2016版植物生理学实验指导书.doc

北 京 农 学 院
[自编教材指导书]

《植物生理学》实验指导
（2016版）
李奕松 姬谦龙 马兰青
葛秀秀 杨明峰 王文平 赵筱萌编

北京农学院生物科学与工程学院
2016.2

目 录
★★★实验室特别提醒
实验一 质壁分离法测定细胞渗透势…………………………4
实验二 小液流法测定植物组织水势…………………………5
实验三 叶绿体色素的提取分离理化性质及定量测定………7
实验四 植物根系活力的测定（法）………………… 10
实验五 过氧化氢酶（）活性的测定……………………12
实验六植物硝酸还原酶（）活性的测定………………14
实验七植物细胞膜透性的测定………………………………16
实验八植物光合速率的测定…………………………………17

★★★实验室特别提醒
一、 实验室纪律要求
1. 按照规定，穿好实验服进入实验室。
2. 不允许将食品和饮用水带进实验室。
3. 按照教师指定的实验台进行实验，不允许私自调换位置。
4. 实验课中禁止大声喧哗、跑动和打闹。
二、 实验安全注意事项
5. 注意电源使用安全，禁止湿手拔插插头。
6. 水浴锅锅盖开启关闭时，注意避免蒸汽烫伤。
7. 注意抽气泵安全使用。
8. 注意使用分光光度计时参比液体样品不能满溢洒漏。
三、 实验课程要求
9. 提前预习实验指导内容，熟悉实验原理和步骤。
10. 检查台面用具是否完好，若否，须报告进行补充调整。
11. 清洗器皿程序：“自来水→去污粉→自来水→去离子水”。
12. 实验原始结果记录需要指导教师审查签字。
13. 实验后填写仪器使用记录。
14. 实验完毕清洁实验器皿和台面、地面卫生。
15. 离开实验课堂需要得到指导教师批准。

实验一 质壁分离法测定细胞渗透势
一、原理：
在生活细胞和外界溶液构成的渗透体系中，水分总是从高水势一方流向低水势一方。将植物组织放入一系列不同浓度的蔗糖溶液中，经过一段时间以后，有的细胞吸收水分，细胞膨胀；有的失去水分，细胞发生质壁分离。如果在某一溶液中细胞脱水达到平衡时刚好细胞处在临界质壁分离状态，此时细胞内的压力势等于零，外界溶液的渗透势等于细胞渗透势，故此外界溶液称为该组织的等渗溶液，其浓度称之为该组织的等渗浓度。根据公式即可计算出该组织细胞液的渗透势。在实际测定时，由于临界质壁分离状态难以在显微镜下直接观察到，所以一般均以细胞初始质壁分离状态作为判断组织等渗浓度的标准。如果细胞质壁分离较为明显，可根据引起质壁分离的溶液浓度，与相邻的不引起质壁分离的溶液浓度，取其平均值，求出组织等渗浓度，并计算出溶液的渗透势，即为该组织细胞的渗透势。
二、材料与设备：
1.植物材料：洋葱鳞茎、大葱、蚕豆叶片或其它植物叶片。
2.设备：显微镜1台、培养皿7套；滴管；载玻片、盖玻片各5片；镊子1把；单面刀1片；滤纸适量。
3.试剂：1.00蔗糖溶液，0.03%中性红溶液.
三、实验步骤：
1. 以1.00蔗糖溶液为母液,依照公式C1V12V2配制0.30、0.40、0.50、0.60、0.70蔗糖溶液各10于干燥清洁的小培养皿内备用。注意盖上培养皿盖，防止蒸发浓缩。
2. 用刀片在洋葱鳞茎内表皮上划出边长为5mm的小方格，用镊子剥取内表皮数块浸入盛有0.03%中性红溶液的小培养皿内，染色3，取出后放入盛有自来水的小培养皿内，冲洗中性红留存在细胞间隙、细胞壁等上面的浮色，用滤纸吸干内表皮上的多余水分。
3.在盛有不同浓度蔗糖溶液的培养皿内分别放入染过色并漂洗后的内表皮数块。20后，按从高浓度到低浓度蔗糖溶液的顺序各取出内表皮小块，依次开始镜检，绘图记录质壁分离情况，求出组织细胞的等渗溶液浓度。
四、结果计算：
由所得到的组织细胞的等渗浓度和测定时的室温，用下式计算植物细胞的渗透势。
Ψ （）
ΨS：为细胞渗透势，以表示。
i ：为溶液的等渗系数（蔗糖溶液的1）。
C：等渗溶液的浓度（）。
T：为绝对温度，（273℃）K，t为实验时的室温。
R：为气体常数，0.008314（L··k）
实验二 小液流法测定植物组织水势
一、原理
水势表示水分的化学势，水分从水势高处流向低处。植物体细胞之间、组织之间以及植物体和环境之间的水分移动方向都由水势决定。
当植物细胞或组织分别放在一系列浓度递增的溶液中时，如果植物组织的水势小于溶液的渗透势，则组织吸水而使外界溶液浓度变大；反之，则组织水分外流而使外界溶液浓度变小。若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外界溶液浓度不变，而外界溶液的渗透势即等于所测植物组织的水势。溶液浓度不同，比重不同，当两个不同浓度的溶液相遇时，稀溶液由于比重小而上浮，浓溶液则由于比重较大而下沉。取浸过植物组织的溶液一小滴（为了便于观察可先染色），放在原来浓度的溶液中，观察液滴升降情况即可判断浓度的变化，如小液滴不动，则表示溶液浸过植物组织后浓度未变，即外界溶液的渗透势等于组织的水势。
二、材料与设备：
1. 植物材料：胡萝卜肉质根或其它作物的叶片。
2. 设备：青霉素小瓶或小试管（12×10mm）6支（均具塞）；大试管（15×150）6支（具塞）；10移液管2支；1移液管2支；毛细滴管6支；打孔器1个；温度计1支；解剖针1支；镊子1把。
三、实验步骤：
1、以1.00蔗糖溶液为母液,依照公式C1V12V2配制一系列不同浓度的蔗糖溶液（0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5）于6支干净、干燥的大试管中，各管加塞，并编号。按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。
2、另取6支干净、干燥的青霉素小瓶，编定序号，按顺序放在试管架上，作为实验组。然后由对照组的各试管中分别取溶液1移入相同编号的实验组试管中，加塞，备用。
3、取胡萝卜肉质根（或剪下具有代表性的新鲜叶片）立即用打孔器打园片。注意实验材料的取样部位一定要一致，若为叶片组织要避开大的叶脉部分。迅速将适量植物材料放在青霉素小瓶（或小试管）中。一般胡萝卜肉质根放入8片（厚约1）左右，叶片材料放入20片左右。摇动小瓶，使植物材料浸入到溶液中。注意这个过程操作要快，防止水分蒸发。放置20。在此期间摇动小瓶2-3次，使组织和溶液之间进行充分的水分交换。
4、20后，分别在各小瓶中加入甲烯兰粉末少许，摇匀，使溶液为蓝色。按浓度依次分别用毛细吸管吸取少量蓝色溶液，轻轻插入相应浓度的试管中，伸至溶液中部，小心缓慢地放出蓝色溶液一小滴，慢慢取出毛细管（注意避免搅混溶液）。观察并记录液滴的升降情况：
如果有色液滴向上移动，说明浸过植物组织的蔗糖溶液浓度变小，植物组织失水，表明植物组织的水势高于该浓度溶液的渗透势；如果有色液滴向下移动，说明浸过植物组织的蔗糖溶液浓度变大，植物组织吸水，表明植物组织的水势低于该浓度溶液的渗透势；如果液滴静止不动，则说明植物组织的水势等于该浓度溶液的渗透势。在测定中，如果在前一浓度溶液中液滴下降，而在后一浓度溶液中液滴上升，则该组织的水势为前后二种浓度溶液渗透势的平均值。

四、结果计算
记录液滴静止不动的试管中蔗糖溶液的浓度。
由所得到的等渗浓度和测定的室温，按下式计算植物组织的水势。
ΨW= - （）
ΨW：为植物组织水势，以表示。
i ：为溶液的等渗系数（蔗糖溶液的1）。
C：为等渗溶液的浓度：（）。
T：为绝对温度：（273℃）K，t为实验时的室温。
R：为气体常数：0.008314（L··k）

实验三、叶绿体色素的提取、理化性质及定量测定
I.叶绿体色素的提取、理化性质
一、原理：
叶绿体中含有绿色素（叶绿素a和b）和黄色素（胡萝卜素和叶黄素）。这两类色素能溶于有机溶剂，且各种色素的脂溶性不同。根据它们在有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙酮等）中的溶解特性，可将它们从叶子中提取出来。
叶绿素是一个双羧酸的脂，在碱的作用下，可发生皂化反应。在酸性条件下，叶绿素 啉环中央的镁可被氢取代，于是叶绿素成为褐色的去镁叶绿素。叶绿素中的镁也可被铜、锌等金属离子取代，此时叶绿素仍可保持绿色。叶绿素在光照下会发出暗红色的荧光。
二、材料与设备：
1. 植物材料：新鲜植物叶片。
2. 设备：研钵一套；漏斗一个；剪子一把；细玻璃棒一支；烧杯（50）1支；20刻度试管5支；5刻度试管2支；25刻度吸管2支；酒精灯；石棉网；铁三脚架；滤纸适量。
3. 试剂：丙酮；3; 80%丙酮；苯；醋酸酮粉末；50%醋酸；甲醇溶液（20克溶于100甲醇中）
三、实验步骤：
1. 色素的提取
取洗净新鲜的植物叶子5克，剪碎放入到研钵中，加入少量碳酸钙和石英砂，再少量多次加入丙酮共10，研磨至丙酮染成深绿色，将丙酮提取液滤入小烧杯内，再用10丙酮重复研磨，过滤，滤液待用。
2. 理化性质的测定
1）荧光现象
取叶绿素提取液，放入试管中，在反射光下观察，溶液的颜色为暗红色，这是叶绿素辐射荧光的现象；在透射光下为绿色，是由于叶绿素分子不吸收绿色光的原因。
2）皂化作用
用移液管吸取叶绿素提取液5，放入到一大试管中，再加入1.5 20%甲醇溶液，摇匀。紧接着加入5苯，马上摇匀。沿试管璧加入蒸馏水1 ，轻轻转动试管，静置于试管架上，可看到溶液逐渐分成两层，上层是苯溶液，其中溶有黄色的类胡萝卜素，下层为稀的丙酮溶液，其中溶有绿色的皂化的叶绿素a和b。
3）取代作用[和2+对叶绿素分子中2+的取代]
用移液管吸取叶绿素提取液5，放入试管中，加入50%醋酸数滴（或浓 1~2滴），摇匀，可观察到溶液由绿色变成褐色，此时叶绿素分子中的2+被取代，为去镁叶绿素。之后将溶液倒一半于另一试管中，加醋酸酮粉末少许，微微加热，则溶液颜色又变成绿色，此时去镁叶绿素分子中的被2+取代，为铜代叶绿素。将两试管中的溶液进行比较。
. 叶绿素的吸收光谱与定量测定
一、 原理
实验目的：掌握紫外分光光度计的使用，学习测定叶绿素的含量及吸收光谱的测定方法。
根据叶绿素对可见光有特定的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，利用公式计算叶绿素的含量。该法不但精确度高而且能在未分离的情况下，分别测定叶绿素a和叶绿素b的含量。
已知叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663和645 ,又已知在波长663下叶绿素a、b的80%丙酮溶液的比吸收系数为82.04和9.72，在波长645下分别为16.75和45.60。其关系式：
D663 = 82.04 + 9.72……………………………………………………… (1)
D645 = 16.75 + 45.6………………………………………………………(2)
D663 、D645：分别为叶绿素溶液在波长663和645的光密度。
、：分别为叶绿素a、b的浓度，单位为
解方程(1) (2)得：
= 12.7 D663 － 2.59 D645……………………………………………….（3）
= 22.9 D645 － 4.67 D663……………………………………………….（4）
与 相加，既得叶绿素总量
= + = 20.3 D645 + 8.03 D663…………………………………… (5)
根据叶绿素a、b在652处有相同的比吸光系数（34.5），即可在此波长下测定光密度（D652）而求出叶绿素总浓度：
D652 × 1000
（） =————————……………………………………………..(6)
34.5
二. 材料和设备：
1. 实验材料：菠菜叶片
2. 设备：756紫外分光光度计，电子天平，研钵一套，漏斗一个，25容量瓶一个
3. 试剂：80%丙酮，3粉末
三. 实验步骤：
1. 叶绿素提取液的置备：称取新鲜干净的叶片（去主脉）0.1克，剪碎，放入研钵中，加入少量3粉末和石英砂，加入80%丙酮，仔细研磨成匀浆，再加入适量丙酮，继续研磨至组织残渣变为白色，静止片刻，将提取液过滤至25容量瓶中，再用80%丙酮冲洗研钵和滤纸，将色素冲洗干净，最后用80%丙酮定容至25，摇匀 、待用。
2.光密度测定与吸收光谱扫描：以80%丙酮做对照，按下列步骤输入程序：
1) 开机：依次打开外部电源(如稳压器)、主机电源。
2) 仪器自检 ：当打开仪器电源时，仪器便进入自检程序，自检各项都“”后，进入选择工作方式界面；预热半小时后进行以下操作。
3）光度测量未知叶绿素a、b总浓度的测定：
3.1进入光度测量(652,)： 在选择工作方式界面中按①键进入光度测量。
3.2参数设置： 按F1键进行参数设置：选测光方式为 “”，按键退出；按F2键进入测量模式；按λ输入测量样品波长值。
3.3校零：在第一样品池中放入参比溶液，按\键，仪器进行自动校零，校完后取出参比溶液。
3.4测量： 将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入第一样品池内，按\即可测量样品值。
4) 光谱测量
4.1进入光谱测量：在选择工作方式界面中按②键进入光谱测量。
4.2参数设置：按F1进入参数设置：（1）测量波长范围(700-300)；（2）记录范围（0-3）；（3）采样间隔（1）；（4）光度方式(一般为)；（5）扫描速度（一般为中速）。参数设置完后按键退出参数设置。
4.3基线校正：在第一样品池中放入参比溶液，按\键仪器进行基线校正，校完后取出参比溶液。
4.4扫描：将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入第一样品池中，按\ 仪器自动进行扫描。
四、叶绿素含量的计算：
按公式（3）、（4）分别计算叶绿素a、b的浓度，相加既得总浓度，也可按公式（6）直接算出叶绿素总浓度。
然后按公式（7）或（8）算出叶绿素总含量：

() ×提取液总体积(L) × 稀释倍数
叶绿素含量（鲜重%）= —————————————————×100%……（7）
样品鲜重（）

() ×提取液总体积(L) × 稀释倍数
叶绿素含量（）= —————————————————————……（8）
样品鲜重（g）

实验四、植物根系活力的测定（法）
一、原理
根是植物的重要器官，它不断生长，具有吸收水分和矿质养分的功能，而且还能进行合成代谢，如氨基酸、植物激素等的合成。所谓根系活力是泛指根的吸收、合成代谢等等的能力。根系活力与吸收作用的强弱有直接关系，与脱氢酶系活性的强弱成正比。法测定根系活力就是根据根系脱氢酶系氧化还原能力强弱而设计的。
氯化三苯基四氮唑（）是标准氧化还原电位为－80的氧化还原物质。其氧化态无色，并溶于水，但被还原后即生成不溶于水的三苯基甲腙，呈红色，它在空气中不会自动氧化，相当稳定，所以可用作为脱氢酶的氢受体.
植物根所引起的还原，可因加入琥珀酸、延胡素酸、苹果酸得到加强；而被丙二酸、碘乙酸等所严重抑制。所以还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。
二、材料与设备
1. 植物材料：水培或砂培植物幼苗的根，或仔细洗净泥土的植物幼苗的根。玉米根系发达，是较好的实验材料。
2. 设备：721型分光光度计；温箱；电子天平；研钵1套；镊子1把；漏斗1个；刻度吸管2 1支、10 2支、0.5 1支；容量瓶10 1个、刻度试管20 6支；烧杯500 1个；石英砂适量。
3. 试剂
[1]、乙酸乙酯（分析纯）500；
[2]、分析纯连二亚硫酸钠（2S204）粉末少许；
[3]、1溶液，准确称取1.000g，溶于水中，定容至100；溶液应在6.5~7.5，以试纸试之，如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水。
[4]、0.4溶液，准确称取0.400g，溶于水中，定容至100；
[5]、1/15 磷酸缓冲液（7.0），配制方法为：A液：称取分析纯204·2H2011.876g溶于蒸馏水中成1000，B液：称取分析纯2P04，9.078g溶于蒸馏水中成1000。用时取A液60、B液40混合即成。
[6]、1硫酸：用量筒取出比重1.84的浓硫酸55，边搅边加入盛有5002O的烧杯中，冷却后稀释至1000。
三、实验步骤（定量测定）
（1）标准曲线的制作：吸取0.25 0.4% 溶液放入10刻度试管中，加入少许2S204粉末[应尽量多加一些，以使充分还原]，摇匀后立即产生红色的三苯基甲腙。用乙酸乙酯原液定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.10，0.25，0.50，0.75，1.00置10刻度试管中，分别加乙酸乙酯4.90，4.75，4.50，4.25，4.00，即得到含三苯基甲腙0.01，0.025，0.05，0.075，0.10的标准比色系列，以乙酸乙酯做空白作参比，在485波长下测定光密度。以还原量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）剪取植物根尖1部分为实验材料，称取0.1g，放入刻度试管中，加入0.4溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10，把根充分浸在溶液内，在37℃下保温40-60，植物根尖部分成为红色。之后加入1硫酸2，以停止反应。空白试验为先加硫酸再加入根样品，其它操作相同。
（3）用镊子将根夹出，冲洗后擦干表面水分，加入少许乙酸乙酯和少量石英砂在研钵内研磨，以提取出红色的三苯基甲腙，把红色浸提液滤入试管，并用乙酸乙酯洗涤研钵中的残渣2—3次，至到残渣为白色。然后用乙酸乙酯将浸提液定容至5。浸提液在485下比色，以空白试验（先加硫酸到再加入根样品操作得到的溶液）作参比，读出光密度，查标准曲线，求出还原量。

四、结果计算：
还原量（）
还原强度= ——————————————————（·1·1）
根重（g）×酶促反应时间（）

实验五、过氧化氢酶（）活性的测定
一、原理：
过氧化氢酶（）在植物体内普遍存在，它能把过氧化氢分解为水和氧气。其活性大小以一定时间内分解的过氧化氢量来表示。让酶与定量的底物（过氧化氢）进行定时的反应，反应结束后，再用碘量法测定剩余的过氧化氢量。以钼酸铵作催化剂，过氧化氢与碘化钾在酸性条件下反应，放出游离碘。然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应为：

H2O2+224→I224+2H2O
I2+22S2O3→22S4O6
根据空白（不加酶液）和测定（加酶液）二者滴定值之差，即可求出酶分解的过氧化氢量。酶活性单位为：分解H2O2·
二、材料与设备
1. 植物材料：小麦或其它植物叶片
2. 设备：电子天平；研钵一套；100三角瓶4个；100容量瓶2个；50酸式滴定管1支；恒温水浴；漏斗1个；滤纸适量；移液管10 1支、5 2支、1 1支。
3. 试剂：
[1] 碳酸钙粉末。
[2] 1.8硫酸：取1000烧杯1只，加入约5002O，边搅拌边加入100浓硫酸，冷却后，用容量瓶定容至1000。
[3] 10%钼酸铵溶液。
[4] 1%淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20水调匀，慢慢倾入约80沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾，冷却后贮于滴瓶中。
[5] 0.1硫代硫酸钠溶液：称取2S2O3·5H2O25g溶于新煮沸并冷却过的2O中，加入约0.123，并稀释至1L。保存于棕色试剂瓶中，放置暗处，一天后进行标定。
标定方法：精确称取分析纯K22O7约0.15g置于500三角瓶中，加302O溶解，加入2和5 6盐酸，在暗处放置5，然后用水稀释至200，用0.1硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液从棕红色变成浅黄色时，加入1淀粉溶液，继续滴至溶液由兰色变成亮绿色（离子的颜色）为止，计算出2S2O3的摩尔浓度。
[6] 0.02硫代硫酸钠：吸取20标定过的0.1硫代硫酸钠溶液，加入到100容量瓶中，加2O定容到刻度。注意现用现配。
[7] 0.06过氢化氢，取130%的过氧化氢用2O称释至150。
三、实验步骤：
1、酶液提取：称取剪碎混匀的新鲜小麦叶片1g置于研钵中，加0.2g碳酸钙和2O2，仔细研磨成匀浆。过滤至100容量瓶中，用2O称释至刻度，振荡片刻，静置。取10溶液再移入另一容量瓶中，加2O至刻度，摇匀备用。
2、 测定：取100三角瓶4个，编号。每瓶加酶液5，立即向3、4号瓶中加入1.8硫酸3，终止酶的活性，作为空白测定。然后将各瓶放在20℃水浴中保温，10后依次向各瓶加入3 0.06过氢化氢，摇匀并记录加入时间，让酶作用5，再依次向1、2号瓶各加入3 1.8硫酸。然后4个瓶各加入1 20%碘化钾、3d钼酸铵及5d淀粉指示剂，用0.02硫代硫酸钠滴定到兰色消失。

四、过氧化氢酶活性的计算：
从空白测定的硫代硫酸钠滴定值减去样品测定的滴定值，即可求出此期间过氧化氢酶所分解的过氧化氢量。

[空白滴定值（）－样品滴定值（）]
被分解的H2O2量（）= —————————————————×硫代硫酸钠（）×34
2

【注：34为H2O2的分子量】

被分解H2O2量（）
———————————×酶液总体积（）
测定时用酶液（）
活性（H2O2·）= —————————————————
样品重（g）×时间（）

实验六、植物硝酸还原酶()活性的测定
一、原理：
硝酸还原酶（）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。其反应式为：3-++—→2-+H2O 。硝酸还原酶活性高低以生成的亚硝态氮衡量，酶活性一般以单位时间每克鲜重植物材料还原生成的亚硝态氮含量表示，即以2为单位。2-含量的测定可用磺胺比色法，该方法能测定的2 浓度为0.5。
亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
硝酸还原酶活性的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，硝酸还原酶不用从植物组织中提取出来，其作用产物2-可以从组织内渗透到外界溶液中，通过测定反应液中2-含量的增加，即能表明酶活性的大小。
硝酸还原酶是一种诱导酶，当向培养介质中加入硝酸盐时，植物体内很快就会出现硝酸还原酶。
二、材料设备：
1. 植物材料：小麦、玉米或其它植物材料的叶片。
2. 设备：分光光度计；真空抽气装置；温箱；打孔器；电子天平；小三角瓶；试管；移液管5的2支、2的4支。
3. 试剂：
[1]、0.2硝酸钾溶液：溶解10.11g硝酸钾于2O中，定容至500。
[2]、0.1磷酸缓冲液，7.5
A液：0.224，取24 27.8g,2O溶解，配制成1000溶液。
B 液：0.224，取2471.7g，2O溶解，配制成1000溶液。
取A液16、B液84，混合，用2O稀释至200。
[3]、磺胺试剂：1g磺胺（或对氨基苯磺酸）加25浓盐酸，用2O稀释至100。
[4]、α-萘胺试剂：0.2gα-萘胺溶于含1浓盐酸的2O中，定溶至100。或将α-萘胺溶于25的冰醋酸中，用2O稀释至100。
[5]、亚硝酸钠标准液：称取级20.1000g，用2O溶解、定溶至100，取5，再用2O稀释至1000，即为2-含量是5的标准液。
三、实验步骤
1、将新鲜的叶片用水洗净，吸水纸吸干表面水分，然后用打孔器打成直径为1cm的园片，称取等量叶园片2份（每份0.2—0.3g），用2O 洗涤2—3次，吸干水分，分别置于含有下列溶液的2个50三角瓶中：（1）0.1磷酸缓冲液(7.5) 5 + 2O 5,(2)0.1磷酸缓冲液(7.5) 5 + 0.2 3 5。注意将溶液浸没植物材料，然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气7-10，放气后，园片即沉于溶液中。将三角瓶置于30℃温箱中，不见光，保温30。
注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使酶的活性降低。
2、2-含量测定：
保温30结束后，分别取出1反应液于试管中，加入磺胺试剂或对氨基苯磺酸2，摇匀。再加入α-萘胺试剂2，摇匀。注意各试剂的加入顺序。在30℃温箱中保温30，用分光光度计在520波长比色，测定光密度。从标准曲线上查得2-含量，然后计算酶活性。单位为2。
3、标准曲线的制作：取7支试管，编号，按下表顺序添加试剂，每加入一种试剂后注意摇匀。待试剂加完后，将各试管置30℃温箱中保温30，立即于520波长下进行比色，读出光密度，以光密度为纵坐标，2-浓度为横坐标绘制标准曲线。
◆注意：测定2-的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于1的2含量，由于显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准曲线与样品的测定都在相同条件下进行则显色速度相等，彼此可以比较。
制作标准曲线的试剂配比
试管号
2标准液（）
2O
（）
磺胺试剂
（）
α-萘胺
（）
反应终了2-含量
μ管
1
0
1
2
2
0
2
0.1
0.9
2
2
0.5
3
0.2
0.8
2
2
1.0
4
0.4
0.6
2
2
2.0
5
0.6
0.4
2
2
3.0
6
0.8
0.2
2
2
4.0
7
1.0
0
2
2
5.0

四、结果计算:

亚硝酸盐还原量（μg：在标准曲线中以实验中的吸光度值查出）

材料重量（g）×酶促反应时间（h）
硝酸还原酶活性=————————————————————————（μg·1·1）

实验七、 植物细胞膜透性的测定
一、原理：
植物组织受不良环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，使细胞膜透性增大，导致细胞的内含物会有不同程度的外渗。若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量增加。组织受伤害越严重，电解质含量增加得越高。用电导仪测定外渗液电导度的变化，可反映出质膜受伤害的程度。透性变化愈大，电导度愈大，表示受伤害愈重，也就表示抗性愈弱。
二、材料与设备：
1. 植物材料：选取小麦或其它作物一定叶位和叶龄的功能叶片。
2. 设备：电导仪1套，真空抽气装置1套；50三角瓶3只；剪子1把；滤纸适量，打孔器1个，玻棒2根。
3. 试剂：2O或去离子水。
三、实验步骤：
1、清洗用具：电导法对水和容器的洁净度要求严格，器皿稍有杂质即产生电导度的很大误差。故所用玻璃用具洗净后，再用自来水、无离子水冲洗四、五次。倒置于洗净而垫有洁净滤纸的盘中。
2、取样及处理：分别在正常生长和逆境胁迫的植株上取同一部位的功能叶若干片，分成2份。用纱布擦净表面灰尘。将其中一份低温处理：放在-20℃左右的温度下冷冻20（或高温处理：置40℃左右的恒温箱中处理30）；另一份裹入潮湿的纱布中放置在室温下作对照。处理后分别用去离子水冲洗两次，用洁净的滤纸吸干，然后用打孔器（1cm2）将叶片打取12个叶园片，分别放入三角瓶中，准确加入20的无离子水，浸没叶片，然后放入真空抽气装置中抽气约10，以抽出细胞间隙空气，缓缓放气，水即渗入细胞间隙，叶子变成透明状，沉在三角瓶底部，取出三角瓶，放在室温下保持30，间或摇动几次。
3、测定：将电导仪的电极插入三角瓶中，测定外渗液的电导值，记录其初始电导值（S1）。之后，将三角瓶放入沸水浴中5，以杀死组织。待冷至室温后，再次测定外渗液的电导值（S2）。
四、结果计算：
按下式计算相对电导度：
相对电导度（L）12
相对电导度的大小表示细胞受伤害程度。
由于对照（在室温下）也有少量电解质外渗，故可按下面公式计算由于高温或低温胁迫而产生的外渗，称为伤害度。
伤害度（%）= （ – ）/ （1）×100%
式中：——处理叶片的相对电导度；——对照叶片的相对电导度。
实验八、植物光合速率的测定

I. 1便携式光合作用测定系统
一、原理：
1. 测定2和H2O的值是通过测定参比气体（进入叶室气体中的2和H2O浓度）和流出叶室气体中的2和H2O浓度（分析气）的浓度差值来实现的。
2 对红外线的最大吸收波长是4.26μm.。利用这一吸收特点测定2的浓度。水蒸气压是由一个电容传感器测定的。
2. 仪器测定参数：光合速率、蒸腾速率、气孔导度、叶片温度、细胞间隙2浓度、大气湿度、大气温度、大气2浓度、光合有效辐射、光—光合响应曲线、2—光合响应曲线。并且可以通过这些响应曲线计算出羧化效率、表观量子产量、光补偿点、2补偿点、光饱和点、2饱和点、最大再生速率以及光合作用气孔限制值等一些非常有用的生理生态参数。
二、材料与设备：
1. 材料：绿色植物叶片
2. 设备：英国公司1便携式光合作用测定系统。1是以开放式气路系统原理设计的光合作用测定系统， 主要由主机和叶室两部分组成。
三、操作步骤：
◆打开前，请进行以下检查：
1. 如果与叶室连用，在打开电源之前要确定叶室与1系统是否正确连接，如果正确连接，开机后1系统会自动检测。
2. 检查吸收管中的化学试剂，必要时应更换（参考吸收管和化学试剂的环境条件部分）。
◆正式开机操作：
第一步： 打开1系统电源：大约7秒钟后显示主菜单（如果显示 或 请查阅错误信息部分）：
1 2 CAL 3
4 5 6

第二步：按1键[]后，显示：
1：
2：

第三步：选2键[]后，显示：
1 ：M 2：001
：300

第四步：当屏幕显示如上时，按Y键后，显示：
1：（）
2： 99.9

第五步：按2键后，屏幕显示为：

1：（）
2： ??.?

第六步：设置好测量叶面积后，按Y键进入测量状态，屏幕显示：

C Q
H T

C ： 为参比2浓度，以为单位（0000~2500）；
：为分析气与参比气2浓度差值，以为单位；
Q ： 为光量子通量密度，以µ·2·1为单位（0000~2500）；
H ： 为参比水蒸气压，以毫巴为单位（00.0~75.0）；
为分析气与参比气水蒸气压之间的差值，以毫巴为单位；
T ： 为叶室温度，以℃为单位。
第七步：选X键，屏幕显示：
E G

E 为蒸腾速率，以·2·1为单位；
G 为气孔导度，以·2·1为单位；
T 为叶片温度，以℃为单位；
A 为同化速率/净光合速率，单位：µ·2·1；正值为光合速率，负值为呼吸速率。
为细胞间隙2浓度，以为单位。

1系统在测量状态下，一般平均需要1-2分钟可获得一组数据（？？个）。当屏幕显示的数据稳定下来以后，方可按记录键。此时组数据被系统完整存贮，测定结束后用专用数据传输软件将系统内存贮的数据传输到计算机里。
第八步：测定完成后，按N键返回主菜单后关机。
◆特别注意事项：
1 当处于测量状态时，不要关机，因为这有可能导致数据库指示器被破坏。
2 当处于测量状态时，按N键返回到主菜单，然后再关机。
3 如果需要清除以前记录，需在主菜单状态下，按4 键。

. 1便携式光合作用测定系统
一、原理：
1. 测定2和H2O的值是通过测定参比气体（进入叶室气体中的2和H2O浓度）和流出叶室气体中的2和H2O浓度（分析气）的浓度差值来实现的。
2 对红外线的最大吸收波长是4.26μm.。1利用这一吸收特点测定2的浓度。水蒸气压是由一个电容传感器测定的。
2. 仪器测定参数：光合速率、蒸腾速率、气孔导度、叶片温度、细胞间隙2浓度、大气湿度、大气温度、大气2浓度、光合有效辐射、光—光合响应曲线、2—光合响应曲线。并且可以通过这些响应曲线计算出一系列非常有用的生理生态参数。
二、材料与设备：
1. 材料：绿色植物叶片
2. 设备：英国公司1便携式光合作用测定系统。1是以开放式气路系统原理设计的光合作用测定系统， 主要由主机和叶室两部分组成。
三、操作步骤：
◆打开1前，请进行以下检查：
1. 如果1与叶室连用，在打开电源之前要确定叶室与1系统是否正确连接，如果正确连接，开机后1系统会自动检测。
2. 检查吸收管中的化学试剂，必要时应更换（参考吸收管和化学试剂的环境条件部分）。
◆正式开机操作：
第一步： 打开1系统电源：大约7秒钟后显示主菜单（如果显示 或 请查阅错误信息部分）：
1 2 3 CAL
4 5 6

第二步：按1键[]后，显示：
1： 2：
3： 4：

第三步：选3键[]后，显示：
1：
2： 3：

第四步：选1键[]或3键[]后，显示：
1 ：M 2：0
3 ：I 4：195

第五步：当屏幕显示如上时，按Y键后，显示：
1：0.30 2 ：
3T：0.14 4A：002.5

第六步：按Y键后，屏幕显示为：

1P：：01 B：12.5
2Z：1 3Q：0 820

第七步：按1键后屏幕显示：

1P：？？：01 B：12.5
2Z：1 3Q：0 820

第八步：设置好自己的“小区编号”，并按Y键后进入【预热、调零】并进入测量：

C Q
H T

C ： 为参比2浓度，以为单位（0000~2500）；
：为分析气与参比气2浓度差值，以为单位；
Q ： 为光量子通量密度，以µ·2·1为单位（0000~2500）；
H ： 为参比水蒸气压，以毫巴为单位（00.0~75.0）；
为分析气与参比气水蒸气压之间的差值，以毫巴为单位；
T ： 为叶室温度，以℃为单位。
选
键，屏幕显示：
E G

E 为蒸腾速率，以·2·1为单位；
G 为气孔导度，以·2·1为单位；
T 为叶片温度，以℃为单位；
A 净光合速率，单位：µ·2·1；正值为光合速率，负值为呼吸速率。
为细胞间隙2浓度，以为单位。
1系统在测量状态下，一般平均需要1-2分钟可获得一组数据。当屏幕显示的数据稳定下来以后，方可按记录键。此时组数据被系统完整存贮，测定结束后用专用数据传输软件将系统内存贮的数据传输到计算机里。
第九步：测定完成后，按N键返回主菜单后关机。
◆特别注意事项：
1 当1处于测量状态时，按N键返回到主菜单，然后再关机。否则可能导致数据库指示器被破坏。
2 如果需要清除以前记录，需在主菜单状态下，按5 键。