危险性化合物的微生物降解-中国石油大学环境生物工程.pptx

n危险性化合物（hazardouschemicals）由于这些化学物质对人具有三致效应三致效应（致癌、致畸、（致癌、致畸、致突变），致突变），故称之为危险性化合物。故称之为危险性化合物。n理论上微生物具有降解自然界产生的有微生物具有降解自然界产生的有机化合物的代谢机制，但是由于：机化合物的代谢机制，但是由于：新合成的化合物结构新颖；微生物对这些化合物无降解机制微生物对这些化合物无降解机制 因此新的化合物往往对微生物的降解表现出抗因此新的化合物往往对微生物的降解表现出抗逆性逆性n来源人工合成的农药、人工合成的农药、杀虫剂、除草剂、杀虫剂、除草剂、防腐剂、溶剂防腐剂、溶剂的主要成分或的主要成分或石油化工产品的中石油化工产品的中间产物间产物n化学本质脂肪烃、芳香烃类及其衍生物；脂肪烃、芳香烃类及其衍生物；n最常见的为多环芳烃最常见的为多环芳烃(PAHs)PAHs)、多氯联苯多氯联苯(PCBs)PCBs)、氯代氯代烃（如三氯乙烷）、有机氮、有机氯、有机磷农药等烃（如三氯乙烷）、有机氮、有机氯、有机磷农药等要回答的实际问题要回答的实际问题n能否生物降解？是否完全？能否生物降解？是否完全？可行性可行性n哪种或哪几种微生物降解？后者中的分哪种或哪几种微生物降解？后者中的分工脚色如何？工脚色如何？菌种选育及基因工程菌菌种选育及基因工程菌改造方向以及好厌氧工艺选择改造方向以及好厌氧工艺选择n降解生化反应机理如何？哪些酶参与？降解生化反应机理如何？哪些酶参与？限速步骤为哪一步？限速步骤为哪一步？酶工程强化的可酶工程强化的可行性行性微生物通常通过生态学协同作用完成为此类污染物的降解环境生物工程学工作者的任务n从特定环境中分离纯化得到具有某些特定降解能力的微生物纯培养物n驯化出降解某些污染物的微生物菌株，使其降解能力更强大n通过基因工程手段来改造微生物使其具有特定的降解能力n通常，任何有毒物质在混合培养条件下的速率均快于单个菌群的速率n为什么要研究单个的、纯化了的微生物菌株，并研究其特点？微生物本身的特性必须要清楚：生理生化、遗传、降解能力降解机制、代谢过程二、二、微生物菌群的生态学地位微生物菌群的生态学地位 （微生物群落的生物降解功能）（微生物群落的生物降解功能）n属于通常意义上共生、互生共生、互生共生、互生共生、互生、寄生、拮抗、寄生、拮抗的前两种。n目前主要通过试验室混合菌培养模拟环境实际情况n以下实验中发现的微生物现象是否与实际既然环境中真实情况完全一致不能确定，但可提供类比参考但可提供类比参考n根据不同代谢作用进行职责划分，可以将微生物群落分为7种：n（相当于我们人类社会职业分工，如厨师、医生、球员等等）nStirling等人(1976年)从环己烷上富集分离得到微生物群落：诺卡氏菌属（诺卡氏菌属（Nocardia sp.Nocardia sp.）（放线菌中一种）可独立分解环己烷，但只有在能提供生物素（维生素生物素（维生素B B族）族）的假单胞菌属的假单胞菌属（PseudomonasPseudomonas）存在情况下才能生存。n假单胞菌属的角色n n（1 1）提供特殊营养物质（主要是生长因）提供特殊营养物质（主要是生长因子）子）（相当于（相当于（相当于（相当于“厨师厨师厨师厨师”或或或或“营养师营养师营养师营养师”）n类似于我们肠道中的微生物为我们提供身体所需的维生素n在利用甲烷生产单细胞蛋白的微生物群落中分离得到四种微生物：氧化甲烷的假单胞菌会受到体系中甲醇甲醇的毒害的毒害，体系中的生丝微菌确可将甲醇生丝微菌确可将甲醇氧化去除氧化去除。（该群落中的其余两个成员是黄细菌与不动杆菌）。对于甲烷的氧化，n生丝微菌的脚色n n（2 2）去除生长抑制产物）去除生长抑制产物（相当于（相当于（相当于（相当于“大夫大夫大夫大夫”或或或或“环卫工环卫工环卫工环卫工”）n微生物之间构成了类似食物链的关系，如降解黑苔酚的3种细菌之间的关系，假单胞菌、扩展短杆菌、短假单胞菌、扩展短杆菌、短小杆菌三者均可降解小杆菌三者均可降解3 3，5-5-二羟基甲苯（又称苔黑酚）二羟基甲苯（又称苔黑酚），但后两者，但后两者只有在假单胞菌首先生长后才能降解苔黑只有在假单胞菌首先生长后才能降解苔黑酚酚。n假单胞菌的角色n n（3 3 3 3）改善单个微生物的基本生长参数（条件）改善单个微生物的基本生长参数（条件）改善单个微生物的基本生长参数（条件）改善单个微生物的基本生长参数（条件）（相当（相当（相当（相当于于于于“大哥大大哥大大哥大大哥大”或或或或“大姐大大姐大大姐大大姐大”）n上述三类主要在简单有机物的降解中较为重要，对于复杂或异型有机物，危险性化合物和难降解化合物主要依靠下面四种类型生物代谢n n（4 4 4 4）对底物协调利用）对底物协调利用）对底物协调利用）对底物协调利用（相当于（相当于（相当于（相当于“足球队足球队足球队足球队”或或或或“流水作业流水作业流水作业流水作业”）n单个微生物对某种物质没有降解能力，但混合后则能单个微生物对某种物质没有降解能力，但混合后则能够降解该物质够降解该物质以协同代谢降解为基础。以协同代谢降解为基础。n如如没有一种微生物可以没有一种微生物可以杀虫剂二嗪农杀虫剂二嗪农硫代磷酸硫代磷酸O O，O O二乙基二乙基O O（2 2异丙基异丙基4 4甲基甲基6 6嘧啶嘧啶基）酯为唯一碳源生长基）酯为唯一碳源生长n原因何在？原因何在？n都不具有完整的降解酶。都不具有完整的降解酶。n但节杆菌、链霉菌但节杆菌、链霉菌同时同时同时同时存在时，可将其降解存在时，可将其降解n“分工协作分工协作”第四类微生物第四类微生物再如，除草剂茅草枯（达拉朋；达拉朋；，-二氯二氯丙酸钠丙酸钠）的降解n一个从除草剂茅草枯上分离得到的多成员微生物群落，混合菌株的降解率比单个菌株的降解率之和之和还高高20%n n（5 5）共代谢）共代谢（相当于（相当于“友情客串友情客串”）n共代谢共代谢指某种生长底物和某种非生长底指某种生长底物和某种非生长底物物（污染物污染物，不作为生长必需的能源或碳源提供物，不作为生长必需的能源或碳源提供物）共用同一种酶的现象。共用同一种酶的现象。生长底物是能被微生物用作为唯一碳源的物质。n共酶现象共酶现象是指一些污染物(非生长底物)不能作为微生物生长的唯一碳源,而只能在生长底物被利用时，通过微生物产生的酶，将该污染物转化为不完全的氧化物。如n如土壤中广泛存在的如土壤中广泛存在的好氧嗜甲烷菌好氧嗜甲烷菌只能利用甲烷生存，其只能利用甲烷生存，其产生的单产生的单加氧酶专一性较差，可同时启动烃加氧酶专一性较差，可同时启动烃类的初始降解反应类的初始降解反应，为其他微生物，为其他微生物进一步降解创造便利进一步降解创造便利。第五类微生物第五类微生物注意：注意：该特殊生长底物存在及数该特殊生长底物存在及数量的重要性！量的重要性！人工强化人工强化第六类微生物第六类微生物n n（6 6 6 6）氢）氢）氢）氢（电子）转（电子）转（电子）转（电子）转移移移移（相当于（相当于（相当于（相当于“接线生接线生接线生接线生”）复杂有机物复杂有机物1 1水解菌水解菌 2 2发酵菌发酵菌脂肪酸脂肪酸脂肪酸脂肪酸 乙酸乙酸乙酸乙酸 HH2 2 +CO+CO2 23 3产乙酸菌产乙酸菌 CHCH4 4+CO+CO2 2HH2 2S+COS+CO2 2硫酸盐还原菌4 4产甲烷菌产甲烷菌4 4产甲烷菌产甲烷菌厌氧代谢与去除生长抑制物、及协同作用的区别在于，氢受体物质氢受体物质存在存在的重要性硫酸硫酸盐、硝酸盐、盐、硝酸盐、碳酸盐碳酸盐解除过多解除过多氢氢对产乙酸菌对产乙酸菌的产物抑制的产物抑制n有一种以上初始利用者存在，有一种以上初始利用者存在，n每个初始利用者作用相同，都每个初始利用者作用相同，都可以将某特殊污染可以将某特殊污染物降解利用物降解利用（区别于协同利用之处）（区别于协同利用之处）但但n混合菌群合力速率混合菌群合力速率任何一个菌种单独降解速率任何一个菌种单独降解速率n如对除草剂对硫磷和苯甲酸降解菌群中各种微生物均可独立在以上唯一碳源培养基上生存，但混合菌对其降解速度远高于各自单独降解速率n n？尚不清楚？尚不清楚？尚不清楚？尚不清楚第七类微生物第七类微生物n n（7 7 7 7）提供一种以上初级底物利用者）提供一种以上初级底物利用者）提供一种以上初级底物利用者）提供一种以上初级底物利用者（相当于（相当于（相当于（相当于“男女搭配干活不累男女搭配干活不累男女搭配干活不累男女搭配干活不累 ”）n确定某种污染物自然状态的生态降解菌确定某种污染物自然状态的生态降解菌群种类及其生态作用的目的？群种类及其生态作用的目的？n找出人工强化的关键所在找出人工强化的关键所在n如如n特定细菌的人工引入引发反应的加速进特定细菌的人工引入引发反应的加速进行？行？n需要补充共代谢底物？需要补充共代谢底物？n补充电子受体（如硫酸盐）等？补充电子受体（如硫酸盐）等？n特定混合菌的固定化？特定混合菌的固定化？第二节第二节 烃类化合物的微生物降解烃类化合物的微生物降解n一般而言，具有易失去电子的取代基（如-OH、-COOH、-NH2）的芳香族化合物要比具有易获得电子的取代基（-NO2、-SO3H、卤代基）的芳香族化合物更易于氧化代谢。n根据物质的化学结构，各种有机化合物的降解性能可以排成如下顺序：n脂肪酸脂肪酸有机磷酸盐有机磷酸盐长链苯氧基脂肪酸长链苯氧基脂肪酸短链苯氧短链苯氧基脂肪酸基脂肪酸单基取代苯氧基脂肪酸单基取代苯氧基脂肪酸三基取代苯氧基三基取代苯氧基脂肪酸脂肪酸硝基苯硝基苯氯代烃类氯代烃类n2.1好氧混合菌培养条件下好氧混合菌培养条件下n（1）芳香族化合物的分解芳香族化合物的分解n在芳香族与杂环化合物分解过程中起重要作用在芳香族与杂环化合物分解过程中起重要作用的微生物有的微生物有假单胞菌、无色杆菌、节杆菌、棒假单胞菌、无色杆菌、节杆菌、棒杆菌、诺卡氏菌、分枝杆菌、曲霉、青霉杆菌、诺卡氏菌、分枝杆菌、曲霉、青霉等，等，这些微生物都能不同程度地使芳香族与杂环化这些微生物都能不同程度地使芳香族与杂环化合物分解。合物分解。微生物分解芳香族化合物的方式有两种：微生物分解芳香族化合物的方式有两种：v在酶的作用下直接将分子中的环状结构打开在酶的作用下直接将分子中的环状结构打开 v芳芳香香族族化化合合物物中中大大部部分分被被微微生生物物作作用用去去掉掉环环上上的的侧侧链链基基团团，使使之之转转变变成成儿儿茶茶酚酚（焦焦性性儿儿茶茶酚酚，邻邻苯苯二酚二酚）或原儿茶酸（）或原儿茶酸（3,4-二羟基苯甲醛二羟基苯甲醛）。）。三羧酸循环三羧酸循环关键酶关键酶加氧酶加氧酶环境酶工程产品酶之一后续介绍注意芳香族化合物的生物降解芳香族化合物的生物降解n取代物取代物n酚酚石化废水、煤炭废水燃料、农药、炸药、医药、杀虫剂废水，毒性大，难降解硝基苯硝基苯 苯胺苯胺 及多环芳烃萘蒽等及多环芳烃萘蒽等加氧酶加氧酶作用，形作用，形成共通中间产物成共通中间产物开环进入三羧开环进入三羧酸循环酸循环（2）烷烃）烷烃同样同样加氧酶加氧酶氧化为氧化为醇醇脂酸脂酸脂代谢脂代谢(氧化氧化）（2）烷烃）烷烃同样同样加氧酶加氧酶氧化为氧化为醇醇脂酸脂酸脂代谢脂代谢(氧化氧化）n地下水、土壤、江河湖泊底部、厌氧污泥、垃圾场n（1）单环芳烃及其衍生物）单环芳烃及其衍生物n极为缓慢（如甲苯、苯在培养基条件下34d和64d后消失）n详细的降解机理尚不清楚，通过中间产物中间产物及及放射性原放射性原子标记物子标记物（如H218O、14C）转化途径转化途径判断2.2厌氧混合菌培养条件下厌氧混合菌培养条件下还原还原水解开环水解开环芳香环脂环族脂肪酸脂肪酸矿矿化化水供氧水供氧氧化氧化酚限速步骤？关键限速步骤？关键酶？微生物组成酶？微生物组成及生态关系？及生态关系？n（2）多环芳烃及其衍生物）多环芳烃及其衍生物n试验数据报道试验数据报道n萘萘(C10H8，二环，二环)(7mg/l)、苊苊(C12H10，三环三环)(0.4mg/l)(染料中间体染料中间体)分别在分别在45d、40d后后检测不出。检测不出。n含含N、P、S的杂环芳烃（如喹啉的杂环芳烃（如喹啉C9H7N）在混合菌培养在混合菌培养时也可转化，时间时也可转化，时间20144d不等，不等，具体机理不清具体机理不清n每年全世界产量估计8105t，应用于各类工农业生产，如化工合成中间体、润滑剂、绝缘剂、传热介质、增塑剂、农药等n卤代烃卤代烃卤代芳烃（卤代芳烃（如氯代苯甲酸、氯酚类、氯苯类）和卤代脂肪烃和卤代脂肪烃第三节第三节 卤代有机化合物的微生物降解卤代有机化合物的微生物降解参学参学n卤原子的引入使生物降解性大大降低n如因何在呢？例如乙烯是三氯乙烯（半衰期如因何在呢？例如乙烯是三氯乙烯（半衰期300d）提供电子，保护提供电子，保护C难受氧化剂难受氧化剂(如如O:)亲核攻亲核攻击，同时原子半径大，空间位阻效应较大击，同时原子半径大，空间位阻效应较大受进化的影响，生物通过专一性较差的酶对受进化的影响，生物通过专一性较差的酶对卤代有机物极性转化。卤代有机物极性转化。四氯乙烯四氯乙烯不能氧化不能氧化l卤代芳香化合物的生物降解是指其芳香环开裂形成中卤代芳香化合物的生物降解是指其芳香环开裂形成中间代谢物及其有机卤素的矿化。间代谢物及其有机卤素的矿化。l生物降解的生物降解的唯一重要限速步骤唯一重要限速步骤是卤素取代基从有机化是卤素取代基从有机化合物中的脱除。合物中的脱除。l根据报道根据报道它主要通过以下两种途径发生：它主要通过以下两种途径发生：n 3.1好氧混合菌培养条件下好氧混合菌培养条件下n先脱卤再开环：先脱卤再开环：在降解的初期通过还原、水解或氧化分解去除机理消除卤素；H2OCl-开环开环开环开环3-氯苯甲酸3-羟基苯甲酸3,5-二羟基苯甲酸限速限速步骤步骤酶酶?如何发生如何发生?n先开环再脱卤；先开环再脱卤；生成非芳香结构产物后通过自发水解脱卤或-氧化消去卤化氢。O2 加氧酶加氧酶RClTCA,三羧酸循环三羧酸循环O2 加加氧酶氧酶邻位间位O2 加加氧酶氧酶3-氯邻苯二酚氯邻苯二酚酰基卤化物酰基卤化物不可逆抑制不可逆抑制不可逆抑制不可逆抑制R=R=H,OH,NH2,COOH大多数大多数卤代物卤代物致死代致死代谢物谢物限速步骤限速步骤?（2）卤代脂肪烃）卤代脂肪烃卤代脂肪烃的氧化模式主要有以下两种：利用烷烃的细菌通过加氧酶将分子氧引入到有机分子中。一些能以卤代脂肪烃为唯一碳源和能源的微生物以这类化合物为初始底物代谢。n通常认为作为脱油脂洗涤剂的氯代溶剂(如三氯甲烷)不能用传统生物处理方法处理,但一些能利用但一些能利用烷烃烷烃的的土壤细菌可以降解氯乙烯、氯乙烷。土壤细菌可以降解氯乙烯、氯乙烷。O2 加氧酶加氧酶环氧化物环氧化物乙醛酸、二氯乙酸，甲酸氯取代基越多代谢氯取代基越多代谢速度越慢，代谢机速度越慢，代谢机理为理为共代谢（普通共代谢（普通烷烃）烷烃）专一性降解微生物如假单胞菌、生丝微菌可将氯代烷作为初始底物，进行氧化、还原、水解完全代谢氯代烷烃的微生物降解氯代烷烃的微生物降解 3.2 厌氧混合菌培养条件下厌氧混合菌培养条件下n通过厌氧污泥系统以及自然湖泊底泥分析发现不能被不能被好氧微生物降解的四氯乙烯、六氯环己烷（六六六）、好氧微生物降解的四氯乙烯、六氯环己烷（六六六）、五氯联苯（五氯联苯（DDT)、六氯联苯及更高氯代联苯均可由六氯联苯及更高氯代联苯均可由厌氧微生物脱氯降解。厌氧微生物脱氯降解。已明确的规律已明确的规律 待研究规律待研究规律逐个逐个还原脱氯还原脱氯具体催化酶及步骤？限速步骤具体催化酶及步骤？限速步骤补充葡萄糖、酵母膏、蛋补充葡萄糖、酵母膏、蛋白胨等可显著提高脱氯速率白胨等可显著提高脱氯速率混合菌群生态协同机理混合菌群生态协同机理共共代谢？营养因子补充？多初级代谢？营养因子补充？多初级底物？底物？低氧化还原电位对提高反低氧化还原电位对提高反应速率有利应速率有利明确了可行性！如五氯酚五氯酚用于制造防腐剂、杀虫剂、除草剂、杀菌消毒剂等，性质稳定，剧毒，优先控制污染物，对厌氧活性污泥半抑制浓度6mg/lCH4 CO2五氯酚（PCP)厌氧混合培养条件下脱氯与 降解的假设途径第四节第四节 其他危险化合物的微生物降解其他危险化合物的微生物降解典型基团降解机理典型中间产物偶氮染料偶氮染料(致突变）致突变）厌氧还厌氧还原原+好氧好氧氧化氧化(苯胺苯胺)亚硝胺亚硝胺(致癌）致癌）仅知几仅知几周内缓周内缓慢降解慢降解无资料无资料化化学学农农药药有机氮有机氮RC(=NH)NH2脒脒共代谢共代谢？苯胺苯胺有机磷有机磷脂酶水脂酶水解解(二甲基磷酸二甲基磷酸)有机氯有机氯略略研究内容缺乏研究内容缺乏研究内容缺乏研究内容缺乏农药降解1.农药分子结构与微生物降解的关系现代农业的发展建立在大量化学合成农药广泛使用的基础之上。各种化学农药的共同特性是：有毒性；比较稳定，不易分解，与足够长的有效期；不易溶于水，具有脂溶性。进入环境中的农药有些是可以生物降解的，如有机磷农药。有些则是难以生物降解的，如有机氯农药。环境因子，如土壤的pH、温度、含水量、有机质含量、粘度及气候等均影响农药的降解。1.农药分子结构与微生物降解的关系图6-5-5 2,4-D 、2,4,5-T 苯胺灵、毒草胺的分子结构 化合物时间/周邻位间位对位氯苯酚甲氧酚甲基酚硝基酚苯酚32171712131表1具有不同取代基的苯酚完全降解所需的时间：八周后仍存在2.农药浓度与微生物降解的关系农药的种类不同对微生物的影响不同。农药的浓度同样影响其生物降解。有些农药在低浓度范围时对微生物是无毒害的，甚至可以刺激某一类微生物的生长。但在高浓度时，一般均会影响土壤中微生物的代谢活性。3.降解农药的活性微生物在已分离到的降解不同农药的微生物中，大多数含有降解性质粒。目前，除了从土壤中分离高效活性降解菌外，研究热点开始集中在用基因工程技术定向选育遗传工程菌株方面。