组织工程支架制备有哪些方法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,（一）纤维支架,纤维支架是组织工程研究中最早采用的细胞外基质替代物之一，主要由,PGA,或其共聚物等结晶性聚合物纤维构成。利用纺织技术将直径,10,15m,的纤维制成,织物或无纺物，,其孔隙率高达,97%,，比表面积高达,0.05m,-1,，但存在力学强度较差、承压时会坍塌的缺点。,三、支架制备技术,改进：,（,1,）雾化或喷雾涂曾,采用,PLLA,或,PLGA,溶液涂覆织物的方法，可使相邻纤维间形成物理连结，从而使纤维支架稳定、耐压。,（,2,）热处理溶出,PGA,纤维浸在,PLLA/CH,2,Cl,2,溶液中,溶剂挥发后,PGA,嵌入到,PLLA,中,加热到两种聚合物熔点以上，,PLLA,熔点低，先熔化，充满,PGA,纤维网络所有空洞（,PLLA,防止纤维网塌陷作用）。交叉点的,PGA,纤维熔融后物理缠结在一起。,用氯仿溶出,PLLA,通过织物提高机械性能；类似孔结构,纤维网状结构加工示意图,A:PGA,B:PLLA,(,二,),多孔支架,松质骨结构,1.,粒子致孔法,最常用的是,溶液浇注,/,粒子浸滤,聚合物溶液与均一的盐晶混合,溶剂挥发后形成固体的聚合物,/,盐复合物,浸没在水中去除盐,可控孔隙率达,93%,（厚度,2mm,）,当盐晶含量为,70,90,时，有均匀的联孔结构,致孔剂粒子可采用氯化钠、酒石酸钠和柠檬酸钠等水溶性无机盐或糖粒子，也可用石蜡粒子或冰粒子。,溶液浇铸,/,粒子浸滤法制备多孔支架时易形成致密的皮层，若浇铸后不断地振动至大部分溶剂挥发，可防止粒子沉降，抑制表面皮层的形成,。,（非溶剂聚沉）,粒子致孔法简单、适用性广，孔隙率和孔尺寸易独立调节，是一个通用的方法，得到了广泛的应用，但致孔时往往需用到有机溶剂。,形成气体的盐致孔,水溶性致孔剂致孔,冰晶致孔,Guoping Chen,et al.Development of biodegradable porous scaffolds for tissue engineering.Materials Science and Engineering,2001;C 17:639,Morphology of cross-sections of PLLA sponges,2.,热致相分离,（,TIPS,）,相分离法是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷冻过程中发生相分离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。因而，相分离法又往往称为冷冻干燥法。,按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。,均向聚合物溶液：高温,低温,淬火热力学状态,参数：溶液浓度、冷冻温度、冷冻时间和,冷冻速率等,液液相分离相图,Porous,PDLLA/Bioglasss,composite scaffolds prepared by TIPS,：,bimodal and anisotropic pore structures composed of tubular macropores of 100,m,interconnected with micropores of,1050,m,in diameter,(,冷却到,L-S,相平衡线以下干燥,),溶液冷冻干燥,Whang K,et al.A novel method to fabricate bioabsorbable scaffolds.Polymer 1995,36:837-42,真空干燥,液氮,去离子水,乳液,聚合物,去离子水,冷冻干燥,乳液冷冻干燥,Ming-Hua Ho,et al.Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods.Biomaterials 2004;25:12938,溶液,冷冻,凝胶,温度低于,溶液凝结点,Morphology of the chitosan and alginate scaffolds,水凝胶冷冻干燥（明胶、藻酸盐和壳聚糖等水凝胶）,不同温度下，多步相分离粗化，提高孔尺寸、连通性,相分离,/,冷冻干燥法孔尺寸往往偏小，但该法避免了高温，因而得到了研究者的重视。,改进：,3.,气体发泡法,（,1,）超临界流体技术（物理发泡法）,该法将聚合物压成片,浸泡在高压二氧化碳中直至饱和,甚至超临界状态,然后降至常压,气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长,形成多孔支架。,超临界二氧化碳（,SCCO2,）,无残留溶剂,制备非晶相聚合物支架,优点：,不使用有机溶剂，因为残留在支架中的有机溶剂对细胞有害,;,反应体系可以在比较低的温度下进行（,30,40,C,）,便于药物和生长因子的粘附。,缺点：,支架的孔隙率和孔径不可控，由气体在固体中溶解,/,释放过程的形态决定；,连通率低（,10,30,）；,闭孔结构，可联合粒子浸滤法改进。,（,2,）化学发泡法,化学发泡法来制备多孔支架,采用的化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液,/,碳酸氢铵粒子混合物加入到模具中,待溶剂部分挥发后直接浸入热水中发泡,最后经冷冻干燥可得到多孔支架。,该法得到的多孔支架孔隙率超过,90%,孔相连性好,孔尺寸约,100,500m,并避免了表面皮层的形成。,4.,微球聚集法,将可降解聚合物微球加入模具中,加热至玻璃化温度以上,保持一定时间后冷却、脱模可制得烧结微球支架。,热处理时微球相互接触处由于链运动而连结在一起,冷却至室温后该结构被固定下来,因而得到多孔的烧结微球支架。,Fabrication process of a composite of PLAGA and BG.The composite wasprepared in a 3-D,porous scaffold by microsphere sintering.,PVA,LU et al.J Biomed Mater Res 64A:465474,2003,微球紧密堆积产生的孔隙成为支架的孔,孔尺寸范围为,37,150m,与微球尺寸成正比,孔隙率则随微球尺寸增大略有增加,为,31,39%,孔相连性很好。,该法优点在于孔相连性好,孔尺寸易调控,力学强度大,微球可包裹药物、生长因子，进行可控释放。,缺点则在于孔尺寸偏小,孔隙率亦低。,5,、静电纺丝,优点：操作简单，制品比表面积大,缺点：耗时长、效率低、可控性差，纤维难以排布规则,6.3D,印刷,浇铸聚合物粉基础（如：,PLGA,）,按希望的分布点,“,印,”,微米体积的溶剂液 滴（氯仿）,当溶剂挥发时凝结的粉固化,重复以上操作，建立,3D,结构,摇出未凝结的粉,精确性结构型微孔聚合物或陶瓷支架,Typical morphologies of porous polymer foams produced by solid freeform fabrication technique,快速成型法可一步形成支架的外形和相连的多孔结构,是一种,一体化制备方法,。,优点,:,成型时间短,利于自动化大规模生产,;,可根据个体的不同,迅速制备出具有个体特征的三维多孔支架,;,可制备各个部位具有不同孔结构的支架以适应复合组织的不同要求。,缺点：,支架孔隙率偏低,通常小于,80%.,改进？,7.,相连管状孔道支架,将,糖纤维等水溶性纤维,材料预先构建成具有特定结构的三维,“,负,”,支架,“,负,”,支架经水蒸汽处理后形成连结,.,将聚合物溶液滴在,“,负,”,支架上,冷冻使聚合物溶液凝胶化,用水浸出糖纤维,冷冻干燥脱除溶剂,得到的,多孔支架具有预先设计的相连管状孔道结构,孔隙率高达,90%,以上,并具有纳米纤维孔壁结构。,“,负,”,支架的构建既可手工完成,也可用快速成型技术来实现自动化。与通常的快速成型技术不同的是,首先形成的是最终的多孔支架的,“,负,”,复制品。,该支架的相连管状孔道结构更有利于支架内的传质过程,其纳米纤维孔壁结构则更有利于细胞粘附。,支架设计及制备技术,制备技术,加工,材料,要求,孔径,/,m,孔隙率,/%,结构,溶剂流涎盐沥滤,流涎,溶解,30300,90,球状孔径、盐粒会残留,挤出沥滤,模具,热塑性,50500,80,球状孔径、盐粒会残留,纤维粘合,编织,织物,20100,90,热诱导相分离,流涎,溶解,100,97,孔隙高度贯穿，微孔结构,超临界流体技术,流涎,非晶相,50,1030,非贯穿孔，微孔结构,三维打印,固体自由成型,溶解,45150,60,100%,贯穿孔（三角、五角、蜂窝状）,表：三维支架制备技术,（三）注射型组织再生支架（软支架）,可注射型支架是,将一种具有流动性的生物相容性良好的材料,与异体或自体细胞复合后注射到机体缺损部位,或,直接注人体内,材料到达缺损部位后能在,原位形成,具有一定机械强度、形状并且可与体液进行交换的支架。,支架通过注射完成植入,故可降低手术难度,减少手术创伤,特别适用于微创伤的修复。,高长有,马列,.,医用高分子材料,.P229-234.,洪奕等,.,注射型组织再生支架的研究进展,.,生物医学工程学杂志,2007;24(2):463-465.,可注射型支架在组织工程中应用的示意图,水凝胶具有在一定条件下可保持流动状态而在外部的物理或化学刺激下可形成一定形状和强度的体型材料的特性,因此成为,可注射型支架的首选材料,。,水凝胶作为可注射型支架,优点,：,具有良好生物相容性；,水溶液环境有利于保护细胞以及营养物和分泌产物的运输；,易用细胞粘附配体进行改性。,水凝胶作为可注射型支架,缺点：,水凝胶的操作不易控制,机械强度较低，消毒困难。,1.,温敏型水凝胶类可注射支架,:,温敏型水凝胶是指当一定浓度的溶液在温度升高或降低到一定值时可迅速形成凝胶,可分为,升温型水凝胶和降温型水凝胶。,由于温敏型水凝胶只需通过改变温度就可凝胶化,大大降低了外界物质对细胞的影响,因此用于可注射型支架具有一定的优越性。,例如：降温型：琼脂；升温型：,PEO,、胶原、,PNIPAm,接枝明胶,2.,交联型水凝胶类可注射支架,指在添加助剂或者引发剂后,分子链间发生交联形成水凝胶。交联方式有共价键交联,离子键交联等。,交联也可通过光引发来进行。,如：聚反丁烯二酸丙二醇酯（,PPF,）通过主链上的双键和含双键的单体或低聚物进行交联原位形成凝胶。,为减小温度、添加交联剂及引发剂,对细胞的活性的影响,可采取微囊化复合改进。如，,Payne,等将骨髓间质成骨干细胞微囊化后种植在水凝胶以保持细胞活性。,3.,复合水凝胶型可注射型支架,以水凝胶为载体的可注射型支架主要用于骨修复,一般是,采用微粒与水凝胶材料以适当比例共混,保持流动性,然后将混合物注射到缺损部位后凝胶化。,目前报道最多的是,以羟丙基甲基纤维素水凝胶与具生物活性的磷酸钙,(BCP),复合,以制备可注射型骨替代物一。,纤维素类水凝胶是一类升温型水凝胶,可以通过纤维素浓度来控制凝胶化的温度范围。,组织修复中的可注射型材料,分类,可注射型材料,固化方式,无机材料,磷酸钙,陶瓷固化,天然高分子材料,壳聚糖,海藻酸钠,胶原,明胶,琼脂,透明质酸,葡聚糖,甲基纤维素类,纤维蛋白,温敏型，引发剂引发,离子交联，光引发,温敏型,温敏型,温敏型,光引发,光引发,温敏型,温敏型，酶交联,合成高分子材料,PEO,PPF,PNIPAM,类,PEG,类,PEO-PPO-PEO,PLA-PEG-biotin,PVA,光引发,光引发，引发剂引发,温敏型,温敏型，光引发，酶交联，,M,加成,温敏型,自组装,光引发,PPF,：聚反丁烯二酸丙二醇酯,可注射型支架研究中存在的问题,:,如何提高水凝胶的强度,凝胶化的可控性,对于预制备降温型、交联型等水凝胶时与细胞的复合问题等。,Microspheres,Biodegradable PLGA microspheres have been studied for,delivery of chondrocytes for cartilage engineering.Non-porous,PLGA microspheres could be used as(i)a microcarrier for cell,expansion in vitro 130,prior to use as an(ii)injectable carrier,for cartilage regeneration in vivo 131133.We recently,reported that highly porous microspheres(200 m in overall,diameter and 30 m in pore diameter)could be prepared by a,gas foaming method 29.These porous scaffold microspheres,could be used for microcarrier suspension culture of cells,as,well as injection of the cell/microsphere constructs into a tissue,defect site(Fig.5).These injectable and porous microspheres,would provide a great advantage for cell therapy in many,aspects.Prior to injection,the porous structure(30 m)would,allow sufficient cell seeding in and out of the matrix.After,injection in vivo,the porous matrix would permit infiltration of,cells and in-growth of tissue from the host,facilitating the,regeneration process.,H.J.Chung,T.G.Park/Advanced Drug Delivery Reviews 59(2007)249262,Fig.5.Use of injectable porous scaffold microspheres for cartilage tissue engineering as an example.Primary chondrocytes are seeded within porous scaffold microspheres,expanded in vitro,and then injected or alternatively implanted as a cultured tissue into a cartilage defect site.,软骨细胞,（四）天然组织工程支架,天然支架是利用天然材料,本身存在的疏松或多孔状结构,，通过一定的制备方法得到的多孔支架材料。例如，利用直接或完全替代的原理，用其它个体的骨组织的无机部分作为支架材料。,异种骨,异体骨（脱钙骨、冻干骨）,海珊瑚,五、组织工程支架的发展,不同材料间的复合,生长因子的引入,物理结构上的仿生化（多层次）,理想组织工程支架模式图,纳米纤维状胶原基质,孔洞,微球,内部开孔体系,磷灰石,生物材料表面改性方法,等离子改性,接枝改性,生物活性分子的固定,聚合物表面基团的改变,自组装单分子层,层层自组装,生物大分子的表面固定化,将,具有生物活性的大分子,通过物理吸附、包埋或化学键合的方法固定在材料的表面,生物活性大分子：,ECM,黏附蛋白,（纤连蛋白、层连蛋白）,ECM,多糖及其类似物,（透明质酸、壳聚糖）,细胞黏附多肽,（,RGD,）,细胞活性因子,注：,RGD,系含有精氨酸,-,甘氨酸,-,天冬氨酸的促进细胞粘附的寡肽,8.4,组织工程中的微胶囊技术,一、微胶囊概论,微胶囊是指以高分子膜为外壳、其中包有被保护或被密封的物质的微小包囊物,。就像,鱼肝油丸,那样，外面是一个明胶胶囊,里面是液态的鱼肝油。经过这样处理，鱼肝油由液体变成了固体。,微胶囊的颗粒直径要比传统的鱼肝油丸小得多，尺寸范围在,零点几微米至几千微米,之间，,一般为,5-200m,。,单核,多核,多核，不规则外形,双璧,微胶囊簇,含微胶囊之微胶囊,微胶囊内被包裹的物质通常称为芯（,core,）、核（,nucleus,）或填充物（,fill,）；外壁称为皮（,skin,）、壳（,shell,）或保护膜（,protective film,）。,微胶囊中所包裹的物质，可以是液体、固体粉末，也可是气体。,由于应用目的和制造工艺不同，微胶囊的大小、形状可有很大变化，其包裹形式也有多种。常见的有,:,生物微胶囊的概念,将酶、蛋白质和激素等生物活性物质或微生物、动植物细胞包封在亲水性的,选择性透过膜,中,形成的球状微胶囊,称之为生物微胶囊。,1957,年，,Chang,首次报道生物活性物质的微囊化,(Chang T M S.Hemoglobin corpuscles.Research Report for Honours Physiology.Medical Library,McGill University,1957),60,年代中期,Chang,又指出了生物微胶囊在临床及其他生物学应用上的可行性,.,(Chang T M S.Semipermeable microcapsules.Science,1964,146:524525),通过微胶囊膜的选择透过作用,使囊外大于某一分子量的物质不能扩散进入,而生物环境中的营养成分和囊内生物活性物质或细胞分泌的小分子产物可以自由出入微胶囊,从而达到,免疫隔离,目的,生物微胶囊示意图,方法：,1,把需要的细胞密封在半透膜中,2,植入密封装置或与体内连接,3,细胞分泌物 治疗,4,当治疗完成时装置取出或断开连接,80,年代初,人工胰腺：,将微囊化技术与组织细胞移植相结合,制备了具有良好生物相容性的,海藻酸钠,/,聚赖氨酸微胶囊,作为免疫隔离工具,包埋,猪胰岛细胞,形成人工细胞,并移植入糖尿病大鼠体内,结果表明该人工细胞成功地调节了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,.,Lim F,Sun A M.Science,1980,210:908909,90,年代以来,医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具，利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病,.,目前,微胶囊的应用研究还涉及药物控制释放、动植物细胞培养、细胞和酶的固定化、以及生化物质分离等领域。,二、生物微胶囊的种类及其制备,生物微胶囊在应用上必须满足如下条件,：,对生物物质没有毒害作用，生物相容性好（,但不支持细胞粘附，也不刺激细胞过渡生长,）；,良好的传质性质（生物活性物质、信息物质、细胞产物）和截留隔离性质（抗体或免疫细胞）；,理化性质稳定，并具有一定的机械强度。,两个重要的物理量：,微胶囊膜强度,膜强度大小决定了微胶囊在生物环境停留期间能否保持基本完整,从而保证囊内细胞或物质活性。,微胶囊膜渗透性,是决定微囊化技术能否用于临床移植治疗或细胞培养的关键,.,（指标：截留分子量）,例如：层,-,层自组装微胶囊,层层自组装技术,（,Layer-by-Layer Self-Assemble Technique,，,L-b-L,）,基于聚电解质阴阳离子之间电荷相互作用的一种超分子组装技术，该技术的驱动力不局限于静电相互作用，也可以是氢键、电荷转移和疏水作用力等，多种作用的协同效应能够大大提高膜的稳定性。,90,年代以来,医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具，利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病,.,目前,微胶囊的应用研究还涉及药物控制释放、动植物细胞培养、细胞和酶的固定化、以及生化物质分离等领域。,层层静电自组装过程示意图,例：,PLLA,膜片表面胺解以及在在此基础上的静电层层自组装修饰,原料：,聚电解质为聚苯乙烯磺酸钠（,PSS,）和 壳聚糖,层层自组装技术优点,1,2,3,4,制备条件温和,，可在常温水溶液中进行，能保持生物分子生物活性的天然构象。,工艺简单,，通过简单的交替浸涂即可实现材料表面纳米、亚微米尺度的有规膜层。,适用范围广,，组装原料可以是蛋白质、,DNA,等带电荷的天然生物分子，也可以是合成的聚电解质,。,适用基体材料多,，对基体材料体型结构适应力强。,层,-,层组装制备聚电解质,中空微胶囊,示意图,LBL,技术制备中空微胶囊：,采用可被去除的胶体颗粒作为,组装的模板,，利用,LBL,技术将聚电解质沉积到胶体颗粒上，然后将作为模板的胶体颗粒溶解或分解，得到聚合物中空微胶囊。,囊壁厚可达几十纳米,。,Georgieva,等将,LBL,技术应用于包埋,酵母细胞,。用层层组装的聚苯乙烯磺酸钠（,PSS,）和聚烯丙基盐酸盐（,PAH,）作为囊壁，利用荧光技术证实了细胞和囊壁的完整性，发现微囊化的细胞保持原有代谢活性，且仍能分裂。,PAH/PSS,微胶囊化酵母细胞示意图,红色,为,PAH,蓝色,为,PSS,绿色,为标记的,PAH,