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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,课题1 DNA粗提取与判定,一.基础知识,DNA粗提取基本思绪：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面,差异,，提取DNA，去除其它成份。,1.提取生物大分子基本思绪：,选取一定物理或化学方法分离含有不一样物理或化学性质生物大分子。,第1页,2.DNA理化特征,1)DNA溶解性,在NaCl溶液浓度在,0.14 mol/L,时,DNA溶解度,最小,；,低于(或高于)0.14 mol/L时，DNA溶解度随NaCl溶液浓度降低(或增加)而逐步增大。,DNA,不溶于,酒精，一些蛋白质溶于酒精,第2页,2)DNA其它特征,蛋白酶能水解蛋白质，不过对DNA没有影响,大多数蛋白质不能忍受6080,高温，而DNA在,80,以上才会变性,洗涤剂,能够,瓦解,细胞,细胞膜,，但对DNA没有影响,3.DNA判定原理,1)DNA,二苯胺,试剂,沸水浴,溶液变,蓝色,2)DNA可被,甲基绿,染成,绿色,第3页,一)试验原理,二.试验设计,1.破碎细胞，释放核物质,动物细胞,加,蒸馏水,让细胞吸水,胀破,过滤得滤液,植物细胞,加洗涤剂和食盐,充分研磨,蒸馏水对于鸡血细胞来说是,低渗溶液,水分可大量进入鸡血细胞,是细胞,胀裂,从而,释放,DNA,搅拌可,加速,细胞破裂,讨论：为何加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,第4页,二)试验材料选取,选DNA,含量较高,生物组织作为材料,成功可能性更大,材料：可选鱼卵、猪肝、鸡血,2.除去杂质，分离出DNA,用浓度为2mol/LNaCl溶液溶解DNA,逐步加水稀释,当降至,0.14molL,时(溶解度最低)能够使DNA,析出,向DNA盐溶液，逐步加,酒精,，可,析出DNA,第5页,三)试验步骤,1,.0.1g/ml柠檬酸钠溶液,按1:2百分比与新鲜鸡血混合搅拌均匀，将血液置于冰箱中24小时,弃上部澄清液,鸡血加入柠檬酸钠溶液液，是为了预防血液凝固。,第6页,三)试验步骤,2.取烧杯中血细胞液约5,10ml加入到100ml烧杯中，,向烧杯中加入20ml蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速,搅拌5分钟，加速血细胞在低渗溶液中破裂,3.将2mol/L氯化钠溶液50ml缓缓倒入烧杯中，用玻棒,沿一个方向搅拌，使DNA溶解于氯化钠溶液中，过滤,取滤液,第7页,三)试验步骤,4.将鸡血细胞DNA提取液置于较大烧杯中，沿烧杯内壁缓缓倒入蒸馏水，并不停搅拌，直到粘稠状DNA不再析出为止。用玻棒搅拌，使析出DNA缠绕于玻棒末端。,5.将析出DNA再溶解于2mol/L氯化钠溶液中。,6.在DNA氯化钠溶液中倒入95%酒精50 ml（冷却过酒精效果很好)，使DNA再次析出，用玻棒搅拌，使DNA再次缠绕于玻棒末端。,2mol/LNaCl溶液,冷酒精,第8页,三)试验步骤,7.DNA判定：取两支试管，各加入2ml0.015氯化钠溶液，将DNA溶解于其中一支试管中，另一支做为对照组。然后，在两支试管内加等量二苯胺试剂，水浴加热10min左右，冷却，观察试验现象。,第9页,例1.以下关于DNA叙述正确是(）,A.伴随氯化钠溶液浓度增大，DNA在氯化钠溶液中溶解度也增大,B.伴随氯化钠溶液浓度减小，DNA在氯化钠溶液中溶解度也减小,C.DNA不溶于酒精，也不溶于0.14mol/L氯化钠溶液,D.DNA与二苯胺试剂在沸水中加热，溶液变蓝色,D,第10页,例2.鸡血中含大量红细胞，试验室惯用鸡血提取DNA。依据DNA提取试验，完成以下各题。,1.为了预防鸡血凝血需加入试剂是,。,2.将鸡血离心，取下层，除去上清目标是,3.向DNA氯化钠溶液缓缓加蒸馏水，直至析出DNA不再增加，此时氯化钠溶液浓度约为,.,柠檬酸钠,去杂质,0.14mol/L,4.若没鸡血，能否用牛羊血代替？为何？,5.若用菜花进行提取,需加入,并充分研磨,洗涤剂和,食盐,第11页,课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段（PCR）,第12页,一、基础知识,一)PCR原理,PCR是一个在,体外,快速扩增,特定基因或DNA片段,技术，它能以极少许DNA为模板，在几小时内复制出上百万份DNA拷贝。,1.PCR反应条件,一定缓冲溶液-维持pH；,DNA模板；,分别与两条模板链相结合,两种,引物；,四种脱氧核苷酸；耐热DNA聚合酶；控制温度,第13页,所以，DNA复制方向：只能从子链,5端到3端,延伸,2.DNA复制方向,DNA聚合酶,不能从头开始,合成DNA，,只能,将核苷酸连接到,DNA片段3端,。,引物,能与母链一段碱基序列互补配正确一小段单链DNA片段或RNA,且需要,引物,(2030个核苷酸),第14页,PCR技术经过,控制温度,来控制双链解旋与结合,DNA在,80100,时双螺旋结构将解体,双链分开;当,温度降低,后双链又能重新结合成双螺旋结构,所以,PCR过程,无需,解旋酶,但需,耐高温,DNA聚合酶,3.DNA热变性原理,第15页,二)PCR反应过程,1.变性：,2.复性：,3.延伸：,循环,升高温度到90,0,C以上,DNA解聚为单链,温度降到50,0,C左右,两种引物与两条单链DNA结合,升温度升到70,0,C左右,在DNA聚合酶作用下用溶液中脱氧核苷酸依据碱基互补配对标准合成新DNA链,第16页,一)试验操作步骤,准备好PCR反应体系配方,用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分,盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液,离心10S,将离心管放入PCR仪上,设置好循环程序进行反应,二、试验操作,第17页,二)操作提醒,PCR技术,高度灵敏，,为了防止外源DNA等原因污染而造成干扰试验，PCR操作时要注意做到：,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行,高压蒸汽灭菌,；,所用试剂在,-20保留,，使用时，放在,冰块,上慢慢融化。,分装试剂，简化操作程序，使用,一次性枪头。,第18页,三、,结果分析与评价,-DNA含量测定,1,、测定,原理,能够经过计算DNA含量来评价扩增效果，DNA在260nm紫外线波段有一强烈吸收峰，峰值大小与DNA含量相关。,2,、,过程,稀释：,2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计读数调整至零。,取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处光吸收值,比色,第19页,计算,DNA含量(,g/mL,)50 x(260nm读数)x 稀释倍数,50：1,g,/mLDNA在厚度为1cm比色杯中吸光值为0.02,第20页,课题3 血红蛋白提取和分离,第21页,课题3 血红蛋白提取和分离,基础知识,一)凝胶色谱法,依据被分离物质蛋白质,相对分子质量,大小，来进行分离。,1.概念：,思绪,利用不一样蛋白质分子特征(形状、大小、带电情况等)差异，分离不一样种类蛋白质,第22页,课题3 血红蛋白提取和分离,基础知识,一)凝胶色谱法,2.原理：,2）当相对分子量不一样蛋白质经过凝胶时，相对分子量,较小,蛋白质轻易,进入,凝胶,内部,通道，旅程较,长,，移动速度较,慢,;,而相对分子量,较大,蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能,在,凝胶,外部,移动，旅程较,短,，移动速度较,快,。,1),凝胶,是由多糖类化合物(如葡聚糖)组成,多孔小球体,，内部有许多贯通,通道,。,第23页,课题3 血红蛋白提取和分离,基础知识,二)缓冲液,1.概念:,在,一定,范围内，凡是能够,抵制,外加少许强,酸或强碱影响使原来溶液PH值,基本保持不变,混,合溶液。,能够抵制外界酸和碱对溶液PH值影响，,维持,PH基本不变。,2.作用:,第24页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,蛋白质提取和分离步骤：,1.样品处理,2.粗分离,3.纯化,4.纯度判定,第25页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,1.样品处理:,1)红细胞,洗涤,:,目标:去除杂蛋白,b低速短时间离心,操作:,a采集血样,d盐水洗涤,c吸收血浆,上层透明黄色血浆,重复b c d步骤三次,用五倍体积质量分数为0.9NaCl溶液洗涤,加抗凝剂柠檬酸钠,第26页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,1.样品处理:,2)血红蛋白释放：,加蒸馏水到原血液体积,再加40体积甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)细胞破裂释放出血红蛋白。,3)分离血红蛋白溶液：,第27页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,1.样品处理:,3)分离血红蛋白溶液：,过程：,离心(以r/min,10 min),过滤(用滤纸,除去脂溶性沉淀层),分离(用分液漏斗,分出下层,红色透明液体,),第28页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,2.粗分离透析,过程：,透析目标：,除去样品中分子量,较小,杂质,原理：,利用透析袋,半透性,一些杂质分子比血红蛋白分子,小,，,可透过,透析袋,第29页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,3.纯化,1)凝胶色谱柱,制作,：,玻璃管,底塞制作,顶塞制作,组装,安装其它从属结构,原理,用,凝胶色谱法,将,分子量较大,杂质蛋白质除去,步骤,第30页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,3.纯化,步骤,2)凝胶色谱柱,装填,凝胶选择,凝胶前处理,凝胶色谱柱装填方法,注意:a凝胶装填时尽可能紧密,以降低凝胶颗粒之间空隙,b装填凝胶柱时不得有气泡存在,第31页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,3.纯化,步骤,2)凝胶色谱柱,装填,凝胶选择,凝胶前处理,凝胶色谱柱装填方法,注意:a凝胶装填时尽可能紧密,以降低凝胶颗粒之间空隙,b装填凝胶柱时不得有气泡存在,洗涤平衡,注意：,a液面不要低于凝胶表面，,b不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒现象,第32页,3.样品加入和洗脱,1.调液面,2.加样,3.再调液面,4.洗脱,5.搜集,缓冲液,凝胶,第33页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,3.纯化,步骤,3)样品加入与洗脱,注意：a不要触及并破坏凝胶面。b贴壁加样。,c使吸管管口沿管壁围绕移动。,第34页,课题3 血红蛋白提取和分离,试验操作,4.纯度判定,SDS聚丙烯酰胺凝胶,电泳,2.试剂配制：,判定血红蛋白,纯度,。,1.目标：,3.电泳方法步骤,略,第35页,课题3 血红蛋白提取和分离,基础知识,三)电泳,1.概念:,带电,粒子,在电场作用下发生,迁移,过程,2.类型:,琼脂糖凝胶电泳、,聚丙稀酰胺,凝胶电泳,第36页,课题3 血红蛋白提取和分离,SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳法,SDS,十二烷基硫酸钠,作用:能使蛋白质变性(解聚);,消除,净电荷,对迁移率影响,使电泳迁移率,完全取决,于分子,大小,。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中,迁移率,取决,于它所带,净电荷,多少以及分子,大小,等原因,第37页,洗涤剂能,溶解细胞膜,，使膜瓦解，利于释放DNA,食盐主要成份是,NaCl,，,有利,于DNA,溶解,细胞内DNA,释放不完全,提取DNA量变少；造成看不到丝状沉淀物、用二苯胺判定不显示蓝色。,植物细胞,加洗涤剂和食盐,充分搅拌研磨,过滤得滤液,讨论：假如研磨不充分，会对试验结果产生怎样影响？,第38页,1.以血液为试验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，预防血液凝固。,2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，不然轻易产生大量泡沫，不利于后续步骤操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子断裂，造成DNA分子不能形成絮状沉淀。,3.二苯胺试剂要现配现用,不然会影响判定效果,三.操作提醒,第39页,二苯胺试剂配制,称取,1.5g,二苯胺，溶于,100ml,冰醋酸中，再加入,1.5ml,浓硫酸，用棕色瓶保留。临用前，在,10ml,上述溶液中再加入,0.1ml,体积分数为,0.2%,乙醛溶液。,参考资料,第40页,
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