SN∕T 4405-2015 黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犆狌 犮 狌犿犫 犲 狉犿狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑耘、卢小雨、张伟锋、向才玉、王红英、龙海、潘广、胡运发、李彬、孔德英。犛犖犜 黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了黄瓜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、 检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物种子苗木等繁殖材料和植物产品中黄瓜花叶病毒的检疫鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 植物病毒免疫电镜检测方法 进出境植物及植物产品检疫抽样基本信息学名：犆狌 犮 狌犿犫 犲 狉犿狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊缩写：分类地位：雀麦花叶病毒科（ ） ；黄瓜花叶病毒属（犆狌 犮 狌犿狅 狏 犻 狉 狌 狊） 。其他信息参见附录。原理和方法依据鉴别寄主的症状、病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。仪器设备、用具及设施 仪器设备天平（感量， ） 、计、酶标仪、透射电子显微镜、仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、高速离心机、超低温冰箱等。 用具微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等。 设施植物隔离检疫温室。试剂 检测试剂（见附录） 、 检测试剂（见附录） 、生物学测定试剂（见 ） 。免疫犛犖犜 电镜检测试剂按照 的规定执行。样品制备 种子类抽样按照 的规定执行。将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于 左右生长并进行症状观察。待长出片片真叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（ 株为组）并编号。 苗木类抽样 规定抽样。将苗木种植于隔离温室中，于 左右生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同 。检测方法 犇犃犛 犈犔 犐 犛犃检测方法见附录。 免疫电镜检测按照 的规定执行。 犚犜 犘犆犚检测方法见附录。 生物学测定 接种病叶加（质量体积）的磷酸盐缓冲液（ ， ）于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。 鉴别寄主症状苋色藜（犆犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌犿犪犿犪 狉 犪 狀 狋 犻 犮 狅 犾 狅 狉） ：褪绿或坏死斑，无系统症状。黄瓜（犆狌 犮 狌犿犻 狊狊 犪 狋 犻 狏 狌 狊） ：绿色或黄绿色系统花叶。昆诺藜（犆犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌犿狇 狌 犻 狀 狅 犪） ：褪绿或坏死斑，无系统症状。番茄（犔狔 犮 狅 狆 犲 狉 狊 犻 犮 狅 狀犲 狊 犮 狌 犾 犲 狀 狋 狌犿） ：系统花叶，叶片变窄。克利夫兰烟（犖犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪犮 犾 犲 狏 犲 犾 犪 狀犱 犻 犻） ：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成绿色或黄绿色系统花叶或环斑。心叶烟（犖犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪犵 犾 狌 狋 犻 狀 狅 狊 犪） ：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成绿色或黄绿色系统花叶或环斑。烟草（犖犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪狋 犪 犫 犪 犮 狌犿） ：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成系统花叶或畸形。菜豆（犘犺 犪 狊 犲 狅 犾 狌 狊狏 狌 犾 犵犪 狉 犻 狊） ：冬季表现细小的坏死斑，但夏季无症状表现；无系统症状。犛犖犜 结果判定 检测为阳性后， ，或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出黄瓜花叶病毒。如果上述方法还不能判定检测结果，可进行生物学测定，并进行复验。若 检测为阴性，则判定为未检出该病毒。 样品和记录保存 样品保存经检测确定携带的样品在合适的条件下保存。种子保存在，病株在 或者 冰箱中保存，提取的样品若需长期保存应放置于 冰箱。做好标记和登记工作。 结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。 检测需有试验的原始数据， 检测需有电泳结果，免疫电镜观察需有病毒粒体照片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。犛犖犜 附录犃（资料性附录）生物学特性犃 粒体形态黄瓜花叶病毒粒子为等轴对称的 面体的球状结构，无包膜，直径约 。犃 基因组基因组由三条线形正义单链组成，和编码病毒的非结构蛋白，与病毒的复制有关，编码病毒的运动蛋白和外壳蛋白，基因组大小分别为 、 和 ，沉降系数 ， 的比值为 ，占粒体重的 。一些株系可以携带卫星。犃 寄主范围寄主范围广泛，可侵染 科 属 多种双子叶植物和单子叶植物，是禾谷类作物、牧草、木本和草本观赏植物、蔬菜及果树上发生最广，危害最大的病毒。犃 病害症状幼苗期染病，子叶变黄枯萎，真叶表现出叶色深浅相间的花叶症状。成株期染病，症状在新出幼叶上表现最为明显，老熟叶片症状不明显。表现为在新出叶片上出现黄绿相间的花叶症状，叶片成熟后叶小，皱缩，边缘卷曲。果实上表现为瓜条出现深浅绿色相间的花斑，染病后瓜条生长缓慢甚至停止，果表畸形。发病严重时，植株矮小，茎节间缩短，使植株萎蔫。侵染黄瓜后，表现深绿与浅绿相间疣状斑块，果面凹凸不平或畸形；重病株节间短缩，簇生小叶，不结瓜，最后萎缩枯死；侵染辣椒后产生花叶、蕨叶、环斑或全株矮化等症状。犃 分布地区属世界性分布，尤其是在温带地区。犃 传播方式犃 近距离传播在田间主要通过蚜虫以非持久性传毒方式传播该病毒，机械摩擦、种子、菟丝子传播也能传播该病毒。犃 远距离传播通过带毒种子、苗木、组培苗等繁殖材料的运输发生远距离传播。犛犖犜 附录犅（规范性附录）犇犃犛 犈犔 犐 犛犃检测犅 试剂犅 包被缓冲液（狆犎 ）将碳酸钠（） 、碳酸氢钠（） 、叠氮钠（） 定容于 蒸馏水中，用浓盐酸（ ）调节值至 ，并储存于。犅 磷酸盐缓冲液（犘犅犛，狆犎 ）将氯化钠（ ）、磷酸二氢钾（） 、磷酸氢二钠（） 、氯化钾（ ） 、叠氮钠（） 溶解于 蒸馏水，用浓 调节值到 ，加水定容至。犅 犘犅犛犜缓冲液将氯化钠（ ）、磷酸二氢钾（） 、磷酸氢二钠（） 、氯化钾（ ） 、吐温 （ ）溶解于 蒸馏水中。犅 样品提取缓冲液（狆犎 ）将亚硫酸钠（） 、聚乙烯基吡咯烷酮（ ，） 、叠氮钠（） 、吐温 （ ） 溶解于 ，用浓盐酸（ ）调节值至 ，并储存于。犅 酶标结合物缓冲液将缓冲液 、小牛血清白蛋白（）、（ ，） 、叠氮钠（） ，加蒸馏水定容至 ，并储存于。犅 底物缓冲液将二乙醇胺 、叠氮钠（） 溶解于 蒸馏水中，用浓盐酸（ ）调整至 ，并储存于。犅 操作步骤犅 包被按照检测试剂盒说明操作。或用包被缓冲液稀释抗体（如 ） ，向微孔板中每孔加入 包被抗体溶液， 下孵育或下包被过夜。犅 捕获抗原弃去孔中的抗体包被溶液，用洗次次。加入 样品提取液到酶标板的孔中，每个样品重复个。并设置阳性和阴性对照。 下孵育或下孵育过夜。犛犖犜 犅 加入酶标抗体按照检测试剂盒说明操作。用酶标抗体缓冲液按比例稀释相应的酶标抗体（如 ） 。弃去孔中的检测样品提取液，用洗次次孔。每孔加入 酶标抗体溶液。在室温下孵育。犅 加底物加入底物缓冲液将硝基苯磷酸二钠盐（ ，）配制成浓度为的底物溶液。弃去酶标抗体溶液，用洗次次。每孔加入 新配制的底物溶液。室温下避光放置 ，待阳性对照孔显色。犅 吸光值的测定用酶标仪在 处读取吸光值。犅 结果判定通过酶标仪上 的犗犇值来判定。对照孔的犗犇 值（空白对照、阴性对照及阳性对照）应该在质量控制范围内，即：空白对照和阴性对照的犗犇 值 ，当阴性对照孔的犗犇 值 时，按 计算。阳性对照有的颜色反应；孔的重复性基本一致。在满足了该要求后，结果原则上可判断如下：样品犗犇 值阴性对照犗犇 值，判为阳性。样品犗犇 值阴性对照犗犇 值，判为阴性。样品犗犇 值阴性对照犗犇 值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。犛犖犜 附录犆（规范性附录）犚犜 犘犆犚检测）犆 试剂犆 犚犖犃提取试剂 试剂、氯仿、异丙醇、 乙醇。犆 犜犃犈 冰醋酸 加去离子水定容至。用时加水稀释至。犆 加样缓冲液溴酚蓝 蔗糖水溶液 （质量分数）犆 试验步骤犆 总犚犖犃提取称取样品 ，液氮充分研磨。加入 ，混匀，倒入 离心管中。加入 氯仿，剧烈震荡 ，条件下 犵离心 ，小心吸取上层水相至新离心管中。加入等体积异丙醇，混匀， 静止 ，条件下 犵离心 ，弃上层水相。加入 乙醇，重悬沉淀，条件下 犵离心 ，弃上层乙醇相，干燥沉淀。加入 ，置于 条件下 溶解沉淀，存于 条件下备用。或按照供应商推荐的试剂盒抽提。犆 犚犜 犘犆犚反应犆 引物的特异性引物及其序列见表 ，位于的基因上，预计扩增产物大小为 。表犆 犚犜 犘犆犚的引物和序列引物名称引物序列在 上的位置 注：检测引物“ ”和“ ”引自 犲 狋犪 犾， 。在 上的基因序列登录号。）该方法采用 等（ ）的黄瓜花叶病毒 检测方法。犛犖犜 犆 犮犇犖犃合成按表 列出的组分制备反应混合液 。反应条件为： 温育 ， 反转录， 处理 。表犆 犮犇犖犃合成反应体系试剂名称加样量模板反向引物（ ）缓冲液（ ）反转录酶（）酶抑制剂（ ）处理过的犆 反应程序将表 列出的组分加入反应管中，充分混匀后进行反应： 变性 ， 复性 ， 延伸 ，共 个循环；最后 延伸 。表犆 犘犆犚反应体系试剂名称贮备液浓度终浓度加样量 反应缓冲液 氯化镁（ ） 犜犪 狇聚合酶 补加水至总体积 犆 琼脂糖电泳犆 制备凝胶加入配制质量浓度为的琼脂糖，在微波炉中熔化混匀，冷却至 左右。犆 加入溴化乙锭加入浓度为 的溴化乙锭，混匀，倒入已封好的凝胶平台上，插入样品梳。待凝胶凝固后，拔出梳子，加入足够量的（缓冲液盖过凝胶表面约） 。犛犖犜 犆 电泳吸取 扩增产物，加入加样缓冲液混合均匀，将其和适合的分子量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统下观察并保留结果。犆 结果判断阳性对照在 处有扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增条带，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。若结果达到质控要求，且待测样品在 处无扩增条带，判定结果为阴性。犛犖犜 参考文献 ， ， ， ， ， ， （ ） （） ： ， ， ， （ ） ： ， ， ， （ ） ： ， ， ， （ ） ， ， ， ， （） ： 李华平，胡晋生，范怀忠黄瓜花叶病毒的株系鉴定研究进展中国病毒学， ，（） ： 侯伟娜，周晓阳黄瓜花叶病毒卫星研究进展 ，山东林业科技， ，（ ） ： 覃瑞，程旺元黄瓜花叶病毒研究进展中南民族大学学报（自然科学版） ， ， （） ： 宋荣浩，张永兴，袁贤溶香蕉黄瓜花叶病毒的鉴定上海农业学报， ，（） ： 席德慧，林宏辉，向本春黄瓜花叶病毒个分离物的亚组鉴定及株系分化研究植物病理学报， ， （） ： 杨洪一，孙立娜，张杰黄瓜花叶病毒分子变异分析黑龙江农业科学（） ， ， 明艳林侵染大丽花的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定福建农业学报， ， （） ： 犛犖犜 书 书 书 犜犖 犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元