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专题1   基因工程
※ 基因工程的概念:
基因工程是指按照人们的愿望, 进行严格的设计, 经过体外DNA重组和转基因技术, 赋予生物以新的遗传特性, 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的, 又叫做DNA重组技术。
操作环境
操作对象
操作水平
基本过程
结果
生物体外
基因
分子水平
剪切→拼接→导入→表示
人类需要的基因产物
﹡原理: 基因重组
﹡目的: 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
﹡意义: 能够打破生物种属的界限( 即打破生殖隔离, 克服远源杂交不亲和的障碍) , 在分子水平上定向改变生物的遗传特性。
﹡操作水平: DNA分子水平
【思考】:
( 1) 基因工程的物质基础是: 所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。
( 2) 基因工程的结构基础是: 所有生物的DNA均为双螺旋结构。
( 3) 一种生物的DNA上的基因之因此能在其它生物体内得以进行相同的表示, 是因为它们共用一套遗传密码子。
一、 基因工程的基本工具
1.”分子手术刀”——限制性核酸内切酶( 限制酶)
( 1) 来源: 主要是从原核生物中分离纯化出来的。
( 2) 功能: 能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列, 而且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开, 因此具有专一性。
( 3) 结果: 经限制酶切割产生的DNA片段末端一般有两种形式: 黏性末端和平末端( 回文结构特点) 。①在中心轴线两侧将DNA切开, 切口是黏性末端。
②沿着中心轴线切开DNA, 切口是平末端。
2.”分子缝合针”——DNA连接酶
( 1) 分类: 根据酶的来源不同, 可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类
( 2) 功能: 恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较:
①相同点: 都缝合磷酸二酯键
②区别: E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌, 只能使黏性末端之间连接;
T4DNA连接酶能缝合两种末端, 但连接平末端之间的效率较低。
(3)与DNA聚合酶作用的异同:
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端, 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端, 形成磷酸二酯键。

DNA连接酶
DNA聚合酶
不同点
连接的DNA
双链
单链
模板
不要模板
要模板
连接的对象
2个DNA片段
单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上
相同点
作用实质
形成磷酸二酯键
化学本质
蛋白质
( 4) 与DNA分子相关的酶

限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
作用结果
形成粘性末
端或平末端
形成重组DNA分子
形成新的DNA分子
形成单链DNA分子
3.”分子运输车”——载体
( 1) 作用:
①作为运载工具, 将目的基因转移到宿主细胞内; ②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
( 2) 载体具备的条件:
①能在受体细胞中自我复制, 或整合到染色体DNA上, 随染色体DNA进行同步复制。
②具有一至多个限制酶切点, 供外源DNA片段插入。
③具有标记基因, 供重组DNA的鉴定和选择。
④大小合适, 对受体细胞无害。
( 3) 最常见的载体是质粒。
它常存在于原核细胞和酵母菌中, 是一种裸露的、 结构简单的、 独立于细菌染色体之外, 并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
( 4) 其它载体: 噬菌体的衍生物、 动植物病毒
4 DNA的能力, 至于原因, 现在还不清楚, 可能将来会发现能够连接单链DNA的酶。
二、 基因工程的基本操作程序
第一步: 目的基因的获取
1.目的基因是指: 主要是指编码蛋白质的结构基因, 也能够是一些具有调控作用的因子 。
※ 基因的结构:
基因是有遗传效应的DNA片段(注: RNA病毒为RNA), 分为编码区和非编码区。

编码区: 能转录出mRNA, 原核生物中也就是能编码蛋白质的区段
非编码区: 不能转录出mRNA, 也不能编码蛋白质的区段
※ 原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点
真核细胞基因结构要比原核细胞的基因结构复杂, 编码区间隔的、 不连续, 能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来, 成为一种断裂的形式, 分为: 外显子: 能够编码蛋白质的序列; 内含子: 不能够编码蛋白质的序列
( １) 原核细胞基因的结构

非编码区中存在调控遗传信息表示的核苷酸序列:
①编码区上游的RNA聚合酶结合位点, 即启动子, 可控制RNA聚合酶的结合。RNA聚合酶是一种蛋白质, 能识别并结合调控序列中的结合位点, 能催化DNA转录为RNA
②编码区下游有终止子, 可控制RNA聚合酶的停止、 脱落。
( 2) 真核细胞基因的结构

2.获目的基因的来源: 从自然界中已有的物种中分离及人工合成。
3. 目的基因的获取方法:
( 1) 从基因文库中获取( 基因组文库、 cDNA文库)
※基本概念的理解:
①将含有某种生物不同基因的许多DNA片段, 导入受体菌的群体中储存, 各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因, 称为基因文库。
②将某种生物体内的DNA全部提取出来, 选用适当的限制酶, 将DNA切成一定范围大小的DNA片段, 然后将这些片段分别与载体连接起来, 导入受体菌的群体中储存, 每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因。这种基因文库叫基因组文库。
③有些基因文库比较小, 只包含了一种生物的一部分基因, 这种基因文库叫做部分基因文库, 如cDNA文库( 用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA( 也叫cDNA) 片段, 与载体连接后储存在一个受体菌群中, 这个受体菌群体叫做这种生物cDNA文库。)
﹡基因组文库和部分基因文库的比较:
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
小
大
基因中启动子
无
有
基因中内含子
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间基因交流
能够
部分基因能够
( 2) 用化学方法直接人工合成
①反转录法: 以目的基因转录成的信使RNA为模板, 反转录成互补的单链DNA, 然后在酶的作用下合成双链DNA, 从而获得所需的基因。
目的基因转录成的mRNA 单链DNA双链DNA( 目的基因)
②根据已知的氨基酸序列合成DNA法:
蛋白质中氨基酸的序列mRNA中的碱基序列DNA碱基序列目的基因目的基因
( 3) 用PCR技术扩增目的基因
原核基因采取直接分离获得, 真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常见方法有反转录法和化学合成法。
※ PCR技术扩增目的基因
( 1) PCR是聚合酶链性反应的缩写, 创造人: 穆里斯等人
( 2) 原理: DNA双链复制
( 3) 实质: 是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
( 4) 前提: 一段已知目的基因的核苷酸序列, 根据这一序列合成引物。
( 5) 条件:
a..四种脱氧核苷酸 b.DNA的两条链为模板 c.热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
d.一对引物( 一小段单链DNA或RNA, 一般20～30个碱基, 能与DNA母链的一段碱基序列互补配对)
e.温度控制和缓冲液
( 6) 过程:

第一步: ( 变性) 加热至90～95℃, DNA解链; 双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂, 形成单链DNA
第二步: ( 复性) 冷却到55～60℃, 引物结合到互补DNA链; 系统温度降低, 引物与DNA模板结合, 形成局部双链
第三步: ( 延伸) 加热至70～75℃, 热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。在Taq酶的作用下, 从 引物的5′端→3′端延伸, 合成与模板互补的DNA链
( 7) 特点: 指数形式扩增
﹡PCR技术与DNA复制的比较

PCR技术
DNA复制
相同点
原理
DNA双链复制(碱基互补配对)
原料
四种游离的脱氧核苷酸
条件
模板、 酶等
不
同
点
解旋方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
主要在细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)
细胞内含有的DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的DNA片段
形成整个DNA分子
第二步: 基因表示载体的构建( 核心)
1.目的: 使目的基因在受体细胞中稳定存在, 而且能够遗传至下一代, 使目的基因能够表示和发挥作用。
2.组成: 目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
( 1) 启动子: 是一段有特殊结构的DNA片段, 位于基因的首端, 是RNA聚合酶识别和结合的部位, 能驱动基因转录出mRNA, 最终获得所需的蛋白质。
( 2) 终止子: 也是一段有特殊结构的DNA片段 , 位于基因的尾端。
( 3) 标记基因的作用: 是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因, 从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常见的标记基因是抗生素基因。
3. 条件: 同种限制酶、 DNA连接酶、 ATP( 目的基因、 启动子、 终止子、 标记基因)
4. 构建步骤:
用同一种限制酶切割目的基因和载体, 从而产生相同的黏性末端, 再用DNA连接酶连接。
( 形成的分子称: 重组DNA分子或重组质粒。)
第三步: 将目的基因导入受体细胞_
1.转化的概念: 是目的基因进入受体细胞内, 而且在受体细胞内维持稳定和表示的过程。
2.将目的基因导入受体细胞:
⑴常见的受体细胞: 动植物细胞、 大肠杆菌、 土壤农杆菌、 枯草杆菌等。
⑵将目的基因导入受体细胞的原理: 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
3.常见的转化方法:
( 1) 将目的基因导入植物细胞: 采用最多的方法是 农杆菌转化法, 其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。
﹡农杆菌转化法
①特点: 易感染双子叶植物和裸子植物, 对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理: Ti质粒上的T-DNA能够转移到受体细胞, 并整合到受体细胞染色体的DNA上。

( 2) 将目的基因导入动物细胞: 最常见的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵( 也能够是卵细胞) 。
( 3) 将目的基因导入微生物细胞: 原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、 多为单细胞、 遗传物质相对较少 , 最常见的原核细胞是 大肠杆菌 , 其转化方法是: 先用 Ca2+ 处理细胞, 使其成为 感受态细胞 , 再将 重组表示载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合, 在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子, 完成转化过程。
※ 感受态细胞: 大肠杆菌细胞最常见的转化方法是: 首先用用钙离子处理细胞, 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态, 这种细胞称感受态细胞。
﹡总结:
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常见方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表示
将含有目的基因的表示载体提纯→取卵( 受精卵) →显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→微生物细胞壁的通透性增加→重组质粒与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
受体细胞的种类
l 植物: 能够是受精卵、 体细胞( 可经组织培养成完整个体)
l 动物: 受精卵( 因为动物细胞的全能性受到抑制)
4.转化的实质: 目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。
5.重组细胞导入受体细胞后, 筛选含有基因表示载体受体细胞的依据是标记基因是否表示。
第四步: 目的基因的检测和表示
1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因, 方法是采用 DNA分子杂交技术。
基因探针: 是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子
2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA, 方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质, 方法是从转基因生物中提取 蛋白质, 用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。
4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定, 对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。
例如, 大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因, 当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒, 并被转入受体细胞后, 就能够根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组的DNA分子进入受体细胞后, 受体细胞必须表现出特定的性状, 才能说明目的基因完成了表示过程。例如, 科学家最初做抗虫棉试验时, 虽然已经检测出棉的植株中含有抗虫的基因, 但让棉铃虫食用棉的叶片时, 棉铃虫并没有被杀死, 这说明抗虫基因还不能在高等植物中表示。科学家在研究的基础上, 又一次对棉植株中的抗虫基因进行了修饰, 然后再让棉铃虫食用棉的叶片, 结果食用的第二天棉铃虫就中毒死亡了。这说明抗虫基因在棉植株中得到了表示。
﹡基因工程育种
1、 方法: 提取目的基因→装入载体→导入受体细胞→基因表示→筛选出符合要求的新品种
2、 原理: 基因重组。
3、 优点: 目的性强, 能够按照人们的意愿定向改造生物; 育种周期短。
4、 缺点: 技术复杂, 存在安全性问题。
5、 实例: 抗软化番茄的培育。

什么是分子杂交技术的显示带?
Southern杂交──DNA和DNA分子之间的杂交。
Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交。
Western杂交──蛋白质分子( 抗原—抗体) 之间的杂交。它是检测目的基因是否表示出蛋白质的一种方法。具体做法是: 第一步, 将目的基因在大肠杆菌中表示出蛋白质; 第二步, 将表示出的蛋白质注射动物进行免疫, 产生相应的抗体, 并提取出抗体( 一抗) ; 第三步, 从转基因生物中提取蛋白质, 走凝胶电泳; 第四步, 将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上; 第五步, 将抗体( 一抗) 与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交, 这时抗体( 一抗) 与目的基因表示的蛋白( 抗原) 会特异结合。由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带, 因此加入一种称为二抗的抗体, 它能够与一抗结合, 二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表示出了蛋白质, 则结果为阳性。
三、 基因工程的应用
﹡转基因生物
是指利用基因工程技术导入外源基因培育出的、 能够将新性状稳定地遗传给后代的基因工程生物。
( 一) 植物基因工程: 提高农作物的抗逆能力( 如抗虫、 抗病、 抗除草剂、 抗干旱、 抗盐碱) , 利用转基因改良植物的品质和利用植物生产药物等方面。
1.抗虫转基因植物
(1)常见抗虫基因: 用于抗虫( 杀虫) 的基因主要是Bt毒蛋白基因、 蛋白酶抑制剂基因、 淀粉酶抑制剂基因、 植物凝集素基因等。
(2)减轻农药对环境的污染
2.抗病转基因植物
(1)病原微生物: 引起植物生病的微生物, 主要有病毒、 真菌和细菌。
( 2) 常见的抗病基因:
a.抗病毒基因有: 病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因;
b.抗真菌基因有: 几丁质酶基因和抗毒素合成基因
3.抗逆转基因植物
环境条件对农作物的生产会造成很大影响, 而且这些影响是多方面的, 因此, 抗逆性基因也有多种多样, 如: 抗盐碱和干旱的调节细胞渗透压基因、 抗冻基因、 抗除草剂基因等等。
4.利用转基因改良植物的品质
由于人们的食品含有的营养不平衡, 不能满足人们对食品的要求, 这样, 能够经过转基因技术, 使植物能够合成某些原来不能合成的物质。如科学家将必须氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中, 或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性, 以提高氨基酸的含量。
﹡基因工程育种
①方法: 提取目的基因→基因表示载体的构建( 制备重组DNA分子) →导入受体细胞→目的基因表示→筛选出符合要求的新品种
②原理: 基因重组。
③优点: 目的性强, 能够按照人们的意愿定向改造生物; 育种周期短。
④缺点: 技术复杂, 存在安全性问题。
⑤实例: 抗软化番茄的培育、 转基因抗虫棉、 转基因”超级小鼠”等。
( 二) 动物基因工程: 动物品种改良、 建立生物反应器、 器官移植。
1.用于提高动物生长速度: 由于外援生长激素基因的表示能够使转基因动物生长得更快, 将这类基因导入动物体内, 以提高动物的生长速率。如: 转基因绵羊和转基因鲤鱼。
2.用于改进畜产品的品质: 基因工程可用于改进畜产品的品质。如: 有些人对牛奶中的乳糖不能完全消化或食用后会出现过敏、 腹泻、 恶心等不适症状, 科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组, 这样所获得的牛奶其成分不受影响, 但乳糖的含量大大减低。
3.用转基因动物生产药物: 乳腺生物反应器( 乳房生物反应器)
最令人兴奋的是利用基因工程技术, 使哺乳动物本身变成”批量生产药物的工厂”
大概过程: 目的基因( 蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子) --->显微注射方法--->导入哺乳动物受精卵 --->送入母体子宫内--->能产生药品蛋白质转基因动物--->泌乳期, 分泌乳汁生产药物
能产生如: 抗凝血酶, 血清白蛋白, 生长激素, 抗胰蛋白酶, 等大量蛋白质类药品。
﹡乳腺生物反应器与微生物生产的比较
　 类型
项目　　
乳腺生物反应器
微生物生产
基因结构
动物基因结构与人类基因结构相同
与人类基因结构不同
基因表示
与天然蛋白质活性没有区别
由于缺少内质网、 高尔基体等细胞器, 产物可能不具有生物活性
产物提取
从乳汁中较易分离提取
从细胞中提取, 较为复杂
生产设备
畜牧业生产, 加提取设备
工业生产, 设备精良
4.用转基因动物做器官移植的供体: 当前, 人体移植器官短缺是一个世界性的难题, 用其它动物的器官替代, 又会出现免疫排斥现象, 现在, 科学家正试图利用基因工程方法对一些动物的器官进行改造, 培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆器官。
( 三) 基因工程药物的生产: 如用转基因工程菌生产细胞因子、 抗体、 疫苗、 激素等。
1.微生物的基因工程:
利用转基因工程菌生产药物: 如细胞因子, 抗体, 疫苗, 激素( 胰岛素) , 干扰素等, 已形成工业化。
2.工程菌: 用基因工程的方法, 使外源基因得到高效率表示的菌类细胞株系一般称为工程菌。
3.微生物在基因工程中的应用研究
工具酶主要来自微生物, 最重要的目的基因供体库之一, 目的基因的载体之一, 作用受体细胞, 提供用于发酵的工程菌。
( 四) 基因治疗:
( 1) 概念: 基因治疗是把正常基因导入病人体内, 使该基因的表示产物发挥功能, 从而达到治疗疾病的目的, 这是治疗遗传病的最有效的手段。
( 2) 方法: 体外基因治疗和体内基因治疗
①体外基因治疗: 先从病人体内获得某种相关细胞, 进行培养, 然后在体外完成基因转移, 再筛选成功转移的细胞扩增培养, 最后重新输入患者体内, 这种方法叫做体外基因治疗。
②体内基因治疗: 直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法叫做体内基因治疗。
﹡用于基因治疗的基因种类:
①功能正常的基因: 从健康人体上分离得到的, 用以取代病变基因, 或依靠其表示产物来弥补病变基因带来的生理缺陷。
②反义基因: 即经过产生的mRNA分子, 与病变基因产生的mRNA进行互补, 来阻断蛋白质合成。
③自杀基因: 是编码能够杀死癌变细胞的蛋白酶基因。
( 3) 实例: ADA基因缺陷症基因治疗机理

【区分】基因诊断、 基因治疗
基因诊断: 采用基因检测( 用基因探针, 利用DAN分子杂交原理, 鉴定被检测样本上的遗传信息, 从而达到检测病症的目的, 如镰刀形贫血症, 苯丙酮尿症, 癌症) 的方法来判断患者是否出现了基因异常( 如遗传病患者的基因缺陷) 或是否携带病原体( 如乙型肝炎病毒) 等。
基因治疗: 基因治疗是把正常基因导入病人体内, 使该基因的表示产物发挥功能, 从而达到治疗病症的目的, 这是治疗遗传病的最有效的手段。
四、 蛋白质工程的崛起
1.蛋白质工程崛起的缘由
基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质, 这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的, 它们的结构和功能符合物种生存的需要, 却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
2.蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础, 经过基因修饰或基因合成, 对现有蛋白质进行改造, 或制造一种新的蛋白质, 以满足人类的生产和生活的需求。( 基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质)
基因工程是其中的关键技术, 因此, 蛋白质工程又被称为第二代基因工程。
3.蛋白质工程的原理
( 1) 、 天然蛋白质合成:
基因→表示( 转录和翻译) →形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。( 中心法则)
( 2) 、 蛋白质工程:
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列( 基因)

4.蛋白质工程的类型
( 1) 、 类型
①大改: 是指根据氨基酸的性质和特点, 设计并制造出自然界中不存在的全新蛋白质, 使之具有特定的氨基酸序列、 空间结构和预期的功能。
②中改: 是指在蛋白质分子中替代某一肽段或一个特定的结构域。
③小改: 是指经过基因工程中的定点诱变技术, 有目的地改造蛋白质分子中某活性部位的1个或几个氨基酸残基, 以改进蛋白质的性质和功能。
( 2) 、 定点诱变技术( 看书P26积极思维, 见右图)
5、 蛋白质工程的应用
( 1) 、 经过改造酶的结构, 有目的地提高酶的热稳定性。
( 2) 、 在生物工程制药领域, 蛋白质工程也有广泛的应用。
★蛋白质工程与基因工程区别

蛋白质工程
基因工程
实质
经过改造基因, 以定向改造天然蛋白质, 甚至创造自然界不存在的蛋白质
将目的基因从供体转移到受体细胞, 并在受体细胞中表示
结果
合成自然界不存在的蛋白质
只能生产自然界已存在的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程基础上, 延伸出的第二代基因工程