植物生理生化实验.doc

实验一 植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法 P199
原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称紫。其吸收峰在570，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。
①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成2、3与醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。
②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮与一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：
分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入5醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无氨蒸馏水稀释至100。用干燥滤纸过滤到三角瓶中。如下操作
试管编号
试剂
空白1
样品1（未萌发）
样品2（萌发）
2
3
4
5
样品提取液
0
2
2
2
2
无氨蒸馏水
2.0
0
0
0
0
0.1抗坏血酸
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
水合茚三酮
3
3
3
3
3
570值
0
0.130
0.123
0.188
0.168
每管含氮量
0
1.26
1.19
1．83
1.83
置于沸水中加热15，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20，在570波长下测定吸光度。
样品氨基态含氮量（100g鲜重） *100 ； (0.103) ； 100/2 ； 1 ； 1

注意事项：
1. 测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水；
2. 样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；
3. 抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；
4. 水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃，15后取出迅速冷却，再加入60%乙醇；
5. 稀释后要迅速比色；
6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量；
7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。最适为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液与醋酸缓与后的。

思考题：
1. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？
不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。
2. 测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？
可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理与逆境状态与植物的营养、施肥指标等。
3. 植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用10%乙酸出去蛋白质的原理是什么？
因为植物组织中除了游离氨基酸外还有蛋白质，蛋白质会影响实验结果。
10%乙酸会使蛋白质变性产生沉淀而被过滤除去。
4. 抗坏血酸在测定中的作用是什么？
作用是保护还原型茚三酮，防治其被氧化。
722S型分光光度计使用：①空白，开启，透射比0%，关上，100%。②吸光度模式
实验二 植物组织可溶性蛋白质含量测定—酚试剂法 P188
原理：酚试剂法，结合了双缩脲试剂与酚试剂与蛋白质的反应。
①碱性：蛋白质肽键与铜生成紫红色蛋白质-铜络合物。
②络合物与蛋白质中氨基酸与苯丙氨酸等芳香族氨基酸的残基使试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂）还原，产生磷钼蓝与磷钨蓝的深蓝色混合物质。
在一定条件下，颜色深浅与蛋白质含量成正相关，其吸收峰在650，因此可用分光光度法测定其含量。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：
分别取0.5g萌发、未萌发水稻于研钵中+2蒸馏水+石英砂，充分研磨，+3蒸馏水，定容25，放置15，过滤取上清液备用。如下操作
编号
1
2
3
4
5
6
未萌发
萌发
牛血清蛋白250
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
酶0.5
酶0.5
蒸馏水
1．0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.5
0.5
试剂甲
5
摇匀→室温下放置10
试剂乙
0.5
迅速摇匀→室温放置30
650值
0.000
0.112
0.154
0.255
0.474
0.551
0.167
0.237
蛋白质含量
0
50
100
150
200
250
71.8
104.8
样品蛋白质含量（鲜重）*1000 ；25；0.5； =0.5

注意事项：
1. 酚试剂只有在酸性条件下才稳定；
2. 试剂甲、试剂乙加入后需要迅速摇匀；
3. 反应最适温度在25-30℃；
4. 样品中若含有酚类、柠檬酸与巯基类化合物均会产生干扰。

思考题：
1. 请介绍几种常用的可溶性蛋白质测定方法，并比较其优缺点。
①酚试剂法 优点：灵敏度大、操作简单 缺点：试剂难配置，易受柠檬酸等化合物干扰
②考马斯亮蓝250法 优点：灵敏度大、操作简单 缺点：易造成二次污染
③紫外分光光度法 优点：节约样品、操作简单 缺点：准确度差

2. 测定植物体可溶性蛋白含量有什么意义与用途？试举例说明。
可以测定植物的代谢水平、食品中的营养指标。

3. 酚试剂法测定可溶性蛋白的原理是什么？测定中应注意什么问题？
原理。。。
测定时要注意最适温度为25-30℃，酚试剂只有在酸性条件下才稳定，并会受到柠檬酸等化合物的干扰。

实验三 植物组织含量测定—滴定法 P268
原理：具有很强的还原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。当用蓝色碱性2,6-二氯酚靛酚溶液滴定含有抗坏血酸的草酸溶液时，其中的抗坏血酸可以将2,6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型。但当溶液中的抗坏血酸完全被氧化之后，则再滴加2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈红色，借此可指示滴定终点。根据滴定消耗的2,6-二氯酚靛酚溶液的量，可计算出被测样品中抗坏血酸的含量。

材料：白萝卜

操作步骤：5g白萝卜于研钵中，加入少量2%草酸与石英砂，快速研磨成匀浆，用2%草酸洗入100容量瓶中并定容，过滤，滤液备用。以2,6-二氯酚靛酚溶液滴定呈粉红色，并在15s内不褪色为终点。
试剂
1空白
2染料标定
3染料标定
4样品
5样品
2%草酸
10
0
0
0
0
标准(20)
0
10
10
0
0
样品提取液
0
0
0
10
10
2,6-二氯酚靛酚燃料滴定
0.15 Y1
2.78V1
2.75V1
0.98Y0
1.02Y0
样品含量（100g鲜重）=（1） * *100 ； 10*2011 *10-3
100 ； 10 ；5

注意事项：
1. 很容易被还原，研磨要快速，滴定也应控制在2以内；
2. 2,6-二氯酚靛酚很不稳定，每次实验时需重新测定浓度；
3. 若样品溶液有较多泡沫，可适当加丁醇

思考题：
1. 为什么在测定的同时要进行2,6-二氯酚靛酚溶液的标定？
2,6-二氯酚靛酚溶液很不稳定。
2. 为了保证抗坏血酸含量准确测定，操作过程应注意些什么？
很容易被还原，需要快速研磨、快速匀浆、快速滴定，并要避免阳光直射，避免用铜、铁器具接触白萝卜。并用2%草酸抑制酶活性，避免分解。

实验四 植物硝酸还原酶活性的测定—活体法 P126
原理：催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生产红色偶氮化合物。在540有最大吸收峰，可用分光光度法测定。活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

材料：甘薯叶片

操作步骤：取2张不同的甘薯叶片，洗净后吸干水分，打孔后混匀，迅速取0.3-0.4g样品3份于三角瓶中。

1（对照）
2（样品1）
3（样品2）
30%三氯乙酸
1
0
0
3（磷酸缓冲液）
9
9
9
真空干燥箱抽气10→叶片下沉
恒温培养箱30℃暗处30→酶促反应
30%三氯乙酸
0
1
1
540值
0
0.031
0.030
3份各取1于试管+2 1%磺胺+2 0.02%萘基乙烯胺，摇匀，显色15，以1号管作参比，在540下比色。
样品中硝酸还原酶活性[()鲜重]=（）
值 0.307；1；10；0.32；0.5h

注意事项：
1. 硝酸还原酶易失活，操作应迅速；
2. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防止亚硝酸盐还原为氨，并严格控制反应时间；
3. 从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。
4. 取样宜在晴天进行，最好提前一天施用一定量的硝态氮肥，取样部位要一致。

思考题：
1. 测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用一定量的硝态氮肥，并且取样应在晴天进行？
硝态氮肥即硝酸盐，硝酸还原酶是诱导酶，硝酸盐诱导硝酸还原酶的合成，为实验提供足量的酶。
晴天植物进行光合作用，积累足够的与碳水化合物（能量）提供反应。

2. 测定硝酸还原酶活性的离体法与活体法各有何特点？
活体法：步骤简单，适合快速、多组测定。本实验不需外加。但重复性不好，受生物本身性质影响。
离体法：步骤复杂，但重复性较好，反应条件受人为控制。研磨易使酶失活，在空气中易被破坏，要外加。

3. 酶的诱导为什么要在暗处进行？
亚硝酸盐在光照下易分解，叶绿素光合作用产生的一些辅酶会加快亚硝酸盐分解。

实验五 淀粉酶活性的测定 P174
原理：淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α-淀粉酶、β-淀粉酶。α-淀粉酶不耐酸，在3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃保温15则被钝化。
本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α+β）比较，即可求出β-淀粉酶的活力。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

操作步骤：各取1g种子，低温置于研钵中+少量石英砂+2蒸馏水，研磨成匀浆，过滤后于100容量瓶，用蒸馏水定容，即为淀粉酶原液（酶液1）。取原液10于50容量瓶，用蒸馏水定容，即为淀粉酶稀释液（酶液2）。如下操作

1-1
1-2
2-1
2-2
酶液1
1
1
0
0
钝化β-淀粉酶
置70℃水浴中15，取出后在流水中冷却
酶液2
0
0
1
1
3,5-二硝基水杨酸
2
0
2
0
预保温
40℃恒温水浴中保温10
1%淀粉溶液 40℃
1
1
1
1
保温
40℃恒温水浴中保温5（酶促反应）
3,5-二硝基水杨酸
0
2
0
2
摇匀，置沸水浴10，取出后冷却，加蒸馏水至20。在540波长下比色。

试管编号

项目
测定α-淀粉酶
测定（α+β）-淀粉酶
参
比
管
未萌发
萌发
未萌发
萌发
A对
A测
B对
B测
C对
C测
D对
D测
540值
0.188
0.166
0.207
0.255
0.103
0.107
0.108
0.160
0
α-淀粉酶活力[麦芽糖()鲜重] ； 测对/0.2273
（α+β）-淀粉酶总活力[麦芽糖()鲜重] ；100；1；2；5；5

注意事项：
1. 要在低温下研磨，以免研磨产生的热破坏酶；
2. 水浴温度要严格控制，水浴、显色时间要严格控制；
3. 水浴锅内水位要高于试管水位。

思考题：
1. 本实验在测定α-淀粉酶活性及（α+β）-淀粉酶总活性的过程中，1号试管与2号试管有什么不同？为什么每一组都要设置对照管？
1号管与2号管所加入的3,5-二硝基水杨酸的顺序不同，3,5-二硝基水杨酸的作用是终止酶促反应；
每一组都设置对照组是为了排除种子本身所含淀粉酶对实验的干扰。
2. 测定淀粉酶活性时，为什么要用5.6的柠檬酸缓冲液来配置1%淀粉溶液？为什么1%淀粉溶液要在40℃进行保温？
为了让反应在最适下进行；
为了让反应在最适温度中进行。
实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶—垂直板法 P180
原理：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺与交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度与交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效应与分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小与形状的差异，在电泳时会产生不同的泳动速率而相互分离。利用特异性的显色反应使待测酶蛋白染色后，就可在凝胶中呈现电泳酶谱。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内许多生理代谢过程受其同工酶的种类及活性的调节。利用过氧化物酶催化H2O2分解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物同工酶酶谱。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

操作步骤：安装→制分离胶（分离胶缓冲液8.9 3、分离胶贮液6、H2O 2、过硫酸铵溶液12）→灌注（胶面加0.5水层，静置20至水层底下有一清晰界面，倒去水层用滤纸吸干）→制浓缩胶（浓缩胶缓冲液6.7 0.5、浓缩胶贮备液1、H2O 1、过硫酸铵溶液2）→灌注（用水封液面，放样品梳，静置10，凝固后取出样品梳，用滤纸吸水）→上样（离心后1样品提取液+20%蔗糖至胶的凹槽）→电泳（电极上、下加电极缓冲液，上槽1滴溴酚蓝，恒压100-120V、120-140V，当溴酚蓝达距管底0.5处时切断电源）→剥胶→染色（0.5联苯胺母液+9.3H20.232O2，混匀倒入盛凝胶的培养皿，10后用水冲洗）

注意事项：
1. 玻璃要干燥并夹好；
2. 凝胶配置好要马上灌胶，过硫酸铵要现配现用，染料要现配现用；
3. 针头推出胶液时，针头慢慢向上移动，直至刻度线处；
4. 附着在研钵壁上的研磨样品要洗下并全部转入离心管；
5. 电极缓冲液慢慢加入每支试管直至浸没顶部为止；
6. 电泳时要控制电流，不可超过170V；
7. 剥胶时，长针头注射器吸满水，将针头沿管壁插入，同时慢慢将注射器中的溶液推出，并不断转动凝胶管。

思考题：
1. 简述试验中过硫酸铵、四甲基乙二胺、蔗糖、溴酚蓝、H2O2等试剂的作用？
过硫酸铵：催化剂，提供过硫酸铵自由基；
四甲基乙二胺：加速剂，加速过硫酸铵形成自由基；
蔗糖：粘性好，不易扩散，能使样品在样品槽里不易散开；
溴酚蓝：指示剂，电泳时比蛋白质快，从而得知反应进行的程度；
H2O2：过氧化同工酶底物。

2. 试比较垂直板型与圆盘凝胶电泳的优缺点。
垂直板型凝胶电泳法： 优点：可同时点样，使结果直观化。 缺点：易漏胶，使实验失败。
圆盘式凝胶电泳法： 优点：不易漏胶。 缺点：不能同时点样，染色后不易比较结果。

实验一 植物抗逆性的测定—电导仪法 P282
原理：植物细胞膜对维持细胞的微环境与正常的代谢起着重要作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物收到逆境影响时，如高温或低温、干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以至于植物细胞浸液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。这样，比较不同作物或同一作物不同品种在相同胁迫温度下膜透性的增大程度，即可比较作物间或品种间的抗逆性强弱，因此，电导法目前已成为作物抗逆性栽培、育种上鉴定植物抗逆性强弱的一个精确而实用的方法。

材料：桂花叶片（正常、高温50℃/低温-20℃）

操作步骤：将玻璃仪器及桂花叶片用去离子水洗净、擦干。分别给叶片打孔，每种叶片打30个小叶片，每种分2组。如下操作

空白
正常叶
低温
高温
叶片

15
15
15
15
15
15
去离子水
15
15
15
15
15
15
15
真空抽气
抽气10，叶片下沉
水分交换
室温静置20，摇晃
测初电导值
6.7
1=9.5
2=8.7
1=30.1
2=30.4
1=16.9
2=14.4
杀死细胞
沸水浴煮10，冷却至室温
测终电导值
’=8.8
1’36
2’33.9
1’62.2
2’59.2
1’56.8
2’53.4
相对电导度

0.092
0.454
0.193
伤害率

39.9%
11.1%
①正常叶片相对电导率’’
②处理叶片相对电导率’’
膜伤害率=②-①/1-① *100%

注意事项：
1. 整个过程中，去离子水要使用同一洗瓶中的，减少误差；
2. 全部器皿要用去离子水洗净，洗净后的叶片接触的用具必须绝对洁净，也不能用手直接触碰；
3. 电导率的测定要在同一温度下，每次测定前要用去离子水清洗并用吸水纸吸干电极；
4. 使用电导仪时量程调至199.9，若起始不为零，需要机械调零。

思考题：
1. 植物抗逆性与细胞膜透性有何关系？
在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。

2. 为什么要用真空抽气？为什么要充分振荡？
真空抽气使细胞间隙中的电解质与外界水分交换，使得细胞内、外电解质平衡。此时，测定溶液电导度即是测定植物细胞内的电导度。
充分振荡使附在叶片或附近的电解质能充分溶解在水中，减少误差。

实验二 植物组织水势的测定小液流法 P109
原理：将植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，当找到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。因溶液的浓度是已知的，可根据公式算出其渗透压，取其负值，为溶液的渗透势（φπ），即代表植物的水势（φW）。φφπ

材料：灰莉叶片

操作步骤：取叶片打小圆片50片，如下操作
编号
1
2
3
4
5
6
蔗糖溶液
0.5
1
2
3
4
5
蒸馏水
9.5
9
8
7
6
5
溶液浓度
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
液滴移动方向
↓
↓
↑
↑
↑
↑
0.1+0.2/2 ；φφπ

注意事项：
1. 叶片打孔要在同一部位，并避免主脉；
2. 玻璃仪器要干燥洁净；
3. 小叶片与溶液要混合均匀；
4. 甲烯蓝不能加太多；
5. 蔗糖溶液用前要摇匀；
6. 叶片打完孔，立即放入青霉素瓶并加入蔗糖；
7. 最后毛细管放液滴时要缓慢。

思考题：
1. 试述小液流法测定植物组织水势的原理？
讲植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，如果植物组织的水势小于某一溶液的水势，则组织吸水，反之失水。当到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。由于溶液浓度已知，可根据公式算出其渗透压，取负值即代表植物的水势。

2. 小液流法测定植物组织水势时为什么操作时，应强调所用试管、毛细管应保持干燥？打取小圆片并投入到试管中时动作应迅速？加入甲烯蓝不能太多？
所用仪器若不干燥，其所含水分会影响所配溶液浓度并对实验结果造成误差；
所打小圆片要迅速投入试剂中，为的是避免小圆片失水，造成误差；
甲烯蓝若加太多，会使叶片组织水势低于该蔗糖溶液的渗透势，造成误差。

实验三 植物的无土培养与缺素症状
原理：用植物必需的矿质元素配成营养液培养植物，可使植物长得与土壤中一样好。应用此法，所用元素的种类与用量可完全人为地加以控制。要了解某元素缺乏所引起的生理病症，可从营养液中减去该元素，以便在以后的生长过程中进行观察，观察缺素症后将所缺元素加入营养液中，缺素症状又可逐消失。
这类实验，通常用溶液培养，为了管理方便，也常将溶液加入洁净的石英砂培养植物，则称为砂基培养。

材料：玉米种子

操作步骤：选4株玉米苗，分成2组，用蒸馏水将根部洗净并去胚乳。分别放入2个700培养罐中（一个加入完全培养液与蒸馏水，另一个加入缺素培养液与蒸馏水，并离罐顶1处），在茎基部用棉花固定。放于阳光充足的地方培养，并每周更换溶液，培养三周。

完全：茎粗，叶绿色、大而厚，无坏死斑点、焦枯，个别叶尖端焦枯是早期有些烧苗。根系发达。
缺N：植株矮小，茎秆柔弱，叶发黄、薄，老叶现象明显（叶中N转移至新叶），叶片分支少，茎秆、叶片出现紫红色（碳水化合物的合成与氨基酸的合成是同步进行的，缺N让碳水化合物过多的积累，生成了花青素）。根系不发达。
缺P：植株矮小，叶暗绿，老叶现象明显，叶片分支少，叶、茎紫红色明显并有些发黑。根系变黄且少。
缺K（调节水势、渗透势，与抗逆性有关酶的激活剂）：茎秆易倒伏，叶片下垂、杯状弯曲，老叶现象明显，叶尖、叶缘出现焦枯。根系不发达。
缺（细胞壁主要成分果胶酸钙的组成元素）：新叶、顶芽钩状坏死，甚至植株死亡。老叶边缘裂、卷皱。根系变黄且少。
缺（合成叶绿素有关，酶的激活剂）：叶片黄化，有锈迹坏死斑点，老叶明显，叶缘紫红色。根系黄且少。
缺（叶绿素构造形成有关，参与电子传递链）：植株生长受抑制，新叶黄色且发白。根系非常不发达。

注意事项：
1. 实验过程中要保护根系，一开始要洗净并去胚乳；
2. 调整水培液值，严防试剂污染与混杂；
3. 刚移栽的植株不宜直接放在阳光下；
4. 溶液培养时要用不透明容器；
5. 要经常通气、补水并更换营养液。

思考题：
1.为什么说无土培养是研究矿质营养的重要方法?
用植物必须的矿质元素配成营养液培养植物，可使植物长得与土壤中一样好。用此方法，所用元素的种类与用量可完全认为的加以控制。若要了解某元素缺乏所引起的生理病症，可从营养液中减去该元素。

2.进行溶液培养或砂基培养有时会失败，主要原因何在?
原因有植株根系被破坏、试剂污染、不通气、缺水、营养液没有定期更换。

3.为什么植物缺素病症有的出现在顶端幼嫩枝叶上，有的却出现在下部老叶上，请举例加以说明。
是细胞壁主要成分果胶酸钙的组成元素，且在植株内部可转移，因此，缺植株呈新叶、顶芽钩状坏死。
N则是构成蛋白质、核酸等物质的重要元素，并参与生物体内许多的重要反应，N在植株内可以转移，多从较老部位转移至幼嫩部位，因此，缺N植株呈现老叶先衰。P、也有同样的现象。
实验四 植物根系活力的测定—法 118
原理：氯化三苯基四氮唑（）是标准氧化电位为80的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生产红色而不溶于水的三苯甲腙（），并在485处有最大吸收峰。
生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以被广泛用作酶实验的H受体，植物根系中脱氢酶所引起的被还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。

材料：玉米根系（正常、缺）

操作步骤：把根洗净并吸干水分，取根尖1处剪下，分别取0.2g于研钵中+2-3乙酸乙酯+少量石英砂研磨，取上清液于试管中，用乙酸乙酯定容10、摇匀。如下操作

完全对照
完全处理
缺素对照
缺素处理
根鲜重
0.2
0.2
0.15
0.15
1 H24
1

1

0.4
5
5
5
5
保温
暗处37℃，45
1 H24

1

1
485值
0
0.456
0
0.258
在485波长下测值。
单位质量鲜根的四氮唑还原强度[()鲜重]； 值/0.952 ； 0.2；0.75h

注意事项：
1. 为无色或淡黄色溶液，见光易变性、分解，因此要现配现用；
2. 研磨时要少量多次，直至残渣无色为止；
3. 定容后若溶液浑浊，要重新过滤；
4. 保温要在暗处进行，因为见光易分解；
5. H24的量要准确，确保鲜根被灭活。

思考题：
1. 为什么要测定根系活力？植物的跟与地上部分有何关系？
跟是植物吸收水分、无机盐的部位，也是含有氨基酸、激素供地上部分的部位，根系活力就是脱氢酶的活力，测定根系活力可了解到植株的营养状况。

2. 测根系活力最好选择根系哪个部位？为什么？
最后选择根尖1内，因为此处为分生区，是根吸收水与无机盐的部位。以外的部分为成熟区，已失去大部分的能力。

3. 比较缺素与完全根系活力的差异，并解释原因。
缺根系活力明显低于完全培养液培养的植株的根系活力。因为是细胞壁重要组成元素，细胞壁支持与保护细胞，并与细胞生长密切相关，因此缺会使细胞生长受影响甚至死亡，所以缺的根系活力较低。

实验五 叶绿素含量测定 P134
原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
如果溶液中友树种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总与。欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b与类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
A66512 ； 13.95A665-6.88A649
A64921 ； 24.96A649-7.32A665
＝＋
（1000A470-2.05114）/245

材料：玉米叶片（完全、缺）

操作步骤：取鲜叶剪碎、混匀。各取0.1g分成2组，放入研钵中研磨成匀浆，加入95%乙醇10，继续研磨，静置3-5。将液体过滤至25棕色容量瓶中。定容，摇匀。
以95%乙醇为空白，在波长665、649、470下测定吸光度。
处理

光密度
叶绿素含量

类胡萝卜素

649
665
470

完全
0.341
0.817
0.751
2.263
0.633
2.896
3.576
0.453
缺
0.346
0.608
0.575
1.534
0.915
2.449
1.677
0.148
叶绿体色素含量（鲜重）*1000 ；0.025 ；W*1000=0.1

注意事项：
1. 剪碎叶子时要去中脉；
2. 加入3要少量；
3. 过滤后再用少量95%乙醇冲洗研钵及残渣数次，最后连残渣一起倒入漏斗；残渣、滤纸要充分洗脱；
4. 研磨要到绿色褪去、组织变白为止；
5. 比色液不能浑浊。

思考题：
1. 叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？为什么？
不能，蓝光区也有类胡萝卜素的吸收峰，会干扰。

2. 为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜材料可以用无水丙酮提取？
因为叶绿素“头部”亲水，新鲜材料中含有水分，用无水丙酮照样可以提取，而干材料中不含水，需要80%丙酮才可提取。

实验六 氮蓝四唑法测定超验物歧化酶活力 P172
原理：超氧化物歧化酶（）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基O 的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 。O 与反应生成H2O2，H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。另一部分O 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560处有最大吸收峰。而可清除O ，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶活性越低，反之酶活性越高。据此可以计算出酶活性大小。

材料：玉米叶片（完全、缺）

操作步骤：分别取0.2g叶片于研钵中，加入2冰冷的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，再加入3冰冷磷酸缓冲液。取1于4800下离心10。将上清液倒入青霉素瓶中，即为粗提液。按如下操作：
取6支干燥的、玻璃质地一直的普通试管
试管编号
1
2
3
4
5
6

参比
对照
正常叶片
缺钙叶片
酶液

100
100
100
100
提取介质（磷酸缓冲液）
100
100

反应混合液（含核黄素）
4
4
4
4
4
4
各管充分摇匀
放暗处
置于光强3000照光15
560吸光值
0
0.393
0.313
0.366
0.292
0.190
总活性(鲜重)=（）0.5 ；5； 0.2； 0.1

注意事项：
1. 所用试管的玻璃质量要一样，包括厚度、直径等；
2. 照光条件要一致，照光时试管的高度、背景等；
3. 要多做对照消除日光灯管的光质差异；
4. 植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮消除；
5. 结果计算时要用相邻对照管代入公式。

思考题：
1. 在测定中为什么设照光与暗中两个对照管？
暗对照管是用来调零，以消除自身颜色的干扰。
光对照管是用来作为标准，与其他试管进行比较。

2. 影响本实验准确性的因素是什么？应如何克服？
应该控制好光源与光照强度。尽量使每支试管与光源的距离一致，并且每支试管高度、背景等要一致。试管规格也要一致。

实验七 改良半叶法测定植物光合速率
原理：植物进行光合作用形成有机物，而有机物的积累可使叶片单位面积的干物重增加，但是，叶片在光下积累光合产物的同时，还会通过输导组织讲同化产物运出，从而使测得的干重积累值偏低。为了消除这一偏差，必须将待测叶片的一半遮黑，测量相同时间内叶片被遮黑一侧的单位面积干重的减少值，作为同化产物输出量。
“改良半叶法”采用烫伤、环割或化学试剂处理等方法来损伤叶柄韧皮部活细胞，以防止光合产物从叶片中输出。
材料：茶叶
操作步骤：在晴天上午7-8点开始，选10片对称性良好、向阳、厚薄一致的完整功能叶。挂牌编号。
用刀片在叶柄基部环割，去掉韧皮部，再用锡纸包绕使叶片保持原来着生角度。并用刀片割下一半叶片（不可割到主脉），割下的叶片包裹于透气良好的湿布中。记录时间。
4-5h后再割下另一半叶片。与原先割下的半叶一一对应，重叠，用模板切下同样大小的叶面积，将光照与暗处理分别放在105℃下杀青10，然后在80℃下烘至恒重，在分析天平上称重并计算结果。
植物材料：茶叶
第一次取样时间：9:00
第二次取样时间：17:00
取样面积（2）：9*2*3=54
光合作用时间（h）：8

光照叶的干重（）：340
暗处理叶的干重（）：327
干重增量（光-暗）（）：13
光合速率（2h）=[(光-暗)干重增量]/[叶片切块面积*光合时间]=0.03

注意事项：
1. 实验要选择晴天做，所用叶片要选择对称性好、厚薄一致、向阳、无病虫的功能叶。
2. 韧皮部要切割彻底，如果切割不彻底，部分有机物仍可外运，测定结果偏低。
3. 切割韧皮时，不要伤及木质部。
4.光照结束后，相同编号的两半叶要对应部位叠在一起，用适当大小的模板切割相同的叶片面积。
思考题：
1. 简要介绍测定光合速率的三种方法及原理。
改良半叶法：。。。
氧电极法：植物进行光合作用放出氧气，可以用薄膜氧电极进行测定，它具有灵敏度高，操作简便，可以连续测定水溶液中溶解氧含量及其变化过程。

便携式光合测定仪法：型光合测定仪是利用先进的单片机技术对相应的2浓度、湿度、温度与光合有效辐射（）等传感器，进行信号采集，经模数（）转换处理获得数据。可显示光合速率（），蒸腾速率（），水分利用效率（）与气孔阻抗（）等，其最大优点是可以进行活体测定，多数据测定，还便于携带，进行野外测量。

2. 测定光合速率为什么要选择对称性好、叶龄、叶色、受光一致，无病虫害的功能叶？
同一叶片中脉两侧，其内部结构、生理功能基本一致。幼叶、老叶、枯叶、光照不足等因素均会影响叶片的光合速率，对结果造成误差。

3. 在改良半叶法中为什么将待测叶片编号？为什么要切割韧皮部？
编号是为了在光合作用后，光照叶片能与另一半暗处理叶片一一对应。才能在根据模板切割时，取的是相应位置，因为叶片是对称的，因此取对称位置认为叶片生理状况也是一致的。
韧皮部是运输养分的部位，叶片在光下积累光合产物的同时，还会通过输导组织讲同化产物运出，从而使测得的干重积累值偏低。因此要切割韧皮部让养分无法输出。

4. 改良半叶测定光合速率受哪些因素的影响？
叶片的对称性、叶龄、叶色、受光、水分、韧皮部的环割等。
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