微生物发酵产酶专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 惯用产酶微生物,一、应用微生物来开发酶优点：,(1),微生物生长繁殖快，生活周期短。所以，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎能够不受限制地扩大，能够满足快速扩张市场需求。,(2),微生物种类繁多，它们散布于整个地球各个角落，而且在不一样环境下生存微生物都有其完全不一样代谢方式，能分解利用不一样底物。,(3),这一特征就为微生物酶品种多样性提供了物质基础。,(4),尤其是当基因工程介入时，动植物细胞中存在地酶，几乎都能够利用微生物细胞取得。,所以，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常能够取得能够生产几乎任何一个酶适当细胞。,微生物发酵产酶专家讲座,第1页,二、用于酶生产微生物要求：,1,、酶产量高；,2,、轻易培养和管理；,3,、产酶稳定性好；,4,、利于分离纯化；,5,、安全可靠、无毒性。,微生物发酵产酶专家讲座,第2页,(1),大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名原核生物。,形态：短杆或长杆状，,0.5,1.01.0,3.0 um,，革兰氏阴性，运动,(,周毛,),或不运动，无芽孢，普通无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。,Escherich,属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病，会引发腹泻和尿路感染。,大肠杆菌名声主要因它易于在试验室操作、生长快速，而且营养要求低。,应用：,大肠杆菌能作为宿主供大量细菌病毒生长繁殖,大肠杆菌也是最早用作,基因工程宿主菌,工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和,制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等,三、常见产酶微生物,微生物发酵产酶专家讲座,第3页,(2),醋酸杆菌（,Acetobacter,）,菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏培养基上生长良好。,应用：有机酸,(,食醋等）葡萄糖异构酶,(,高果糖浆,),山梨糖,(,维,C,中间体）,微生物发酵产酶专家讲座,第4页,(3),枯草芽孢杆菌（,Bacillus subtilis,）,直状、近直状杆菌，周生或侧生鞭毛，,革兰氏阳性，无荚膜，芽孢,0.51.51.8m,，中生或近中生。,枯草芽孢杆菌是工业发酵主要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、,5-,核苷酸酶、一些氨基酸及核苷。,微生物发酵产酶专家讲座,第5页,(4),根霉,(,Rhizopus,),分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。,根霉因有假根（,Rhizoid,）而得名（假根功效是在培养基上固着，并吸收营养）。,分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引发霉腐变质和水果、蔬菜腐烂。,代表种：米根霉（,R.oryzae),黑根霉,(R.nigrican),等。,应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类菌种。在酿酒工业上惯用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸,。,微生物发酵产酶专家讲座,第6页,(5),曲霉,(,Aspergillus,),分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。,分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引发食物、谷物和果蔬霉腐变质，有可产生致癌性黄曲霉毒素。,代表种：黑曲霉,Asp.Niger,、黄曲霉,Asp.flavus,应用：是制酱、酿酒、制醋主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料菌种。,回本节,微生物发酵产酶专家讲座,第7页,第二节、微生物酶开发普通程序,(,一,),样品采集,采样目标、采样地点、采样方法及采样数量。,微生物发酵产酶专家讲座,第8页,微生物酶开发普通程序,(,二,),菌种分离,培养基确实定、培养条件确实定。,微生物发酵产酶专家讲座,第9页,微生物酶开发普通程序,(,三,),菌种初筛,(1),用简单定性反应进行初筛；,(2),在最初分离阶段就给予特殊培养基或培养条件，进而让目标菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目标菌菌株或只将其最适菌株一株纯化分离。,微生物发酵产酶专家讲座,第10页,微生物酶开发普通程序,(,四,),菌种复筛,初筛之后，还要进行复筛。复筛目标是在初筛基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求菌种。复筛。,酶活测定方法建立尤其主要。,微生物发酵产酶专家讲座,第11页,微生物酶开发普通程序,(,五,),对复筛取得菌株要求,(1),不是致病菌；,(2),菌株不易变易和退化；,(3),不易感染噬菌体；,(4),微生物产酶量高；,(5),酶性质符合应用需要，而且最好是胞外酶；,(6),产生酶便于分离和提取，得率高；,(7),微生物培养营养要求低。,微生物发酵产酶专家讲座,第12页,微生物酶开发普通程序,(,六,),最正确产酶条件初步确定,(1),培养方式确实定；,(2),最正确培养条件组合；,(3),微生物产酶特征,(,胞内酶、胞外酶,),；,(4),微生物酶搜集时间次序；,微生物发酵产酶专家讲座,第13页,微生物酶开发普通程序,(,七,),微生物产酶性能深入提升,(1),取得高产菌种突变体；,微生物发酵产酶专家讲座,第14页,微生物酶开发普通程序,(,七,),微生物产酶性能深入提升,(2),利用代谢工程和代谢调整机理来提升微生物酶产量；,微生物发酵产酶专家讲座,第15页,微生物酶开发普通程序,(,七,),微生物产酶性能深入提升,(3),利用遗传工程、基因工程伎俩将原有菌株中目标基因转移到另外一些对生产环境更适应性微生物细胞之内，使其高效表示；,微生物发酵产酶专家讲座,第16页,微生物酶开发普通程序,(,八,),微生物酶提取方法,(1),酶粗提；,(2),酶精制。,微生物发酵产酶专家讲座,第17页,微生物酶开发普通程序,(,九,),微生物产酶菌种保藏,(1),斜面；,(2),沙土管；,(3),冷冻。,微生物发酵产酶专家讲座,第18页,-,淀粉酶筛选,微生物发酵产酶专家讲座,第19页,蛋白酶产生菌取得方法,应用含酪蛋白培养基,微生物发酵产酶专家讲座,第20页,第三节、发酵工艺条件及其控制,1,、培养基,2,、发酵条件及控制,3,、提升产酶办法,Go,Go,Go,下一节,本章,目录,微生物发酵产酶专家讲座,第21页,1,、培养基,培养基：是指人工配制用于细胞培养和发酵各种营养物质混合物。,分类,水分和形态,形状,用途,微生物发酵产酶专家讲座,第22页,各种生物对营养需求,微生物发酵产酶专家讲座,第23页,1,、选择适宜营养物质,2,、营养物浓度及配比适当,3,、物理、化学条件适宜,4,、经济节约,5,、精心设计、试验比较,培养不一样微生物必须采取不一样培养条件；,培养目标不一样，原料选择和配比不一样；,不一样阶段，培养条件也有所差异。,培养基设计标准,微生物发酵产酶专家讲座,第24页,五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作基础,任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素,微生物发酵产酶专家讲座,第25页,组成细胞物质或代谢产物中碳架,碳源可作能源，为生命活动提供能量,惯用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物,异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）,水是微生物最基本组成份（,）,水是微生物体内和体外溶剂（吸收营养成份和代谢废物）,水是细胞质组分，直接参加各种代谢活动,调整细胞温度和保持环境温度稳定（比热高，传热快）,水,碳源,选择适当碳源，以适应目标酶合成调整机制,微生物发酵产酶专家讲座,第26页,组成细胞物质和代谢产物中氮元素,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参加酶组成、组成酶活性基、激活酶活性,维持细胞结构稳定性,调整细胞渗透压,控制细胞氧化还原电位,惯用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素化合物。,氮源,无机盐,需要注意适当碳氮比,微生物发酵产酶专家讲座,第27页,生长因子,生长因子是指一些微生物不能用普通碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少许生长需求有机物质。,分类：,化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成份 等四类,功效：以辅酶与辅基形式参加代谢中酶促反应,试验室中惯用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,微生物发酵产酶专家讲座,第28页,试验室惯用培养基：,细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；,放线菌：高氏,1,号合成培养基培养；,酵母菌：麦芽汁培养基；,霉菌：查氏合成培养基；,比如枯草芽孢杆菌：,普通培养：肉汤培养基或,LB,培养基；,自然转化：基础培养基；,观察芽孢：生孢子培养基；,产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主产酶培养基；,微生物发酵产酶专家讲座,第29页,枯草杆菌,BF7658-,淀粉酶发酵培养基,：玉米粉,8%,，豆饼粉,4%,，磷酸氢二钠,0.8%,，硫酸铵,0.4%,，氯化钙,0.2%,，氯化按,0.15%,（自然,pH,）。,枯草杆菌,AS1.398,中性蛋白酶发酵培养基,：玉米粉,4%,，豆饼粉,3%,，麸皮,3.2%,糠,1%,磷酸氢二钠,0.4%,磷酸二氢钾,0.03%,（自然,pH,）。,黑曲霉糖化酶发酵培养基,：玉米粉,10%,，豆饼粉,4%,，麸皮,1%,（,pH4.4,5.0,）。,地衣芽孢杆菌,2709,碱性蛋白酶发酵培养基,：玉米粉,5.5%,豆饼,4%,磷酸氢二钠,0.4%,磷酸二氢钾,0.03%(pH 8.5),。,黑曲霉,AS 3.350,酸性蛋白酶发酵培养基,:,玉米粉,6%,豆饼粉,4%,玉米浆,0.6%,氯化钙,0.5%,氯化铵,1%,磷酸氢二钠,0.2%(pH 5.5),。,游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基,：糖蜜,2%,，豆饼粉,2%,，磷酸氢二钠,0,。,1%,，硫酸镁,0,。,05%(pH 7.2),。,桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基,：淀粉水解糖,5%,，蛋白胨,0.5%,硫酸镁,0.05%,氯化钙,0.04%,磷酸氢二钠,0.05%,磷酸二氢钾,0.05%(,自然,pH),。,黑曲霉,AS3.396,果胶酶发酵培养基,:,麸皮,5%,果胶,0.3%,硫酸铵,2%,磷酸二氢钾,0.25%,硫酸镁,0.05%,硝酸钠,0.02%,硫酸亚铁,0.001%(,自然,pH),。,枯草杆菌,AS1.398,碱性磷酸酶发酵培养基,:,葡萄糖,0.4%,乳蛋白水解物,0.1%,硫酸铵,1%,氯化钾,0.1%,氯化钙,0.1mmol/L,氯化镁,1.0mmol/L,磷酸氢二钠,20mol/L(,用,pH7.4,Tris-HCl,缓冲液配制,),回本节,微生物发酵产酶专家讲座,第30页,2,、发酵条件及控制,培养基,pH,必须控制在一定范围内，以满足不一样类型微生物生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基,pH,相对恒定，通常在培养基中加入,pH,缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。,通常培养条件：,细菌与放线菌：,pH6.58.0,酵母菌和霉菌：,pH46,范围内生长,pH,值控制,细胞发酵产酶最适,pH,值与生长最适,pH,值往往有所不一样。细胞生产某种酶最适,pH,值通常靠近于该酶催化反应最适,pH,值。,有些细胞能够同时产生若干种酶，在生产过程中，经过控制培养基,pH,值，往往能够改变各种酶之间产量百分比。,普通工艺流程,P46,微生物发酵产酶专家讲座,第31页,pH,对微生物生长繁殖和代谢产物形成影响主要原因：,1,、影响原生质膜性质,2,、影响酶活性,3,、影响营养物质和中间代谢产物解离,微生物发酵产酶专家讲座,第32页,二、影响,pH,值改变原因,1,、基质代谢,（,1,）糖代谢 尤其是快速利用糖，分解成小分子酸、醇，使,pH,下降。糖缺乏，,pH,上升，是补料标志之一,（,2,）氮代谢 当氨基酸中,-NH2,被利用后,pH,会下降；尿素被分解成,NH3,，,pH,上升，,NH3,利用后,pH,下降，当碳源不足时氮源当碳源利用,pH,上升。,（,3,）生理酸碱性物质利用后,pH,会上升或下降,微生物发酵产酶专家讲座,第33页,2,、产物形成,一些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液,pH,改变。如有机酸类产生使,pH,下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使,pH,上升。,3,、菌体自溶，,pH,上升，发酵后期，,pH,上升。,微生物发酵产酶专家讲座,第34页,三、发酵过程,pH,值调整及控制,1,、调整培养基组分,2,、在发酵过程中进行控制,添加,CaCO,3,：,氨水流加法,尿素流加法,3,、经过补料调,pH,4,、当补料与调,pH,发生矛盾时，加酸碱调,pH,微生物发酵产酶专家讲座,第35页,例：配制不一样初始,pH,培养基，摇瓶考查发酵情况,pH,对产海藻酸裂解酶影响,微生物发酵产酶专家讲座,第36页,例子：不一样调,pH,方法影响,分别在,4,种缓冲介质中，于,pH 6,50,一,9,50,测定天冬酰胺酶酶活力,1,甘氨酸介质,pH 8.00,时酶活力最高；,2,硼酸在,pH 8.50,，酶反应最快,3,磷酸在,pH 8.50,，酶反应最快,4 Tris,在,pH 8.50,，酶反应最快,酶活,1,2,4,3,微生物发酵产酶专家讲座,第37页,不一样,pH,控制方式对目标突变株,ISw330,异亮氨酸摇瓶发酵影响，结果如图所表示。,“,1,”,表示只加,CaC0,3,控制,pH,值，,“,2,”,表示只加尿素控制，,“,3,”,表示,CaC0,3,和尿素联合控制,pH,值。,异亮氨酸发酵,微生物发酵产酶专家讲座,第38页,不一样,pH,值对菌体形态影响很大，当,pH,值高于,7,5,时，菌体易于老化，展现球状；当,pH,值低于,6,5,时菌体一样受抑制，易于老化。而在,7,2,左右时，菌体是处于产酸期，展现长椭圆形；在,6,9,左右时，菌体处于生长久，呈,“,八,”,字形状并占有绝正确优势。,微生物发酵产酶专家讲座,第39页,微生物发酵产酶专家讲座,第40页,pH6,9,时，菌体生长旺盛，,pH7.15,时，对菌体产酸有利。所以，在发酵产酸期产酸较高。采取阶段,pH,控制模式进行发酵，在发酵中前期控制,pH6.9,，到,48h,后,pH,值为,7.15,，到,80h,后,pH,值为,7.25,。产率,22.27g,/L,，产酸率提升,12.23,。,微生物发酵产酶专家讲座,第41页,通常在生物学范围内每升高,10,，生长速度就加紧一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,温度控制,有些细胞发酵产酶最适温度与细胞生长最适温度有所不一样，而且往往低于生长最适温度。这是因为在较低温度条件下，能够提升酶所对应,mRNA,稳定性，增加酶生物合成延续时间，从而提升酶产量。,枯草杆菌最适生长温度为,34,37,黑曲霉最适生长温度为,28,32,微生物发酵产酶专家讲座,第42页,溶解氧控制,溶解氧是指溶解在培养基中氧气。,在酶发酵生产过程中，处于不一样生长阶段细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大差异。所以必须依据耗氧量不一样，不停供给适量溶解氧。,培养液中溶解氧量，决定于在一定条件下氧气溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液性质等有亲密关系。普通说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有显著影响。,微生物发酵产酶专家讲座,第43页,调整通气量,调整氧分压,调整气液接触时间,调整气液接触面积,改变培养液性质,控制溶解氧方法,回本节,微生物发酵产酶专家讲座,第44页,3,、提升酶产量办法,1,、添加诱导物,对于诱导酶发酵生产，在发酵过程中某个适宜时机，添加适宜诱导物，能够显著提升酶产量。比如，乳糖诱导,-,半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶生物合成等。,诱导物普通能够分为,3,类（诱导物定义）,酶作用底物,酶催化反应产物,作用底物类似物,微生物发酵产酶专家讲座,第45页,2,、控制阻遏物浓度,阻遏作用依据机理不一样，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。,1.,产物阻遏作用是由酶催化作用产物或者代谢路径末端产物引发阻遏作用。,2.,分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它轻易利用碳源等物质经过分解代谢而产生物质）引发阻遏作用,。,控制阻遏物浓度是解除阻遏、提升酶产量有效办法。,微生物发酵产酶专家讲座,第46页,为了降低或者解除分解代谢物阻遏作用，应该,控制培养基中葡萄糖等轻易利用碳源浓度,。,采取其它较难利用碳源，如淀粉等,采取补料、分次流加碳源,添加一定量环腺苷酸（,cAMP,）,对于受代谢路径末端产物阻遏酶，能够经过,控制末端产物浓度方法使阻遏解除,。,微生物发酵产酶专家讲座,第47页,3,、添加表面活性剂,表面活性剂能够与细胞膜相互作用，增加细胞透过性，有利于胞外酶分泌，从而提升酶产量。,将适量,非离子型表面活性剂,，如,吐温（,Tween,）,、,特里顿,(Triton),等添加到培养基中，能够加速胞外酶分泌，而使酶产量增加。,因为,离子型表面活性剂对细胞有毒害作用,，尤其是季胺型表面活性剂（如,新洁而灭,等）是消毒剂，对细胞毒性较大，不能在酶发酵生产中添加到培养基中。,回本节,微生物发酵产酶专家讲座,第48页,4,、添加产酶促进剂,产酶促进剂是指,能够促进产酶、不过作用机理未说明清楚物质,。比如，添加一定量植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶产量提升,1,20,倍；添加聚乙烯醇（,Polyvinyl alcohol,）能够提升糖化酶产量。产酶促进剂对不一样细胞、不一样酶作用效果各不相同，现在还没有规律可循，,要经过试验确定所添加产酶促进剂种类和浓度,。,微生物发酵产酶专家讲座,第49页,怎样优化培养基？,培养基优化是工业发酵永恒不变主题。！,补充知识：,微生物发酵产酶专家讲座,第50页,试验设计,在工业化发酵生产中，发酵培养基设计是十分主要，因为培养基成份对产物浓度、菌体生长都有主要影响。试验设计方法发展至今可供人们依据试验需要来选择余地也很大。,微生物发酵产酶专家讲座,第51页,单原因法（,One at a time,）,正交试验设计（,Orthogonal design,）,均匀设计,(Uniform design),全因子试验设计,(Full factorial design),部分因子设计,(fractional factorial design),Plackett-Burman,设计（,Plackett-Burman design,）,中心组合设计（,Central composite design,）,BoxBehnken,设计,(,BoxBehnken,design),微生物发酵产酶专家讲座,第52页,最优化技术（试验统计）,响应曲面分析法,改进单纯形优化法,(Modified simplex method),遗传算法,(Genetic algorithm,，,GA),微生物发酵产酶专家讲座,第53页,第三节、酶发酵动力学,1,、酶生物合成模式,2,、酶生产过程中细胞生长动力学,3,、酶生产过程中产酶动力学,Go,Go,Go,本章,目录,微生物发酵产酶专家讲座,第54页,一、研究内容及意义,内容：发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境原因对这些速度影响等。,意义：在酶发酵生产过程中，研究细胞生长动力学和发酵产酶动力学，对于了解酶生物合成模式，发酵工艺条件优化控制，提升酶产率等方面均含有主要意义。,微生物发酵产酶专家讲座,第55页,前题：怎样测定细胞量？,微生物发酵产酶专家讲座,第56页,1,、计数法,浊度计比浊法,测定稀细胞悬液透光量，间接测出细胞,数量生长。,计数器计数法,在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或,霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出,细菌数生长。,微生物发酵产酶专家讲座,第57页,2,、,测定细胞重量,细胞干重称量法,直接测定单位体积培养物细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量。,细胞堆积容积测量法,（离心压缩细胞体积法）,用刻度锥形管测量经离心细胞沉淀物容积，由此间接表示细胞重量。,细胞组成份析法,测定一个大分子细胞组成,(,如蛋白质、,RNA,、,DNA,等,),，间接算出细胞重量。,微生物发酵产酶专家讲座,第58页,营养物消耗分析法,测定培养基中不用于合成代谢产物营,养物（磷酸盐、硫酸盐等）消耗，由此间接表示生长细胞重量。,产物重量分析法,测定培养中间形成二氧化碳，氢，,ATP,等产物，由此间接换算出生长细胞重量。,微生物发酵产酶专家讲座,第59页,二、酶生物合成模式,细胞在一定条件下培养生长，其生长过程普通经历调整期、生长久、平衡期和衰退期等,4,个阶段,经过分析比较细胞生长与酶产生关系,能够把酶生物合成模式分为,4,种类型。即,同时合成型,，,延续合成型,，,中期合成型,和,滞后合成型。,微生物发酵产酶专家讲座,第60页,同时合成型,酶生物合成与细胞生长同时进行一个酶生物合成模式。该类型酶生物合成速度与细胞生长速度紧密联络，又称为,生长偶联型,。,属于该合成型酶，其生物合成伴伴随细胞生长而开始；在细胞进入旺盛生长久时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶合成伴随停顿。,大部分组成酶生物合成属于同时合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。,比如米曲霉在含有单宁或者没食子酸培养基中生长，在单宁或没食子酸诱导作用下，合成单宁酶（,tanase EC3.1.1.20,）。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,总细胞浓度 活细胞浓度,胞外酶浓度 胞内酶浓度,微生物发酵产酶专家讲座,第61页,延续合成型,酶生物合成在细胞生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还能够延续合成一段较长时间。,属于该类型酶能够是组成酶，也能够是诱导酶。比如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源培养基中培养，能够诱导聚半乳糖醛酸酶（,Polygalacturonase,，,EC3.2.1.15,）生物合成。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,以半乳糖醛酸为诱导物,以含有葡萄糖果胶为诱导物,微生物发酵产酶专家讲座,第62页,中期合成型,该类型酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶生物合成也伴随停顿,。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,微生物发酵产酶专家讲座,第63页,比如，枯草杆菌碱性磷酸酶（,Alkaline phophatase,，,EC 3.1.3.1),生物合成模式属于中期合成型。这是因为该酶合成受到其反应产物无机磷酸反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺营养物质，培养基中必须有磷存在。这么，在细胞生长开始阶段,培养基中磷阻遏碱性磷酸酶合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中磷几乎被细胞用完（低于,0.01mmol/L,）以后，该酶才开始大量生成。又因为碱性磷酸酶所对应,mRNA,不稳定，其寿命只有,30 min,左右，所以当细胞进入平衡期后，酶生物合成伴随停顿。,微生物发酵产酶专家讲座,第64页,滞后合成型,这类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为,非生长偶联型,。,许多水解酶生物合成都属于这一类型。,属于滞后合成型酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是,因为受到培养基中存在阻遏物阻遏作用。只有伴随细胞生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。,若培养基中不存在阻遏物，该酶合成能够转为延续合成型。该类型酶所对应,mRNA,稳定性很好，能够在细胞生长进入平衡期后相当长一段时间内，继续进行酶生物合成。,黑曲霉羧基蛋白酶生物合成,放线菌素,D,对产酶影响,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,酶,浓度,U/ml,酶,浓度,U/ml,30,22,不加,加入,不加,加入,微生物发酵产酶专家讲座,第65页,理想酶合成模式,酶所对应,mRNA,稳定性以及培养基中阻遏物存在是影响酶生物合成模式主要原因。,其中，,mRNA,稳定性好，能够在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应酶；,mRNA,稳定性差，就伴随细胞生长进入平衡期而停顿酶生物合成；不受培养基中存在一些物质阻遏，能够伴伴随细胞生长而开始酶合成；受到培养基中一些物质阻遏，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。,回本节,微生物发酵产酶专家讲座,第66页,在酶发酵生产中，为了提升产酶率和缩短发酵周期，,最理想合成模式应是延续合成型,。因为属于延续合成型酶，在发酵过程中没有生长久和产酶期显著差异。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还能够继续合成一段较长时间。,微生物发酵产酶专家讲座,第67页,对于,其它合成模式酶，能够经过基因工程,细胞工程等先进技术,选育得到优良菌株,并经过工艺条件优化控制,使他们生物合成模式愈加靠近于延续合成型,。,微生物发酵产酶专家讲座,第68页,其中对于同时合成型酶，要尽可能提升其对应,mRNA,稳定性，为此适当降低发酵温度是可取办法；,对于滞后合成型酶，要设法降低培养基中阻遏物浓度，尽可能降低甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶生物合成提早开始；,而对于中期合成型酶，则要在提升,mRNA,稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成开始时间提前，并尽可能延迟其生物合成停顿时间。,微生物发酵产酶专家讲座,第69页,三、酶生产过程中细胞生长动力学,细胞在控制一定条件培养基中生长过程中,其生长速度受到细胞内外各种原因影响,改变比较复杂，情况各不相同。,细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境原因对细胞生长速度影响规律。,1950,年，,法国莫诺德,(Monod),首先提出了表述微生物细胞生长动力学方程,。,在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比,假设培养基中只有一个限制性基质，而不存在其它生长限制原因时，,为这种限制性基质浓度函数。,K,S,为莫诺德常数，是指比生长速率到达最大比生长速率二分之一时限制性基质浓度。,微生物发酵产酶专家讲座,第70页,无抑制细胞生长动力学,Monod,方程,当代细胞生长动力学奠基人,Monod,在,1942,年便指出，在培养基中无抑制剂存在情况下，细胞比生长速率与限制性基质浓度关系可用下式表示：,微生物发酵产酶专家讲座,第71页,该方程中 为比生长速率,(s,-1,),；为最大比生长速率,(s,-1,，,min,-1,，,h,-1,),，,S,为限制性基质浓度,(g/L),；,Ks,为饱和常数,(g/L),，其值等于比生长速率为最大比生长速率二分之一时限制性基质浓度。,微生物发酵产酶专家讲座,第72页,Monod,方程是经典均衡生长模型，其基本假设以下：,细胞生长为均衡式生长，所以描述细胞生长唯一变量是细胞浓度；,培养基中只有一个基质是生长限制性基质，而其它组分为过量不影响细胞生长；,细胞生长视为简单单一反应，细胞得率为一常数。,微生物发酵产酶专家讲座,第73页,细胞比生长速率与限制性基质浓度关系,S,微生物发酵产酶专家讲座,第74页,当限制性基质浓度很低时，,S,Ks,时，,=m,，若继续提升基质浓度，细胞生长速率基本不变。此时细胞比生长速率与基质浓度无关，为零级动力学特点。,微生物发酵产酶专家讲座,第76页,将,Monod,方程式变为,为直线方程。,不一样菌种，不一样培养基，,Ks,和 是,不一样。,微生物发酵产酶专家讲座,第77页,Monod,方程即使表述简单，但它不足以完整地说明复杂生化反应过程，而且已发觉它在一些情况下与试验结果不符，所以人们又提出了另外一些方程。,微生物发酵产酶专家讲座,第78页,单基质限制细胞生长动力学模型,微生物发酵产酶专家讲座,第79页,四、产酶动力学,产酶动力学主要研究,细胞产酶速率以及各种环境原因对产酶速率影响规律,。,产酶动力学研究能够从整个发酵系统着眼，研究群体细胞产酶速率及其影响原因，这称为宏观产酶动力学或这称为,非结构动力学,。,也能够从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响原因，这谓之,微观产酶动力学,或称为,结构动力学,。,微生物发酵产酶专家讲座,第80页,微生物发酵产酶专家讲座,第81页,在酶发酵生产中，酶产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶集中表示，宏观产酶动力学研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式相关,普通产酶动力学方程可表示为：,式中,X,细胞浓度,(g/L),细胞比生长速率,(h,-1,),生长偶联比产酶系数,(IU/g),非生长偶联比产酶速率,(IU/(g,h),E,酶浓度,(IU/L),t,时间,(h),微生物发酵产酶专家讲座,第82页,生长偶联型,部分生长偶联型,非生长偶联型,微生物发酵产酶专家讲座,第83页,第四节、固定化微生物细胞发酵产酶,固定化细胞发酵产酶特点；,固定化细胞发酵产酶工艺条件及其控制；,固定化细胞产酶应用；,微生物发酵产酶专家讲座,第84页,一、固定化细胞发酵产酶特点,1.,提升产酶率,细胞经过固定化以后，在一定空间范围内生长繁殖，细胞密度增大，因而使生化反应加速，从而提升酶产率。,微生物发酵产酶专家讲座,第85页,2.,能够重复使用或连续使用较长时间,固定化细胞固定在载体上，不轻易脱落流失，所以固定化细胞能够进行半连续发酵，重复使用屡次。,微生物发酵产酶专家讲座,第86页,3.,基因工程菌质粒稳定，不易丢失,因为有载体保护作用，固定化基因工程菌质粒结构稳定性和分裂稳定性都显著提升。,微生物发酵产酶专家讲座,第87页,4.,发酵稳定性好,细胞经过固定化以后，因为受到载体保护作用，使细胞对温度、,pH,值适应范围增宽；对蛋白酶和酶抑制剂等耐受能力增强，所以能够比较稳定进行发酵生产。,微生物发酵产酶专家讲座,第88页,5.,缩短发酵周期，提升设备利用率,固定化细胞经过预培养、生长好以后，才转入发酵培养基进行发酵产酶，而且能够维持一段较长时间，所以能够缩短发酵周期，提升设备利用率。,微生物发酵产酶专家讲座,第89页,6.,产品轻易分离,固定化细胞不溶于水，发酵完成以后，轻易与发酵液分离，而且发酵液中所含游离细胞极少，有利于产品分离提纯。,7.,适合用于胞外酶等细胞外产物生产,微生物发酵产酶专家讲座,第90页,二,.,固定化细胞发酵产酶工艺条件及控制,固定化细胞预培养,固定化细胞制备好以后，普通要进行预培养，以利于固定在载体上细胞生长繁殖。,溶解氧供给,加大通气量；改变固定化载体；改变培养基组分；,温度控制,培养基组分控制,微生物发酵产酶专家讲座,第91页,壳聚糖酶产生菌筛选及固定化细胞产酶,微生物发酵产酶专家讲座,第92页,第五节,固定化微生物原生质体发酵产酶,1.,定义,固定在载体上，在一定空间范围内进行生命活动原生质体。,问题：怎样制备原生质体？,微生物发酵产酶专家讲座,第93页,一、固定化原生质体特点,1,、变胞内产物为胞外产物,因为解除了细胞壁扩散障碍，能够使原本存在于细胞中胞内酶不停分泌到细胞外。变革了胞内酶生产工艺。,微生物发酵产酶专家讲座,第94页,2,、提升酶产率,因为除去了细胞壁，增加了细胞通透性，有利于氧气和其它营养物质传递和吸收，也有利于胞内物质分泌，能够显著提升产酶率。,微生物发酵产酶专家讲座,第95页,3,、稳定性很好,固定化原生质体因为载体保护作用，含有很好操作稳定性和保留稳定性，能够重复使用或者连续使用较长时间，利于连续化生产。,微生物发酵产酶专家讲座,第96页,4,、易于分离纯化,固定化原生质体易于和发酵液分开，有利于产物分离纯化，提升产品质量。,微生物发酵产酶专家讲座,第97页,二、固定化原生质体发酵产酶工艺条件及其控制,渗透压控制；,防治细胞壁再生；,确保原生质体浓度,微生物发酵产酶专家讲座,第98页,第二章 动植物细胞培养产酶,与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞含有各自不一样特征，需采取各自不一样培养工艺。,微生物发酵产酶专家讲座,第99页,植物、动物、微生物细胞特征比较,细胞种类,植物细胞,微生物细胞,动物细胞,细胞大小,/um,200,300,1,10,10,100,倍增时间,/h,12,0.3-6,15,营养要求,简单,简单,复杂,光照要求,大多数要求,不要求,不要求,对剪切力,敏感,大多数不敏感,非常敏感,主要产物,色素、药品、香精、酶等,醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等,疫苗、激素、单克隆抗体、酶等,微生物发酵产酶专家讲座,第100页,三者之间差异主要有：,植物细胞,动物细胞,微生物细胞。,动物细胞、植物细胞生产周期比微生物长。,植物细胞和微生物细胞营养要求较简单。,植物细胞生长以及次级代谢物生产要求一定光照。,植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。,植物、微生物和动物细胞主要目标产物各不相同。,微生物发酵产酶专家讲座,第101页,一、植物细胞培养产酶,过程,1,、植物外植体中诱导取得植物细胞；,2,、筛选、诱变、原生质体融合或基因重组等伎俩选育得到优良产酶细胞；,3,、人工控制条件反应器中进行细胞培养产酶；,微生物发酵产酶专家讲座,第102页,特点,1,、产率高；,2,、周期短；,3,、产品质量高；,微生物发酵产酶专家讲座,第103页,紫杉醇：二萜类化合物,最早由太平洋红豆杉,Taxus,brevifolia,树皮中分离,广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几个癌症,当前主要起源于红豆杉属植物,实例：利用植物细胞培养技术生产紫杉醇,微生物发酵产酶专家讲座,第104页,市场需求,抗癌一线用药,销售额年增加率,5,亿美元,理论需求量,2g/,人,500,万人,/,年,1000kg/,年,实际销量,350 kg/,年,紫杉醇供需相差十分悬殊,图,1,：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：千克）,图,2,：国际紫杉醇销售额（亿美元）,微生物发酵产酶专家讲座,第105页,理化性质,英文名：,Paclitaxel,Taxol or TM,分子式：,C,47,H,51,NO,4,水溶性：,0.7mg,ml,稳定性：,pH4,8,稳定；,pH 8,易分解；,在特定条件下紫杉醇可被氧化，但极难还原；,微生物发酵产酶专家讲座,第106页,药源问题,红豆杉,主要原料植物,国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种 之一,生长迟缓 分布有限,Taxol,含量低,树皮中,Taxol,含量,:0.00001-0.069%,3000,棵树,=10,吨树皮,=1kg Taxol=500,病人,微生物发酵产酶专家讲座,第107页,人工栽培,采取种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗,寻找红豆衫替换物,从红豆杉非树皮部位提取,产紫杉醇非红豆杉植物,优点：生长周期缩短,简便、直接,缺点：,1,、紫杉醇含量低,生长迟缓,2,、提取工艺复杂,药源问题处理方法（一）,微生物发酵产酶专家讲座,第108页,药源问题处理方法（二）,化学合成,全合成,1994,年取得成功,现有六种路径,半合成,以,10-DAB,和,Baccatin,作为半合成原料取得紫杉醇,新方法用,10-DAT,缺点：,1,、合成过程烦琐复杂，几十步,2,、费用高，化学试剂昂贵,3,、总收率太低（,2%,）,优点：,1,、原料枝叶含量丰富、提取相,对轻易，充分利用再生资源,2,、产率高,3,、最具实用价值能够工业化生产,4,、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造,缺点：合成过程相对复杂,（,11,步化学转化和,7,步分离）,微生物发酵产酶专家讲座,第109页,药源问题处理方法（三）,生物方法,组织和细胞培养,微生物发酵,生物合成,研究阶段,红豆杉生物合成路径基本明确,10,种相关酶基因被克隆表示,利用基因工程伎俩改造红豆杉提升紫杉醇产量,优点：,1,、摆脱自然原因，可长久稳定,生长,2,、适应市场、方便调整,3,、成份简单，有利于分离纯化,4,、成本低、生长周期短