专题五DNA和蛋白质技术.doc

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专题5 DNA和蛋白质技术
【课题目标】
本课题经过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取, 了解DNA的物理化学性质, 理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。
【课题重点与难点】
课题重点: DNA的粗提取和鉴定方法。
课题难点: DNA的粗提取和鉴定方法。
【知识要点】
1. DNA的物理化学性质, 特别是DNA的溶解性;
2. 2.二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。
[学习导航]
DNA和蛋白质技术, 包括DNA的提取、 蛋白质的提取、 DNA片段的扩增等, 是开展分子生物学研究的基本技术。本专题将从基础入手, 学习DNA的粗提取、 PCR技术和血红蛋白的提纯。学习这些技术, 不但能够帮助学生初步了解分子生物学的基本实验方法, 而且能够巩固必修课中学习的有关DNA和蛋白质的理论知识。
本专题的3个课题相对独立, 没有严格的先后顺序。课题1的操作难度不高, 学生比较容易获得结果。课题2的操作难度也不高, 但PCR技术的原理是难点, 学生要充分利用教材的图文资料, 而且在教师的引导下进行实验操作。课题3的操作难度比较大, 因此学生一定要在教师的精心指导下完成操作。
课题1 DNA的粗提取与鉴定
[导学诱思]
1．提取DNA的方法
提取生物大分子的基本思路是 。对于DNA的粗提取而言, 就是要利用 、 等在物理和化学性质方面的差异, 提取DNA, 去除其它成分。
1) DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的 中溶解度不同, 利用这一特点, 选择适当的盐浓度就能使 充分溶解, 而使杂质沉淀, 或者相反, 以达到分离目的。
图5—1是DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线, 请根据曲线图,
思考:
①在什么浓度下, DNA的溶解度最小? DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的?

②如何经过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出?

另外, DNA不溶于 溶液, 可是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理, 能够将DNA与蛋白质进一步的分离。
2) DNA对酶、 高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解 , 可是对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温, 而DNA在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 , 但对DNA没有影响。
3) DNA的鉴定 在 条件下, DNA遇 会被染成 色, 因此二苯胺能够作为鉴定DNA的试剂。
2．实验设计
1) 实验材料的选取 凡是含有 的生物材料都能够考虑, 可是使用 的生物组织, 成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料:
鱼卵、 猪肝、 菜花( 花椰菜) 、 香蕉、 鸡血、 哺乳动物的红细胞、 猕猴桃、 洋葱、 豌豆、 菠菜、 在液体培养基的大肠杆菌
思考:
哺乳动物的红细胞的特点?

2) 破碎细胞, 获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易, 以鸡血细胞为例, 在鸡血细胞液中加入一定量的 , 同时用 搅拌, 过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞, 需要先用 溶解细胞膜。例如, 提取洋葱的DNA时, 在切碎的洋葱中加入一定的 和 , 进行充分的搅拌和研磨, 过滤后收集研磨液。

思考:
①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?

②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?

③如果研磨不充分, 会对实验结果产生怎样的影响?

④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?

3) 去除滤液中的杂质 阅读课本的三个方案,
思考:
为什么重复地溶解与析出DNA, 能够去除杂质?

方案二与方案三的原理有什么不同?

4) DNA的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤, 加入与滤液体积 、 冷却的 , 静置 , 溶液中会出现 , 这就是粗提取的DNA。用玻璃棒 搅拌, 卷起丝状物, 并用滤纸吸取上面的水分。
取两支20ml的试管, 各加入物质的量浓度为 的NaCl溶液5ml, 将丝状物放入其中一支试管中, 用玻璃棒搅拌, 使丝状物溶解。然后, 向两支试管中各加入4ml的
。混合均匀后, 将试管置于 中加热5min, 待试管冷却后, 比较两支试管溶液颜色的变化, 看看溶解有DNA的溶液是否变 。
3．操作提示
以血液为实验材料时, 每100ml血液中需要加入3g , 防止 。
加入洗涤剂后, 动作要 、 , 否则容易产生大量的泡沫, 不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时, 动作要 , 以免 , 导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
二苯胺试剂要 , 否则会影响鉴定的效果。
4．结果分析与评价
[疑难点拨]
1． DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系:
当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时, 随浓度的升高, DNA的溶解度降低; 当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时, 随浓度升高, DNA的溶解度升高。
2． 制备鸡血细胞液时, 要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因
制备鸡血细胞液时, 要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠, 防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应, 生成柠檬酸钙络合物, 血浆中游离的Ca2+大大减少, 血液便不会凝固, 因为鸡血红细胞, 白细胞都有细胞核, DNA主要存在于细胞核中, 因此在离心或静置沉淀后, 要弃出上层清液——血浆。
3．提取DNA的第一步是材料的选取, 其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料, 否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难; 第二步是DNA的释放和溶解, 这一步是实验成功与否的关键, 要尽可能使细胞内的DNA全部溶解; 第三步是DNA的纯化, 即根据DNA的溶解特性、 对酶及高温的耐受性的不同等特性, 最大限度地将DNA与杂质分开; 最后一步是对DNA进行鉴定, 这是对整个实验的结果的检测。
4．在DNA的析出的步骤中用到玻璃棒搅拌时, 注意动作要轻缓, 以免加剧DNA分子的断裂, 导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
5．盛放鸡血细胞液的容器, 最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA, 容易被玻璃容器吸附, 由于细胞内DNA的含量原来就比较少, 再被玻璃容器吸附去一部分, 提取到的DNA就会更少。因此, 实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管, 这样能够减少提取过程的DNA的损失。
[典例解析]
本实验中有三次过滤:
⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液
⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液
⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液
以上三次过滤分别为了获得( )
A含核物质的滤液、 纱布上的粘稠物、 含DNA的滤液
B含核物质的滤液、 滤液中DNA粘稠物、 含DNA的滤液
C含核物质的滤液、 滤液中DNA粘稠物、 纱布上的DNA
D含较纯的DNA滤液、 纱布上的粘稠物、 含DNA的滤液
答案: A
解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液, 使血细胞的细胞膜、 核膜破裂, 释放出核物质, 此时过滤只能得到含DNA和其它物质如蛋白质的滤液, 这种滤液必须经过实验中其它步骤得相继处理, 方能得到较纯的DNA。DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低, 成丝状粘稠物, 可经过滤留在纱布上。
【课本问题答案和提示】
( 一) 旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?
答: 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体, 水分能够大量进入血细胞内, 使血细胞胀裂, 再加上搅拌的机械作用, 就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂), 从而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?
答: 洗涤剂是一些离子去污剂, 能溶解细胞膜, 有利于DNA的释放; 食盐的主要成分是NaCl, 有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分, 会对实验结果产生怎样的影响?
答: 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全, 提取的DNA量变少, 影响实验结果, 导致看不到丝状沉淀物、 用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?
答: 可能含有核蛋白、 多糖和RNA等杂质。
5．为什么重复地溶解与析出DNA, 能够去除杂质?
答: 用高盐浓度的溶液溶解DNA, 能除去在高盐中不能溶解的杂质; 用低盐浓度使DNA析出, 能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此, 经过重复溶解与析出DNA, 就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

6．方案二与方案三的原理有什么不同?

答: 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白, 从而使提取的DNA与蛋白质分开; 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同, 从而使蛋白质变性, 与DNA分离。

( 二) 练习

1．答: 提取DNA的第一步是材料的选取, 其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料, 否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难; 第二步是DNA的释放和溶解, 这一步是实验成功与否的关键, 要尽可能使细胞内的DNA全部溶解; 第三步是DNA的纯化, 即根据DNA的溶解特性、 对酶及高温的耐受性的不同等特性, 最大限度地将DNA与杂质分开; 最后一步是对DNA进行鉴定, 这是对整个实验的结果的检测。
2．答: 提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为, 与DNA相比, 蛋白质对温度、 盐浓度、 pH等条件要敏感得多, 很容易失活; 而且蛋白质的空间结构多种多样, 理化性质各不相同, 使得蛋白质的提取没有一种统一的方法, 只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件, 设计特定的方法。

[课堂演练]
一、 选择题( 10个)
1.在研究DNA的基因样本前, 采集来的血样需要蛋白水解酶处理, 然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是( D )
A.除去血浆中的蛋白质 B.除去染色体上的蛋白质 C.除去血细胞表面的蛋白质
D.除去血细胞中的所有的蛋白质, 使DNA释放, 便于进一步提纯
2．与析出DNA粘稠物有关的叙述, 不正确的是( C )
A.操作时缓缓滴加蒸馏水, 降低DNA的溶解度
B.在操作A时, 用玻璃棒轻缓搅拌, 以保证DNA分子完整
C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度, 两者均可析出
D.当丝状粘稠物不再增加时, 此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L
3．洗涤剂能够瓦解( B ) , 但对DNA没有影响。
A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D.细胞质
4．在沸水浴的条件下, DNA遇( D ) 会被染成蓝色。
A.斐林试剂 B.苏丹Ⅲ染液 C.双缩脲试剂 D.二苯胺
5．在DNA提取过程中, 最好使用塑料试管和烧杯, 目的是( B )
A.不易破碎 B.减少提取过程中DNA的损失 C.增加DNA的含量 D.容易洗刷
6．下列操作中, 对DNA的提取量影响最小的是( B )
A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂, 放出DNA等核物质
B.搅拌时, 要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌
C.在”析出DNA粘稠物”时, 要缓缓加蒸馏水, 直至溶液中粘稠物不再增加
D.在用酒精沉淀DNA时, 要使用冷酒精, 甚至再将混合液放入冰箱中冷却
E在DNA的溶解和再溶解时, 要充分搅拌
7．DNA的粗提取中, 将与滤液体积相等的、 冷却的( D ) , 静置2—3min, 溶液中会出现白色丝状物。
A.0．9%的NaCl B.0.14mol/L的NaCl溶液 C.质量分数15%的HCl D.体积分数为95%的酒精溶液
8.以血液为实验材料时, 需要向血液中加入( C ) , 防止血液凝固。
A.醋酸钠 B.龙胆紫 C.柠檬酸钠 D.醋酸洋红
9.在向溶解DNA的NaCl溶液中, 不断加入蒸馏水的目的是( C )
A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少DNA的溶解度, 加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度, 加快杂质的析出
10.去除滤液中的杂质时, 直接在滤液中加入嫩肉粉, 利用嫩肉粉中的( C ) 分解蛋白质。
A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.肠肽酶
二、 非选择题( 3个)
1．提取鸡血中DNA时, 要除去血液中的上清液, 这是因为什么?
答案: 因为上清液是血浆, 不含有血细胞, DNA存在于沉郁试管底部的鸡血细胞的细胞核中, 因此提取鸡血中的DNA时, 要除去血液中的上清液。
2．填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。
⑴提取鸡血细胞中核物质
⑵溶解核内DNA:
⑶析出2mol/LNaCl溶液中的DNA
⑷DNA粘稠物的再溶解
⑸提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物
⑹DNA的鉴定
答案: ⑴蒸馏水⑵2mol/LNaCl溶液⑶蒸馏水⑷2mol/LNaCl溶液⑸冷却的95%的酒精⑹二苯胺
3.关于DNA粗提取的实验材料的选择, 也经过了多次实验效果的比较, 最终选择鸡血做实验材料的原因是什么? 请回答下列问题:
⑴鸡血细胞中红细胞 , 家鸡属于鸟类, 新陈代谢旺盛, 因而血液中 细胞树木较多, 能够提供丰富的 。
⑵实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料, 而不用鸡全血, 主要原因是
。
⑶生活在牧区的人们, 采集牛、 羊和马血比较方便, 若她们按实验要求完成实验步骤后, 结果是 , 这是因为这些动物和人一样, 成熟的红细胞中 , 但若改用动物肝脏做实验材料, 实验能顺利进行。这是因为 。
⑷若选用动物肝脏做实验材料, 在提取之前, 最好增加 程序, 使组织细胞更易分离。
答案: ⑴含细胞核; 红; DNA ⑵鸡血细胞液中DNA相对含量⑶很难提取到DNA; 无细胞核; 肝细胞有细胞核⑷研磨

【知识拓展】
1.二苯胺鉴定DNA的化学原理
DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛, 它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅, 与溶液中DNA含量的多少有关。
2.研磨液中几种药品的作用
Tris/HCl:提供缓冲体系, DNA在这一体系中呈稳定态( Tris为三羟甲基氨基甲烷) 。
EDTA( 乙二胺四乙酸二钠) : 是DNA酶的抑制剂, 能够防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。
SDS( 十二烷基磺酸钠) : 能够使蛋白质变性, 与DNA分离。
【教学反思】

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
【课题目标】
本课题经过尝试PCR( DNA多聚酶链式反应) 技术的基本操作, 使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法, 理解PCR的原理, 讨论PCR的应用。
【课题重点与难点】
课题重点: PCR的原理和PCR的基本操作。
课题难点: PCR的原理。

[导学诱思]
1．PCR原理
填写下列表格
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶

DNA母链

合成子链的原料
DNA聚合酶

引物

DNA的两条链是反向平行的, 一般将DNA的羟基末端称为 , 而磷酸基团的末端称为 。DNA聚合酶不能 开始合成DNA, 而只能 , 因此, DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是 。
在DNA的复制过程中, 复制的前提是 。在体外可经过控制 来实现。在 的温度范围内, DNA的双螺旋结构将解体, 双链分开, 这个过程称为 。PCR利用了DNA的 原理, 经过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高, 导致DNA聚合酶失活, 后来 的DNA聚合酶的发现和应用, 大大增加了PCR的效率。
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供: , ,
, , 同时经过控制温度使DNA复制在体外重复进行。
2．PCR的反应过程
PCR一般要经历 循环, 每次循环能够分为 、 和 三步。从第二轮循环开始, 上一次循环的产物也作为模板参与反应, 而且由 延伸而成的DNA单链会与 结合, 进行DNA的延伸, 这样, DNA聚合酶只能
, 使这段固定长度的序列成指数扩增。
3．实验操作
在实验室中, 做PCR一般使用 , 它是一种薄壁塑料管。具体操作时, 用微量移液器, 按PCR反应体系的配方在 中依次加入各组分, , 再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。
4．操作提示
为避免外源DNA等因素的污染, PCR实验中使用的 、 、 以及蒸馏水等在使用前必须进行 。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份, 并在
储存。使用前, 将所需试剂从冰箱拿出, 放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时, 移液管上的枪头要 。
[疑难点拨]
1.PCR技术简介
PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术, 它能以极少量的DNA为模板, 在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题, 被广泛的应用于遗传疾病的诊断、 刑侦破案、 古生物学、 基因克隆和DNA序列测定等各方面。
2．细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用
①解旋酶: 打开DNA双链 ②DNA母链: 提供DNA复制的模板 ③4种脱氧核苷酸: 合成子链的原料 ④DNA聚合酶: 催化合成DNA子链 ⑤引物: 使DNA聚合酶能够从引物的3, 端开始连接脱氧核苷酸( 引物是一小段DNA或RNA, 它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度一般为20—30个核苷酸)
3．DNA的合成方向
DNA的两条链是反向平行的, 一般将DNA的羟基末端称为3, 端, 而磷酸基团的末端称为5, 端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA, 而只能从3, 端延伸DNA链, 因此, DNA复制需要引物。当引物与DNA母链经过碱基互补配对结合后, DNA聚合酶就能从引物的3, 端开始延伸DNA链, DNA的合成方向总是从子链的5, 端向3, 端延伸。
4．PCR的反应过程
PCR一般要经历三十多次循环, 每次循环能够分为变性( 当温度上升到90oC以上时, 双链DNA解聚为单链) 、 复性( 温度下降到50oC左右, 两种引物经过碱基互补配对与两条单链DNA结合) 和延伸( 温度上升到72oC左右, 溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下, 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链) 三步。从第二轮循环开始, 上一次循环的产物也作为模板参与反应, 而且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合, 进行DNA的延伸, 这样, DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列, 使这段固定长度的序列成指数扩增。
5．PCR技术与DNA的复制
PCR反应是经过控制温度使DNA复制在体外重复进行。PCR反应的实质就是DNA复制, 因此有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同, 计算方法也大致相同。例如: PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累, 其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。( 230)
[典例解析]]
一个由15N标记的DNA分子, 放在没有标记的环境中培养, 利用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的( )
A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25
答案: C
解析: 一个DNA分子利用PCR技术循环5次后产生的DNA分子数目为2n。而DNA的复制是半保留复制, 其特点是: 新形成的DNA双链, 一条是来自亲代DNA分子的母链, 另一条是新形成的子链。这样最初由15N标记的DNA分子复制后, 其标记的两条链就分别进入两个子代DNA分子中, 这样两个子代DNA分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培养, 不论经过多少次复制, 最初标记的两条链始终存在于两个DNA分子中, 这样经过n次循环后, 标记的DNA分子中2/2n,即1/2n-1。
【课本问题答案和提示】
练习
1.提示: 绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累, 其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段( 2n=230=1 073 741 824)。
2.提示: PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验, 感兴趣的学生能够参考《分子克隆实验指南》( 见本专题参考书目) , 书中有详尽的论述。
【课堂演练】
一．选择题( 10个)
1．DNA分子复制时, 解旋的两条链中( C )
A仅一条作为复制模板
B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子
C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子
D两条链作为模板, 各自合成一条子链, 然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子, 两条新链结合成一个全新的DNA分子
2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是( D )
①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构
A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤
3.下列各项过程中, 遵循”碱基互补配对原则”的有( A )
①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录
A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤
4.实验室内模拟生物体DNA的复制必须的一组条件是( D )
①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度
A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧
5.利用PCR技术, 把一个双链DNA分子当作第一代, 经过3次循环, 在第四代DNA分子中, 有几条第一代脱氧核苷酸的长链? ( A )
A 2 B 4 C 8 D 16,
6.关于DNA分子的叙述中, 正确的是( C )
A .DNA的两条链是极性相同, 同向平行 B.DNA的两条链是极性相同, 反向平行
C.DNA的两条链中极性不同, 反向平行的 D.DNA的两条链是极性不同, 同向平行
7.假设PCR反应中, 只有一个DNA的片段作为模板, 请计算在30次循环后, 反应物中大约有多少这样的DNA片段( B )
A 215 B 230 C 260 D 231
8.DNA的合成方向总是( C ) 延伸。
A从DNA分子的左端向右端 B从DNA分子的右端向左端
C从子链的5, 端向3, 端 D从子链的3, 端向5, 端
9.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行, 需要严格的控制( C )
A 氧气的浓度 B酸碱度 C温度 D 大气的湿度
10.DNA分子经PCR反应循环一次后, 新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与( )
A模板母链相同 B非模板母链相同 C两条模板母链相同 D两条模板母链都不相同
二．非选择题( 2个)
1．PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下, 合成许许多多相同片段的一种方法, 利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段, ”人类基因组计划”的研究中常见到这种技术。请结合有关知识, 回答有关此技术的一些问题:
⑴PCR技术能把某一DNA片段进行扩增, 依据的原理是:
⑵在实验条件下, DNA分子进行扩增, 除了所要扩增的DNA片段处, 还需要 、 和 、 等条件。
⑶某DNA片段有160个碱基, 其中有腺嘌呤35个, 若让该DNA分子扩增三次( 即复制三次) 至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是 和 个。
答案: ⑴DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对
⑵四种脱氧核苷酸、 能量、 酶 ⑶245、 315
2．将大肠杆菌置于含15N的培养基上培养。这样, 后代大肠杆菌细胞中的DNA双链均被15N标记。然后将被15N标记的大肠杆菌作为亲代转到普通培养基中, 繁殖两代。亲代、 第一代、 第二代大肠杆菌DNA的状况如图所示。
⑴第一代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息与亲代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息完全相同的原因是 。
⑵如果将第二代大肠杆菌的DNA分子总量作为整体1, 其中, 带有15N的第二代大肠杆菌DNA分子约占总量的 %。
⑶如果将第二代大肠杆菌的DNA含量作为整体1, 其中含15N标记的第二代大肠杆菌的DNA含量( 脱氧核苷酸单链) 约占总量的 %
答案: ⑴它们均是以亲代15N标记的DNA双链的每条链为模板, 经过碱基互补配对原则合成的⑵50 ⑶25
【参考资料】
1.琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系
凝胶浓度要依据DNA分子的大小来确定。编码双歧杆菌16srRNA的DNA片段大小约为1 500个核苷酸的长度, 因此根据表4-1选用1％( 1 g/100 mL, 下同) 的凝胶浓度。
表4-1琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系
琼脂糖凝胶浓度(%)
线型DNA分子的分离范围(千碱基对, kb)
0.3
5～60
0.6
1～20
0.7
0.8～10
0.9
0.5～7
1.2
0.9～6
1.5
0.2～3
12.0
0.1～2
2.核酸电泳缓冲液
核酸电泳缓冲液有三种, 分别是Tris—硼酸(TBE)、 Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三种缓冲液中: TBE与TPE缓冲液容量高, 对DNA的分离效果好, 但TPE液中含磷酸盐的浓度偏高, 容易使DNA沉淀。TAE液的缓冲容量低, 价格较便宜。本实验选用的是TBE缓冲液。缓冲液中的EDTA可螯合正价阳离子, 从而抑制DNA酶的活性, 防止PCR产物被降解。
10倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。
Tris　　108 g　　EDTA　9.3 g　硼酸　　55 g
将上述物质溶解后, 用蒸馏水定容至1 000 mL, 调节pH为8.0～8.2备用, 使用时需稀释10倍。
3.核酸电泳的指示剂与染色剂
核酸电泳常见的指示剂是溴酚蓝, 溴酚蓝在碱性条件下呈蓝紫色。指示剂一般与蔗糖、 甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用是: 能够增加样品密度, 确保DNA均匀沉入加样孔内; 能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色指示带, 从而帮助预测核酸电泳的速度和位置; 能够使样品呈现蓝紫色, 使加样操作更方便。
核酸电泳后, 需要染色才能在紫外线下观察到带型。最常见的染色方法是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料, 有剧毒, 因此操作时要非常小心。EB可嵌入DNA双链的碱基对之间, 在紫外线激发下, 能发出红色荧光。染色的方法有两种。一种是在凝胶电泳液中加入EB, 使其终浓度为0.5 μg/mL; 一种是在电泳后, 将凝胶浸入0.5 μg/mL的EB溶液中, 染色10～15 min。当凝胶染色过深时, 能够将凝胶放入蒸馏水中浸泡30 min后再观察。
4.PCR的常见问题
PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见原因有: Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制; 引物设计不合理; 提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当; 循环次数不够; 等等。当实验中出现假阴性的情况时, 应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶, 并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现, 在选用Taq DNA聚合酶时, 要注意用活力高、 质量好的酶。同时, 在提取DNA模板时, 应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物, 如酚、 氯仿等的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高, 但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低, 很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况, 特别需要保证引物的3′ 端与靶基因互补。
PCR技术高度灵敏, 极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增, 因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。另外, 样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果, PCR操作时要注意做到: 隔离操作区, 分装试剂, 简化操作程序, 使用一次性吸头等

【教学反思】

课题3 血红蛋白的提取和分离
【课题目标】
本课题经过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离, 使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法, 并了解色谱法、 电泳法等分离生物大分子的基本原理, 为今后学习运用这些技术打下基础。
【课题重点与难点】
课题重点: 凝胶色谱法的原理和方法。
课题难点: 样品的预处理; 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
【导学诱思】
1．凝胶色谱法
凝胶色谱法也称做 , 是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体, 在小球体内部有许多贯穿的通道, 相对分子质量不同的蛋白质分子经过凝胶时速度不同, 相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道, 路程 , 移动速度 ; 而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道, 只能在 移动, 路程 , 移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2．缓冲溶液
缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液一般由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的, 例如: 血浆的pH是 , 要在实验条件下准确模拟生物体内的过程, 必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3．电泳
电泳是指 。许多重要的生物大分子, 如多肽、 核酸等都具有可解离的基团, 在一定的pH下, 这些基团会带上 。在电场的作用下, 这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子 以及分子本身的 、 的不同, 使带电分子产生不同的 , 从而实现样品中各种分子的分离。
两种常见的电泳方法是 和 , 在测定蛋白质分子量时一般使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。
4．蛋白质的提取和分离
蛋白质的提取和分离一般分为四步: 、 、 和 。
5．样品处理
血液由 和 组成, 其中红细胞最多。红细胞具有
的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 , 其作用是
, 血红蛋白有 个肽链组成, 包括 , 其中每条肽链环绕一个 , 磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红色。
红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 , 采集的血样要及时采用 分离红细胞, 然后用胶头吸管吸出上层透明的 , 将下层暗红色的 倒入烧杯, 再加入 , 缓慢搅拌 , 低速短时间离心, 如此重复洗涤三次, 直至 , 表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的释放 在 和 作用下, 红