高中生物选修-基因工程的基本操作程序.ppt

补补：原核：原核细细胞的基因胞的基因结结构构非非编码编码区区非非编码编码区区编码编码区区编码编码区上游区上游 编码编码区下游区下游 与与RNARNA聚合聚合酶酶结结合位点合位点启启动动子子终终止子止子 RNA RNA聚合聚合酶酶能能够识别调够识别调控序列中的控序列中的结结合位点，合位点，并与其并与其结结合。合。转录转录开始后，开始后，RNARNA聚合聚合酶酶沿沿DNADNA分子移分子移动动，并，并以以DNADNA分子的一条分子的一条链为链为模板合成模板合成RNARNA。转录转录完完毕毕后，后，RNARNA链释链释放出来，放出来，紧紧接着接着RNARNA聚聚合合酶酶也从也从DNADNA模板模板链链上脱落下来。上脱落下来。1-与与RNARNA聚合聚合酶酶结结合位点合位点A G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GA G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CRNARNARNARNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶RNARNARNARNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶RNARNARNARNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶2-不能不能转录为转录为信使信使RNARNA，不能，不能 编码编码蛋白蛋白质质。：能：能转录转录相相应应的信使的信使RNARNA，能，能 编码编码蛋白蛋白质质 编码编码区区非非编码编码区区原核原核细细胞胞的的 基因基因结结构构有有调调控控遗传遗传信息表达的核信息表达的核 苷酸序列，在苷酸序列，在该该序列中，序列中，最重要的是位于最重要的是位于编码编码区上区上 游的游的RNARNA聚合聚合酶酶结结合位点。合位点。启启动动子子3-真核细胞的基因结构一个典型的真核一个典型的真核细细胞基因胞基因结结构示意构示意图图n n编码编码编码编码区含有区含有区含有区含有n n能能能能够编码够编码够编码够编码蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质的序列的序列的序列的序列(外外外外显显显显子子子子)n n不能不能不能不能编码编码编码编码蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质的插入序列的插入序列的插入序列的插入序列(内含子内含子内含子内含子)n n真核生物的真核生物的真核生物的真核生物的结结结结构基因是断裂基因构基因是断裂基因构基因是断裂基因构基因是断裂基因非非编码编码区区非非编码编码区区编码编码区区与与RNARNA聚合聚合酶酶结结合位点合位点外外显显子子内含子内含子1 12 23 34 45 54-真核真核细细胞胞的的 基基因因结结构构编码编码区区非非编码编码区区外外显显子：能子：能编码编码蛋白蛋白质质的序列的序列内含子：不能内含子：不能编码编码蛋白蛋白质质的序列的序列：有：有调调控作用的核苷酸序列，控作用的核苷酸序列，包括位于包括位于编码编码区上游的区上游的RNARNA 聚合聚合酶酶结结合位点。合位点。非非编码编码序列：序列：包括非包括非编码编码区和内含子区和内含子5-非非编码编码区区非非编码编码区区编码编码区区与与RNARNA聚合聚合酶酶结结合位点合位点外外显显子子内含子内含子1 12 23 34 45 5加加 工工转转 录录mRNAmRNA前体前体成熟成熟mRNAmRNA加加 工工6-原核原核细细胞胞真核真核细细胞胞不同点不同点编码编码区是区是_的的编码编码区是区是间间隔的、隔的、_ _ 的的相同点相同点都由能都由能够编码够编码蛋白蛋白质质的的_和具和具有有调调控作用的控作用的_区区组组成的成的原核原核细细胞与真核胞与真核细细胞的基因胞的基因结结构比构比较较思思考考编码编码相同数目氨基酸的蛋白相同数目氨基酸的蛋白质质，原核，原核细细胞与真核胞与真核细细胞基因胞基因结结构一构一样长吗样长吗？连续连续不不连续连续编码编码区区非非编码编码7-基因工程基本操作的四个步基因工程基本操作的四个步骤骤1 1、目的基因的、目的基因的获获取取2 2、基因表达、基因表达载载体的构建体的构建3 3、将目的基因、将目的基因导导入受体入受体细细胞胞4 4、目的基因的、目的基因的检测检测与与鉴鉴定定8-一、目的基因的一、目的基因的获获取取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码编码蛋白蛋白质质的的结结构基因构基因2 2、获获取目的基因的常用方法有哪些取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）从基因文）从基因文库库中中获获取取（2 2）利用）利用PCRPCR技技术扩术扩增增（3 3）人工合成）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段9-(一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的将含有某种生物不同基因的许许多多DNA片断，片断，导导入到受体菌的群体中，各入到受体菌的群体中，各个受体菌分个受体菌分别别含有含有这这种生物的不同基因，种生物的不同基因，称称为为基因文基因文库库基因文基因文库库 基因基因组组文文库库部分基因文部分基因文库库（如（如:cDNA文文库库）1.1.基因文基因文库库10-基因基因组组文文库库与与部分基部分基因文因文库库的关系的关系11-2.2.基因文基因文库库的构建方法的构建方法鸟枪鸟枪法：法：供体供体细细胞中的胞中的DNADNA许许多多DNADNA片段片段运运载载体体限制限制酶酶与与载载体体连连接接载载入入受体受体细细胞胞产产生特定性状生特定性状导导入入目的基因目的基因分离分离(直接分离法直接分离法)(一一)从基因文从基因文库库中中获获取目的基因取目的基因12-反反转录转录法：法：以目的基因以目的基因转录转录成成的信使的信使RNARNA为为模板，反模板，反转录转录成互成互补补的的单链单链DNADNA，然后在，然后在酶酶的作用下合的作用下合成双成双链链DNADNA，从而，从而获获得得所需的基因。所需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂杂交双交双链链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反反转录转录酶酶核酸核酸酶酶H H2.2.基因文基因文库库的构建方法的构建方法DNADNA聚合聚合酶酶双双链链DNADNA(目的基因目的基因)13-求异思求异思维维 你能推你能推测测出由出由mRNA反反转录转录形成形成cDNA的的过过程大致分程大致分为为哪些步哪些步骤吗骤吗？反反转录转录酶酶既可以利用既可以利用DNA又可以利用又可以利用RNA作作为为模板合成与之互模板合成与之互补补的的DNA链链。像其他。像其他DNA聚合聚合酶酶一一样样，反，反转录转录酶酶也以也以53方向合成方向合成DNAcDNA合成合成过过程是：第一步，反程是：第一步，反转录转录酶酶以以RNA为为模板合成一条与模板合成一条与RNA互互补补的的DNA单链单链，形成，形成RNA-DNA杂杂交分子。第二步，核酸交分子。第二步，核酸酶酶H使使RNA-DNA杂杂交分子中的交分子中的RNA链链降解，使之降解，使之变变成成单链单链的的DNA。第三。第三步，以步，以单链单链DNA为为模板，在模板，在DNA聚合聚合酶酶的作用下合成另一条互的作用下合成另一条互补补的的DNA链链，形成双，形成双链链DNA分子。分子。14-根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：根据已知蛋白根据已知蛋白质质的氨基酸序列，推的氨基酸序列，推测测出相出相应应的信使的信使RNARNA序序列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互补补配配对对原原则则，推，推测测出出它的它的结结构基因的核苷构基因的核苷酸序列，再通酸序列，再通过过化学化学方法，以方法，以单单核苷酸核苷酸为为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白蛋白质质的氨基酸序列的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结结构基因的核苷酸序列构基因的核苷酸序列推推测测推推测测目的基因目的基因化学合成化学合成2.2.基因文基因文库库的构建方法的构建方法15-上述三种目的基因提取的方法有何上述三种目的基因提取的方法有何优优缺点？缺点？优优点点缺点缺点鸟枪鸟枪法法反反转录转录法法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作操作简简便便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有分离出来的有时时并并非一个基因非一个基因专专一性一性强强操作操作过过程麻程麻烦烦，mRNAmRNA很不很不稳稳定，要定，要求的技求的技术术条件条件较较高高专专一性最一性最强强仅仅限于合成核苷酸限于合成核苷酸对较对较少的少的简单简单基因基因思考思考:为为什么要构建基因文什么要构建基因文库库?直接从含有目的基因的生物直接从含有目的基因的生物体内提取不行体内提取不行吗吗?16-(二二)利用利用PCRPCR技技术扩术扩增目的基因增目的基因17-概念：概念：PCRPCR全称全称为为_，是一，是一项项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技的核酸合成技术术 条件：条件：_、_ _、_(_(做启做启动动子子)、_._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式方式扩扩增，即增，即_（n n为扩为扩增循增循 环环的次数）的次数）结结果：果：选选修修1 P1 P6060聚合聚合酶酶链链式反式反应应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一一对对引物引物DNADNA聚合聚合酶酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短使目的基因的片段在短时间时间内成百万倍地内成百万倍地扩扩增增(二二)利用利用PCRPCR技技术扩术扩增目的基因增目的基因18-b、PCR（聚合（聚合酶酶链链式反式反应应）技）技术扩术扩增增由穆里斯等人于由穆里斯等人于1988年年发发明，并于明，并于1993年年获获得若得若贝贝尔尔化学化学奖奖。PCR反反应应的的过过程：（程：（变变性、退火、延伸、多次重复）性、退火、延伸、多次重复）变变性性退火退火延伸延伸结结果：双果：双链链DNA分子数分子数为为2n可可获获取取大大量量目目的的基基因因19-过过程：程：a a、DNADNA变变性性（90-9490-94）：双）：双链链DNADNA模板模板 在在热热作用下，作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性25-6525-65）：系）：系统统温度降低，引温度降低，引 物与物与DNADNA模板模板结结合，形成局部合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，从的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互延伸，合成与模板互补补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双双链链DNADNA链链20-二、基因表达载体的构建寻寻根根问问底底将目的基因直接将目的基因直接导导入受体入受体细细胞不是更胞不是更简简便便吗吗？如果？如果这这么做，么做，结结果会怎果会怎样样？有人采用有人采用总总DNA注射法注射法进进行行遗传转遗传转化，即将一个生物中的化，即将一个生物中的总总DNA提提取出来，通取出来，通过过注射或花粉管通道法注射或花粉管通道法导导入受体植物，没有入受体植物，没有进进行表达行表达载载体的构建，体的构建，这这种方法种方法针对针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导导入了受体植物入了受体植物,不好不好检测检测与与筛选筛选,同同时时也无法增也无法增强强目的基因的表达目的基因的表达水平水平,也不能确定目的基因也不能确定目的基因产产物的存在部位。物的存在部位。构建基因表达构建基因表达载载体的目的体的目的a、使目的基因在受体、使目的基因在受体细细胞中胞中稳稳定定遗传遗传的的b、使目的基因复制并、使目的基因复制并遗传给遗传给下一代下一代c、同、同时时使目的基因能表达和使目的基因能表达和发挥发挥作用。作用。21-1.1.用一定的用一定的_切割切割 质质粒，使其出粒，使其出现现一个切一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其的基因，使其产产生生_ _ _。(二二)基因表达基因表达载载体的构建体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入将切下的目的基因片段插入质质粒的粒的_ _处处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重，形成了一个重组组 DNA DNA分子（重分子（重组质组质粒）粒）限制限制酶酶黏性末端黏性末端同一种限制同一种限制酶酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连连接接酶酶相同相同22-质质粒粒DNADNA分子分子限制限制酶酶处处理理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获获得目的基因得目的基因DNADNA连连接接酶酶重重组组DNADNA分子（重分子（重组质组质粒）粒）核心核心同一种同一种(二二)基因表达基因表达载载体的构建体的构建4.4.过过程程:23-5.5.基因表达基因表达载载体的体的组组成：成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启启动动子子+终终止子止子+标记标记基因基因它它们们有什么作用？有什么作用？24-(三三)将目的基因将目的基因导导入受体入受体细细胞胞转转化化 方法方法将目的基因将目的基因导导入入植物植物细细胞胞将目的基因将目的基因导导入入动动物物细细胞胞将目的基因将目的基因导导入入微生物微生物细细胞胞农农杆菌杆菌转转化法化法基因基因枪枪法法花粉管通道法花粉管通道法显显微注射法微注射法感受感受态细态细胞胞目的基因目的基因进进入入_内，并且在内，并且在 受体受体细细胞内胞内维维持持_和和_的的过过程程受体受体细细胞胞稳稳定定表达表达阅读阅读掌握（掌握（P12-13）25-根据根据农农杆菌可将目的基因杆菌可将目的基因导导入双子叶植物的机理，你能入双子叶植物的机理，你能分析出分析出农农杆菌不能将目的基因杆菌不能将目的基因导导入入单单子叶植物的原因子叶植物的原因吗吗？若想将一个抗病基因若想将一个抗病基因导导入入单单子叶植物，如小麦，从理子叶植物，如小麦，从理论论上上说说，你，你应该应该如何做？如何做？原因原因：研究：研究证证明，主要酚明，主要酚类诱导类诱导物物为为乙乙酰酰丁香丁香酮酮和和羧羧基乙基乙酰酰丁香丁香酮酮，这这些物些物质质主要在双子叶植物主要在双子叶植物细细胞壁中合成，通常不存在于胞壁中合成，通常不存在于单单子叶植物中，子叶植物中，这这也是也是单单子叶植物不易被根瘤子叶植物不易被根瘤农农杆菌侵染的原因。杆菌侵染的原因。如果想将一个抗病毒基因如果想将一个抗病毒基因转转入小麦，也可以用入小麦，也可以用农农杆菌，但要注意两杆菌，但要注意两点：点：要要选择选择合适的合适的农农杆菌菌株，因杆菌菌株，因为为不是所有的不是所有的农农杆菌菌株都可杆菌菌株都可以侵染以侵染单单子叶植物；子叶植物；要加要加趋趋化和化和诱导诱导的物的物质质，一般，一般为为乙乙酰酰丁香丁香酮酮等，目的是使等，目的是使农农杆菌向植物杆菌向植物组织组织的受的受伤伤部位靠部位靠拢拢（趋趋化性）和激活化性）和激活农农杆菌的杆菌的Vir区（区（诱导诱导）的基因，使）的基因，使T-DNA转转移并插入到染色体移并插入到染色体DNA上。上。26-(四四)目的基因的目的基因的检测检测与与鉴鉴定定检查检查是否成功是否成功检测检测鉴鉴定定检测转检测转基因生物染色体的基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测检测目的基因是否目的基因是否转录转录出了出了mRNAmRNA检测检测目的基因是否翻目的基因是否翻译译成蛋白成蛋白质质抗虫抗虫鉴鉴定、抗病定、抗病鉴鉴定、活性定、活性鉴鉴定等定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子分子杂杂交交分子分子杂杂交交（注意与上不同之（注意与上不同之处处）抗原抗体抗原抗体杂杂交交27-28-四、目的基因的四、目的基因的检测检测和和鉴鉴定定 细细菌的菌的检测检测，将每个受体，将每个受体细细胞胞单单独培养形成独培养形成菌落，菌落，检测检测菌落中是否有目的基因的表达菌落中是否有目的基因的表达产产物。物。淘汰无表达淘汰无表达产产物的菌落，保留有表达物的菌落，保留有表达产产物的物的进进一一步培养、研究。步培养、研究。无表达无表达产产物物无表达无表达产产物物有表达有表达产产物物无表达无表达产产物物29-四、目的基因的四、目的基因的检测检测和和鉴鉴定定vv多多多多细细细细胞生物的胞生物的胞生物的胞生物的检测检测检测检测，将每个受体，将每个受体，将每个受体，将每个受体细细细细胞胞胞胞单单单单独培养并独培养并独培养并独培养并诱诱诱诱导发导发导发导发育成完整个体，育成完整个体，育成完整个体，育成完整个体，检测这检测这检测这检测这些个体是否些个体是否些个体是否些个体是否摄摄摄摄入目的基入目的基入目的基入目的基因，因，因，因，摄摄摄摄入的基因是否表达（是否表入的基因是否表达（是否表入的基因是否表达（是否表入的基因是否表达（是否表现现现现出相出相出相出相应应应应的性状）的性状）的性状）的性状）。淘汰无。淘汰无。淘汰无。淘汰无变变变变化的个体，保留有相化的个体，保留有相化的个体，保留有相化的个体，保留有相应变应变应变应变化的个体化的个体化的个体化的个体进进进进一一一一步培养、研究。步培养、研究。步培养、研究。步培养、研究。例：用棉例：用棉铃饲铃饲喂棉喂棉铃铃虫，如虫吃后不出虫，如虫吃后不出现现中毒中毒症状，症状，说说明未明未摄摄入目的基入目的基因或因或摄摄入目的基因未表达。入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，如虫吃后中毒死亡，则说则说明明摄摄入了抗虫基因并得到入了抗虫基因并得到表达。表达。（从个体水平（从个体水平鉴鉴定）定）30-1）以下）以下说说法正确的是法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质质粒是基因工程中唯一的运粒是基因工程中唯一的运载载体体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制个限制酶酶切点，以便与外源基因切点，以便与外源基因连连接接 D、基因控制的性状都能在后代表、基因控制的性状都能在后代表现现出来出来C C练习练习31-2）有关基因工程的叙述中，）有关基因工程的叙述中，错误错误的是（的是（）A、DNA连连接接酶酶将黏性末端的碱基将黏性末端的碱基对连对连接起来接起来 B、限制性内切限制性内切酶酶用于目的基因的用于目的基因的获获得得 C、目的基因、目的基因须须由运由运载载体体导导入受体入受体细细胞胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切人工合成目的基因不用限制性内切酶酶A A练习练习32-3）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述正正确确的的是是 （）A、限制、限制酶酶只在只在获获得目的基因得目的基因时时才用才用 B、重、重组质组质粒的形成在粒的形成在细细胞内完成胞内完成 C、质质粒都可作粒都可作为为运运载载体体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资资料料D D练习练习33-思考与探究思考与探究1.作作为为基因工程表达基因工程表达载载体，只需含有目的基因就可以完成任体，只需含有目的基因就可以完成任务吗务吗？为为什么？什么？不可以。因不可以。因为为目的基因在表达目的基因在表达载载体中得到表达并体中得到表达并发挥发挥作用，作用，还还需要需要有其他控制元件，如启有其他控制元件，如启动动子、子、终终止子和止子和标记标记基因等。必基因等。必须须构建上述构建上述元件的主要理由是：元件的主要理由是：（1）生物之生物之间进间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动动子才能比子才能比较较有利于基因的表达；有利于基因的表达；（2）通通过过cDNA文文库获库获得的目的基因没有启得的目的基因没有启动动子，只将子，只将编码编码序列序列导导入受体生物中无法入受体生物中无法转录转录；（3）目的基因是否目的基因是否导导入受体生物中需要有入受体生物中需要有筛选标记筛选标记；（4）为为了增了增强强目的基因的表达水平，往往目的基因的表达水平，往往还还要增加一些其他要增加一些其他调调控元件，控元件，如增如增强强子等；子等；（5）有有时时需要确定目的基因表达的需要确定目的基因表达的产产物存在于物存在于细细胞的什么部位，胞的什么部位，往往要加上可以往往要加上可以标识标识存在部位的基因，如存在部位的基因，如绿绿色色荧荧光蛋白基因等光蛋白基因等 34-