰值上读出的透光度(或吸光度)与已知真实透光度之间的偏差.该偏差越小，说明光度准确度越好.
要测得正确可靠的数据取决于以下几方面(1)样品来源，(2)制样技术， (3)仪器的性能和操作条件的选择，(4)吸收池的质量.由此可见，光度误差是一个综合性的误差.决定仪器读数准确性的因素主要有如下几个方面：(1)显示系统的性能， (2)放大器的稳定性和线性， (3)检测器的线性及噪声.
检定光度准确性，必须有一定的标准样品，现已有许多测试方法和参比标准供参比，一类是标准溶液法，另-类是滤光片法.
7.1 标准溶液法
(1)硫酸铜溶液
溶液制备：
硫酸铜(CuSO4·5H20含量99.7％) 20.000g
硫酸(比重1.835) 10.0ml
用蒸馏水稀释到 1000m1
测量温度 25℃
吸收池光径 10.00mm
650、700、750nm时的吸光度分别为0.224、0.527、0.817A
(2)硫酸钴铵溶液
溶液制备：
硫酸钴铵(COS04·(NH4 )2SO4.6 H2O)(钴(加镍)的含量为100％，镍和钴的比为l：200) 14.481g
硫酸(比重1.835) 10.0ml
用蒸馏水稀释到 1000ml
测量温度 25℃
吸收池光径 10.00mm
510nm处有最大吸收，吸光度为0.1742A
(3)铬酸钾溶液
溶液制备：
氢氧化钾溶液：3.3gKOH(85％KOH)溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml
O.0400g／1铬酸钾(K2Cr04)溶在0.05mol／1氢氧化钾溶液中
275nm吸光度为0.7620，370nm吸光度为0.9914，
7.2 滤光片法
用标准滤光片来检查光度标尺的正确性，颇为方便.滤光片又可分为有色玻璃和中性玻璃(又称灰色玻璃)两种，中性滤光片由于在不同波长处的吸光度相对恒定，因而对仪器的波长设定、狭缝宽度、杂散光等要求不严，比有色玻璃优越，且有较好的重复性.使用滤光片作标准时，要严格清洁滤光片，避免手指印、灰尘、硬物擦碰.随着玻璃表面空气接触或清洗时摩擦等影响，透光度会逐渐发生变化.因此，在精确的标定工作中，还必须对这些标准滤光片的透光度作经常性的光度标定(一般为半年-次).
造成仪器光度准确度下降的主要原因往往是电子系统由于光源供电电源不稳定，引起光源发光特性的变化；光检测器工作电压波动，使光电信号变化，放大器工作点漂移或信噪比下降等因素.
8. 光度线性
优质的光度线性是用这个分光光度计测量时，对遵守比尔定律的溶液能给出一个吸光度对浓度(A对c)的线性曲线.这个参数对定量测定是非常重要的.检查光度线性可用溶液稀释法、吸收池光径法、中性滤光片叠加法.
8.1 溶液稀释法
重铬酸钾的吸收峰在350nm和257nm.称重铬酸钾0.200g，用0.005mol／1硫酸溶解，在1000ml容量瓶中稀释至刻度.这个溶液的读数大约为3.(重铬酸钾的线性范围约为0-3A).用此溶液作为母液，然后进一步稀释.样品配制后，立即读数，因为重铬酸钾遇光容易光解，因此最好使用棕色容量瓶.
8.2 吸收池光径法
使用不同光径的吸收池测定同一浓度的溶液来检查光度线性，能够避免稀释时容量误差.但吸收池的光径必须事先用长度计量方法精确测定
8.3 中性滤光片叠加法
现在有很多生产厂用这种方法检查光度线性.测试方法是将三块中性滤光片分别叠加后，比较测定值与计算值之差，具体方法如下.
先测出单片滤光片的吸光度A1、A2、A3.再分别把滤光片叠加起来，测定叠加后的吸光度(A1+A2)、(A1+ A3)、……等.
当A1+A2=(A1+A2)、Al+A3=(A1+A3)时，说明光度系统在这个测量点上是线性的.
当Al+A2≠(A1+A2)时,则光度系统在这个测量点上是非线性的.线性偏差ε=A1+A2-(A1+A2)
用这种方法找出各个位置的线性偏差ε，经过ε对测定结果进行修正：
为了避免滤光片多次反射的影响，必须把滤光片倾斜放置，倾斜角度要足够大，-般为±100,以保证其反射光不进入检测器.
除了上述三种方法外，还可采用光叠加法和旋转扇形板法等，影响光度线性的原因与光度准确性下降的原因是相似的。
9. 光度重复性
光度重复性是在相同的仪器上，相同条件下，对同一样品进行多次重复测定吸光度(或透光度).计算每次读数对平均值的偏差和这些偏差的平均值.
影响光度重复性的原因同样与影响光度准确度和线性的原因相似.在样品吸收增加时，由于比较低的信号水平时，仪器噪音增加，光度重复性可能不佳.
10. 噪音
噪音(100％线噪音和0％线噪音)是信号随时间而无规则的变化(由外线电压突然变化引起的记录笔或表头的突然变化所形成的噪音是无常的)
噪音测量的方法是在仪器预热稳定后，在一定波长和一定缝宽下，扫描100％线和0 A线数分钟，并量取峰-峰之间的值作为绝对噪音水平.但在实际应用中，常见信噪比来描述仪器的性能.例如：在100％时如噪音是1％，则信噪比是100:1.如果电子系统质量良好，噪音主要取决于检测器.但如果电子系统设计不良、元件质量低劣、仪器接地不良、光源不稳、工作环境潮湿、外界电磁干扰严重等，也会使噪音增大，应设法排除.
由于噪音对光度准确度的影响比较大，-般分光光度计都设有响应时间选择钮，能够根据具体测定情况选用适当的测定系统响应时间.增加响应时间能够改进信噪比.
11. 基线稳定性
基线稳定性是指双光束分光光度计在扫描100％线或0A线时(样品室中不放任何东西)，读数偏离的程度.如果基线稳定性不好，当然会影响光度准确度.引起基线不稳定的原因与引起噪音的原因相似.
12 基线平直性
基线平直性是指双光束分光光度计扫描基线(100％线或oA线，空气对空气)时，基线倾斜弯曲的程度，它是仪器的重要性能指标之一.
基线平直性不良一般说明光路不平衡、光学元件位置不准确或反射镜质量下降，电子和机械系统不良也会影响基线的平直性.基线的平直性还可用来考察噪音和光源或色散元件切换时的谱线衔接情况等.基线平直性不良会对各个吸收峰之间的比值产生影响，给物质结构的定性分析带来困难.过去用多点电位器来补偿光束不平衡，使基线平直.现在则用微处理机来补偿，效果大大改进.采用单光束分光光度计加计算机的方法来扫描基线就不存在光束不平衡的问题了.
双光束分光光度计使用日久或搬动、受震后，其基线会弯曲.引起基线不平直的原因主要是光学系统失调，两个光束不能很好平衡.有时电子系统工作失调也会使基线弯曲或倾斜.
基线不平直应首先检查光源部分是否移位松动.若肯定光源部分无故障后，可用白纸片在入射狭缝前检查光斑.如有散焦、偏位、切割、不对称等情况，应请专业人员检查和调整光学系统.

注意事项
1.空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。
2.测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。
3.在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大的波长作为测定波长。
4.一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3～0.7之间的误差较小。
5.吸收池应选择配对，否则要引入测定误差。在规定波长下两个吸收池的透光率相差小于0.5％的吸收池作配对，在必要的情况时，须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。
6.由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。
7.仪器的接地必须良好，一切裸露的零件对地电位不得超过24伏（测电笔的氖管不得发亮）。
8.在使用过程中，如需开启试样室盖时或暂时停止测试时，必须及时推入光门钮杆（使光电管前光门关闭），保护光电管，以防止光电管受强光或长时间照射而损坏。
9.在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池3～4次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损）。
10.取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。
11.若吸收池内外壁沾污，两池差较大的处理。
（1）可用绸布缠在扁竹条外或用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻摩擦，再用纯化水冲净。
（2）如上述方法处理不好，必要时可用重铬酸钾-硫酸洗液泡洗1～2分钟，用自来水冲净，再用纯化水冲净。
（3）不得用毛刷刷洗或硬物拭擦，以防止表面光洁度受损影响正常使用。
12.请务必注意经常保持硅胶的干燥，目的是保护光学元件和光电放大器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作，如发现有的硅胶由蓝色变为粉红色，应立即更换。该仪器干燥剂筒有两个：一个是装在放大器暗盒上，另一个装在单色光器暗盒上。
13.在更换硅胶干燥剂时，应关闭切断电源。
14.在停止工作期间，主机试样室内应放入袋装或筒装硅胶干燥剂。用防尘罩罩住整个仪器，并在防尘罩内放数袋防潮硅胶。
15.仪器在操作中，狭缝的宽度应从小逐渐开大。若狭缝过大，由于进入光电管的光能量强度过大，将会使放大器输出信号达到饱和，以至数字显示出溢出（即数字闪烁或示1不变）。这不是仪器有故障。
16.将波长旋转放在625nm，铗缝关闭在0.02nm附近，选择按键恢复在停止工作部位（即三个键均弹出）。
17.搬动仪器时应搬在主体端，不要搬在试样室和光电管盒端以及光源灯室部位，以防止仪器狭缝或光路部件受力而发生变形。并在搬动或运输时，应将可动部分固定，如各旋钮可用胶布贴住，狭缝位置开大些，然后固定，不要关小狭缝，以免运输时振动使狭缝刀口受损坏。
18.仪器的光栅、反射镜绝对不能擦拭，否则将损坏仪器光学表面，增加杂散光。
19.仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，为保证测定的准确性请经常校准波长精度。如有异常，应立即报告质量保证部，但不得擅自调整，并及时做好记录。

附 紫外、可见、近红外分光光度计检定规程
本规程适用于新制造、使用中和修理后的、波长范围为190～2500nm(或以此为主要光谱区)的紫外、可见、近红外分光光度计的检定。
一 概 述
紫外、可见、近红外分光光度计(以下简称仪器)，是依据物质在紫外、可见、近红外区吸收光谱的特性及朗伯-比尔定律的原理对物质进行定性鉴别和定量分析的仪器。
朗伯-比尔(LambertBeer)定律的数学表示式为
（1）
式中： A——物质的吸光度；
φ0——入射辐射(光)通量(W)；
φtr——透射辐射(光)通最(W)；
τ-----物质的透射比；
ε——物质的摩尔吸收系数(L/cm.mol)；
b——光路长度(cm或mm)；
C——物质的摩尔浓度(mol／L)；
本类仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器和显示系统等5部分组成.
二 检定项目和技术要求
l外观
1.1仪器应具有铭牌，并注明仪器名称、型号、编号、制造厂名及电源电压.
1.2仪器应具有使用说明书.新制造的仪器应具有出厂检验合格证；已检定过的仪器应附有上一次的检定证书.
1.3 仪器应能平稳地置于工作台上，各紧固件应无松动，接插件应紧密配合，接触良好。
l.4 仪器所有刻字、刻线应均匀、清晰，数字显示不得有缺点、缺画现象。仪器上各开关、调节器和按键应能正常工作；荧光屏图象应清晰、亮度可调。
1.5样品室应无漏光现象
1.6仪器启动后应无异常的杂音，预热30 min后应能正常工作。
2波长准确度与波长重复性
仪器的波长准确度与波长重复性应符合表l的规定.
表1 (nm)

仪器级别

波长范围

准确度

重复性
A
紫外-可见
±O.3
0.2
近红外
±1.5
1.O
B
紫外-可见
±O.5
O.3
近红外
±2.O
1.O
C

棱镜式
光栅式
棱镜式
光栅式
350
±O.7
± 0.5
0.3
O.3
600
±2.O
±0.5
1.O
0.3
700
±4.8
±O.5
2.5
O.3
lOOO
±8.O
±2.O
4.0
1.O
2500
±lO.0
±2.O
5.O
1.O
3分辨率或最小光谱带宽
3.1分辨率应符合表2的规定.
表2
仪器级别
τ(％)
A
>20
B
>15

C
棱镜式
光栅式

>12
>lO
3.2最小光谱带宽；仪器的最小实际带宽不应大于实际设置带宽的1.2倍。
4 杂散辐射率
仪器杂散辐射与主辐射之比例，即杂散辐射率应符合表3的规定。
表3
仪器级别
波长(nm)
杂散辐射率k(％)
A
220
<O.001
340
<0.0Ol
620
<O.01
1 690
<O.1
B
220
<O.01
340
<O.Ol
620
<O.1
1690
<O.5
C
220
<O.6
34O
<O.6
5 透射比准确度与透射比重复性
仪器透射比准确度与透射比重复性应符合表4的规定.
仪 器 级 别
准 确
重 复 性
A
士0.5
O.2
B
±0.6
O.3
C
±0.8
O.4
6 基线平直度
仪器的基线平直度应符合表5的规定.
表5
仪器级别
波长范围(nm）
吸 光 度
A
紫外—可见
士0.002
近红外
±O.003

B
紫外一可见
±O.003
近红外
±O.OO5

C
紫外可见
±O.005
近红外
±0.008
7漂移
仪器的漂移量应符合表6的规定.
表6
仪器级别
测定波长(nm)
测定时间（min）
漂移量(A)
A
500
30
<0.001
B
500
3O
<O.002
C
500
30
<O.005
8噪声仪器噪声应符合表7的规定.
9绝缘电阻
绝缘电阻不低手20MΩ.
表7
仪器级别
测定波长（nm)
100％线(A)
0％线(％τ)
A
230(或340)
<O.02
／
500
<0.001
<O.01
l000
<0.001
／
B
230(或340)
<O.003
／
500
<0.002
<0.03
1000
<O.O02
／
C
230(或340)
<0.006
／
500
<O.005
<O.08
1OOO
<O.005
／

三 检定条件
10 电源及环境条件
10.1电源：电压变化不大于220±22V；频率变化不踅过50±1Hz.
10.2室温15～30℃.
10.3环境相对湿度小于85％.
10.4仪器不受阳光直射.
1O.5室内应无强气流及腐蚀性气体.
10.6周围不应有影响检定的强烈振动和强电场、强磁场的干扰.
11主要检定设备及材料
11.1天平(称量200g，分度值O.1mg)
11.2兆欧表(500V)
11.3挡光板(12×12×45mm的不透光矩形块)
11.4衰减片(1/100，10/100).
12标准物质（国家批准颁布相应的标准物质后，应立即采用）及化学试剂
12.1低压汞灯；氧化钬玻璃(厚度2～2.5 mm)；苯(二级)；1，2，4一三氯苯(三级)。
12.2透射比的标称值为10％、20％、30％左右的中性滤光片(标准值的不确定度优于0.2％τ)。
12.3质量分数为0.06000／1000的重铬酸钾紫外分光光度标准溶液(标准值的不确定度优于O.3％τ)；紫外可见分光光度标准溶液。
12.4标准石英吸收池(标准物质编号GBW 13304)。
12.5碘化钠及亚硝酸钠(二级)；亚甲基蓝及二溴甲烷(三级).
四 检定方法
13外观
按第1条要求进行，仪器开机预热30 min后检定以下各项。
14波长准确度与重复性
14.1用低压汞灯检定.关闭仪器光源，将汞灯放置于入射狭缝处.采用波长扫描(或重复扫描)方式、扫描速度慢(如15 nm／min)、响应快、最小带宽(如0.1 nm)、置程0～100％(或参照仪器说明书设定条件)，在200～2 500 nm范围内单方向重复扫描3次，由仪器识别记录各峰值（仪器无“峰检测”功能，应对指定波长进行“单峰”扫描.）.分别测量出谱图上紫外、可见、近红外三个波段范围的各二条谱线波长(棱镜式仪器应按表l要求进行)，与附录l表1比较，按公式(2)计算波长准确度△λ：
△λ=-λr (2)
式中： ——波长测量的平均值； .
λr——波长标准值.
按公式(3)计算波长重复性δλ：
δλ=λmax-λmin (3)
式中： λmax、λmin——三次测量波长的最大值与最小值。
14.2若仪器不能放置低压汞灯时，采用下述办法分区检定。
14.2.1紫外和可见区
(1)用仪器固有的氘灯检定.取单光束能量方式，测量条件接1.4.1款(或参照仪器说明书设定条件)对486.02及656.10nm二单峰进行单方向重复扫描三次，测量出谱图上的二条谱线波长，与附录1表2比较，并按公式(2)、(3)计算△λ及δλ。
(2)采用氧化钬玻璃检定.测量条件同14.1款，量程O～2(A).将氧化钛玻璃放置于样品室内，以空气作参比，在220～660 nm范围内扫描，测量出谱图上紫外区二条谱线的波长，并与附录l表3比较，按公式(2)、(3)计算△λ及δλ。
14.2.2 近红外区
采用1，2，4-三氯苯检定.测量条件同14.1款，带宽由仪器自动调节，正常扫描速度(如120 nm／min)，量程O～2(A)，在1 500～2 600nm范围内扫描，测量出谱图上二条谱线的波长，并与附录1表4比较，按公式(2)、(3)计算△λ及δλ
15分辨率或最小光谱带宽
15.1分辨率
仪器取波长扫描方式、测量条件为：扫描速度慢(如15nm／min)、响应快(或中)、量程O～100％、最小带宽。将2滴苯液滴入干燥的石英吸收池底部，加盖。当苯蒸气充满吸收池空间后.放入样品光速。在258.9 nm处调节透射比100％，在255～265nm范围内扫描。按附录2图l所示，计算以分辨深度D表示的分辨率(％τ).
15.2最小光谱带宽
当按15.1款方法检测仪器分辨率有困难对，采用本法.
仪器取单光束能量方式.测量条件为：最小带宽、扫描速度慢、响应快、合适的负高压(或参照说明书设定条件)，在655～657nm范围内扫描，然后在能量-波长图上按附录2图2所示，测量出仪器固有氘灯特征谱线的半宽变，此即为仪器的最小光谱带宽。
16杂散辐射率
16.1取仪器带宽2 nm，在220 nm波长处以空气为参比，在样品光束插入l％(或10％)的衰减片（若仪器均杂散辐射率大于0.1％时，不应采用衰减片.），测量出衰减片的实际值τ1，再将衰减片移至参比光束，并用配对误差小于±0.2％τ的lO mm石吸收池，分别装入蒸馏水及含量为10g／L的碘化钠水溶液，放入参比及样品光束，测量出透射比τ2，按公式(4)计算杂散辐射率τR
τR=τ1×τ2 (4)
16.2在340nm、620nm、1690nm处用含量为50 g／L的亚硝酸钠水溶液，0.005％亚甲基蓝水溶液及二溴甲苯，按上述方法分别检测各τ1、τ2,并接公式(4)计算τR
17透射比准确度与透射比重复性
17.1紫外区
仪器带宽取2nm,用l套标准石英吸收池分别盛装空白溶液及外分光光度标准溶液，在235nm，257nm，313nm和350 nm四个波长处连续三次测量其透射比，与附录3表1比较，并按公式(5)算透射比准确度△r
△r=-τr (5)
式中： ——透射比测量的平均值
τr——透射比标准值
按公式(