新型鸭病毒性肝炎病毒PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,-,*,1.1 DHV,的历史与分布,鸭肝炎病毒,(DHV),包括三个血清型，分别引起,型,型和,型鸭病毒性肝炎。其中,型鸭病毒性肝炎呈世界性分布。我国流行的鸭病毒性肝炎主要为,型鸭病毒性肝炎，近年来陆续有新型鸭病毒性肝炎发现三个型之间无抗原相关性，没有交叉保护和交叉中和作用。,DHV,最早发现是在,1945,年由,Levine,在美国发现了,型鸭病毒性肝炎。该病呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法国、日本、美国和埃及等地流行、在我国广东、北京、浙江、福建、四川、安徽、广西、江苏、山东等地相继发生该病、目前几乎世界范围内主要养鸭地区均存在该病，给养鸭业带来了巨大的经济损失。,1,-,型鸭病毒性肝炎是,1958,年首先爆发于英格兰诺福克鸭场，其他地区未见本病的报道。,型鸭病毒性肝炎是,1969,年首次发现于美国纽约长岛地区。,1999,年，苏敬良等和黄安国等在北京和广西等地在,3,13,日,龄疑似鸭肝炎的北京鸭和樱桃谷鸭上分离到两株与,I,型和,III,型,DHV,无血清学交叉免疫反应的,DHV,，认为出现了新的血清型，并将其命名为新型鸭肝炎病毒。新型鸭病毒性肝炎的基因组与,I,型结构相似，但比,I,型,DHV,基因组稍大。同时，发现高变区主要存在于,VP1,和,VP3,基因、在,VP1,VP3,基因上存在多个,T,细胞抗原表位和,B,细胞抗原表位，,VP1,基因的变异致使不同血清型,DHV,抗原性发生改变。,2,-,1.2 DHV,的生物学特征,2006,年,Kim M C,报道了,I,型,DHV,的全基因组序列，,2007,年,Tseng C H,报道了,DHV-1,型变异株全基因组序列，为,DHV,的研究做出了新的突破。,DHV,与其他小,RNA,病毒相比，,DHV,基因组具有一些特殊的结构特征,TsengC H,等建议将,I,型,DHV,归为小,RNA,病毒科一个新的独立的属。,T.Yun,等构建出了具有感染性的,DHV,全长,cDNA,克隆，为进一步揭示,DHV,基因组的结构和功能及防控该病提供了良好的技术平台。,I,型,DHV,基因组大小约为,7,690nt,编码,2,249aa,、具有一个较大的开放阅读框,(ORF),，在基因组,RNA,两端各有一段保守的非编码区,I,型,DHV,全基因组结构依次为,:5UTR(626nt)-VPO-VP3-VPl-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3UTR(314nt),5UTR,内含有病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点,(IRES),3,-,I,型,DHV,的,IRES,己报道具有,8,个茎环结构，,3,UTR,内含有病毒,RNA,复制和翻译有关的,poly(A),尾。,I,型,DHV,的,3,UTR,为,314 nt,，新型,DHV,的,3,UTR,为,366 nt,，均具有典型的小,RNA,病毒的基因组结构、,I,型,DHV,多聚蛋白具有,11,个切割位点，且具有与小,RNA,病毒相似的切割位点和保守基因序列。基因组编码区包含结构蛋白和非结构蛋白，分为,3,种初级前体分子,P1,P2,P3,其中，,P1,前体蛋白裂解为组成病毒衣壳蛋白,VP0,VP3,和,VP1,，,3,种结构蛋白。,P2,和,P3,构成病毒的非结构蛋白。,P2,编码,2A1,2A2,2A3,2B,和,2C 3,种非结构蛋白，,P3,编码,3A,3B,3C,和,3D 4,种非结构蛋白。,4,-,2.1,非编码区,I,型,DHV,基因组,5UTR,长,626 nt,内含病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点,(IRES),。在各病毒属不同血清型之间，小,RNA,病毒,IRES,元件的序列和二级结构具有保守性，是病毒存活所必需的。小,RNA,病毒的,IRES,分为,3,个型，,I,型,IRES,的病毒包括肠道病毒属和鼻病毒属，心脏病毒属、口疮病毒属，双埃柯病毒属的,IRES,属于,II,型,IRES;,甲肝病毒属的,IRES,属于,III,型,IRES,。通过对,I,型,DHV,的,RNA,级结构预测表明，,I,型,DHV,的,5UTR,可能含有,II,型,IRES,的颈环结构而没有,I,型的三叶草结构，,5,-,据此推断,I,型,DHV,的,5,UTR,区域会形成,II,型的,IRES,I,型,DHV,的,3,UTR,长为,314-317nt,，新型,DHV,长,366nt,，这在小,RNA,病毒基因组中是最长的。有学者报道,I,型,DHV,的,3,UTR,形成了,5,个发夹结构，参与病毒的复制，但它是否与宿主特异性有关还需进一步研究。病毒的,3,端,poly(A),尾作为病毒,RNA,的负链合成起始位点，其长度与负链,RNA,的合成效率及病毒,RNA,的感染能力有关。,6,-,2.2,编码区,DHV,包含一个大的,ORF,，编码一个多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中不断被自身编码的蛋白酶水解，从而分解成,P1,、,P2,和,P3,产物，,P1,、,P2,和,P3,又进一步分别分解为,VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D,、,I,型,DHV,的多聚蛋白的切割位点预测的结果是,:VP0/VP3,和,3C/3D,的切割位点为：,Q/G;2A3/2B,2B/2C,2C/3A,3A/3B,以及,3B/3C,的切割位点为,Q/S,；,VP3/VP1,的切割位点为,Q/M,。多聚蛋白水解产生的多肤数量主要由以下因素决定,:,(1),基因组是否存在,L,蛋白。,(2)VP0,是否水解为,VP4,和,VP2,。,(3)2A,蛋白的数量。其也是小,RNA,病毒的基因组在 不同的种属之间存在的差异所在。,7,-,小,RNA,病毒的基因组在不同的种属间虽然存在差异，但是在病毒复制过程中具有相似的功能、,L,蛋白作为前导蛋白,;2A,是蛋白酶，参与多聚蛋白早期切割和宿主蛋白的合成关闭,;2B,蛋白作为宿主范围的决定因子,;2C,蛋白是小,RNA,病毒中的保守序列，与病毒,RNA,合成相关,;3A,蛋白与病毒毒力有关,;3B,蛋白即,VPg,，是共价结合于正链和负链,RNA 5,末端的蛋白引物,;3C,蛋白构成大部分多聚蛋白，,3C,蛋白在病毒加工处理过程和,RNA,复制中产生，具有水解多聚蛋白活性，并且具有一个半胱氨酸作为亲核作用的活性位点,.3D,蛋白是,RNA,依赖的,RNA,聚合酶。,8,-,2.2.1,结构蛋白,:,P1,区编码病毒的壳体蛋白，包括,VP0,VP3,VP1,基因，核苷酸序列全长,2193 nt,、,I,型,DHV VP0,的,N,末端缺少,GxxxS/T,基因序列，因此其,N,末端可能未被十四烷基化，,VP0,不被蛋白酶切割为,VP2,和,VP4,。试验证明，壳体蛋白含有多个类似于其他小,RNA,病毒的核心结构，即八链反向平行,桶结构，与其相连的环形结构位于壳粒表面，这在免疫学中占有重要作用。,I,型,DHV,的,VP3,与人肠道病毒,(Humanparechovirus,HPeV),一样，,N,一末端有一段残基丰富区延伸出来，长度约,20aa,这段区域在,HPeV,中具有很强的免疫原性但它在,I,型,DHV,是否也具有同样的功能还未见报道。,9,-,(1)VPl,基因,:,小,RNA,病毒中,VP1,蛋白作为主要的宿主保护蛋白，具有特异性抗原中和位点，,VP1,蛋白多暴露于病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分，它能够诱导动物产生中和抗体。,I,型,DHV,与其他小,RNA,病毒之间衣壳蛋白的氨基酸序列差异主要存在于,VP1,的两端。何内娅通过对华南地区分离到的,I,型和新型,DHV,的,VP1,氨基酸序列比对分析表明,:VP1,包括了大部分的插入与缺失片段和高变异区，高变区主要分布在,46-64,95-149,180-223,位，尤其是,C,末端，存在点突变或连续变异。在第,145-146,位，,15,株新型,DHV,毒株比,3,株,I,型,DHV,多,2,个氨基酸,(G,和,G),。,I,型,DHV,和新型,DHV,的,VP1,蛋白不存在小,RNA,病毒科保守的,RG D,基序,(Arg-Gly-Asp(RGD),而,I,型,DHV,相应序列为,SGD,，而新型,DHV,为,QSD,，这表明,DHV,的病毒吸机制和复制能力存在差异还有待于进一研究。,10,-,(2)VP3,基因,:,VP3,蛋白的,N,末端具有免疫原性，,VP3,的,N,端以及连接,链的环，特别是,B-C,E-F,及,G-H,环的序列差异显著、何内娅通过对华南地区分离到的,I,型和新型,DHV,与参考毒株进行,VP3,基因的变异分析，结果显示，,I,型,DHV,和新型,DHV,的,VP3,基因不同点在于,:,第三位,I,型,(R),新型,(K),，第,15,位,I,型,(N),新型,(S)(,除了台湾新型,),，第,20,位,I,型,(P),新型,(S),，第,22,位,I,型,(V),新型,(I),，第,39,40,位,I,型,(IA),新型,(VT),，第,45,、,69,位,I,型,(T,I),新型,(A/V,V),，第,78,位第,107,位为,I,型和新型,DHV,变异最多处，第,125,126,位,I,型,(MT),新型,(LL),，第,143,到第,234,位,I,型和新型,DHV,存在不连续的多位点不同，这些变异区是否影响,I,型和新型,DHV,的致病机理有待于进一步研究,。,11,-,2.2.2,非结构蛋白,:,(1)P2,非结构蛋白,:,小,RNA,病毒中，,P2,区长,2271nt,I,型,DHV,推测具有多达,3,种不同的,2A,蛋白，分别是,2A1,2A2,和,2A3,以及,2B,2C,。,DHV,的,2A2,蛋白是小,RNA,病毒多聚蛋白中的,1,个新蛋白，由,161aa,组成，可能参与病毒与宿主细胞之间相互作用，推测与病毒复制有关。,2A3,蛋白由,124aa,组成，含有,3,个结构域。,2A3,蛋白可能在控制细胞生长方面起作用，目前关于小,RNA,病毒,2B,和,2C,蛋白的具体功能还不清楚。,12,-,(2)P3,非结构蛋白,:,P3,区编码,4,种非结构蛋白，分别是,3A,3B,3C,和,3D,。据报道，小,RNA,病毒科的病毒,3A,蛋白与病毒毒力有关。,3BVPg,蛋白包含,34,个,as,，这在小,RNA,病毒中是最大的,3B,蛋白，并且与其他小,RNA,病毒的,3B,蛋白序列一致性很低，,DHV,的,L(,亮氨酸,),被小,RNA,病毒,KP,基序中的,K(,赖氨酸,),所取代，但是该蛋白第,3,位酪氨酸,Tyr(Y),残基却很保守，它在,VPg,与基因组,5,末端尿嘧啶的附着过程中起重要作用。,DHV,的,3C,蛋白酶是催化裂解小,RNA,病毒多聚蛋白中非结构蛋白部分的关键酶，具有丝氨酸蛋白酶和半肤氨酸蛋白酶双重特性，病毒编码的,3C,蛋白酶完成多聚蛋白的大多数切割，通常发生在谷氨酞胺和甘氨酸之间的肤键,(Gln-Gly),最终产生,11,个终末产物。,DHV,的,3D,蛋白是依赖,RNA,的,RNA,聚合酶,(RNA-dependent RNA polymerase),3D,蛋白在病毒,RNA,复制中起主导转录及复制作用。,13,-,2.,新型鸭病毒性肝炎病毒巢式,RT-PCR,检测方法的建立及应用,近年来，,DVH,在世界各地不断发生，其发病率和死亡率均呈上升趋势，养鸭比较集中的地区均遭受了巨大的经济损失和严重的威胁，由于新型鸭病毒性肝炎病毒,(N-DHV),的存在，许多地区频频出现,I,型鸭病毒性肝炎病毒,(DHV-I),免疫鸭群暴发鸭肝炎的报道，严重制约了养鸭业的发展，不少学者己从发病鸭群中分离到工型鸭肝炎病毒的变异株,(,新型毒株,N-DHV),2007,年，有学者先后证实新型,DHV,也具有典型的,DHV I,基因组结构，但其与,DHV-I,在序列上存在显著差异，且新型,DHV,均不与,DHV-I,产生交叉反应。因此，加强,N-DHV,病原诊断技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重要的现实意义。本试验选取新型,DHV,与传统工型,DHV,差异序列区设计引物，建立了,N-DHV,检测的逆转录巢式,PCR,方法，旨在为新型鸭病毒性肝炎的早期诊断、流行病学调查等提供一种有效的分子生物学检测方法。,14,-,2.1,材料和方法,2.1.1,病毒,N-DHV,、,DHV-,、鸭病毒性肠炎病毒,(DEV),、鸭细小病毒,(DPV),、新城疫病毒,(NDV),、传染性法氏囊病毒,(IBDV),均由本实验室分离并保存。,2.1.2,主要试剂,Trizol,、,M-MLV,反转录酶、,Ribonuclease Inhibitor,购自生工生物工程,(,上海,),有限公司,;Ex Taq,酶、,pMD18-T,克隆载体及其他限制性内切酶均购自宝生物工程,(,大连,),有限公司,;,质粒,DNA,提取试剂盒与胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。,15,-,2.1.3,引物的设计与合成,根据己发表的,N-DHV,基因组序列，选取,N-DHV,与,DHV-I,差异序列区设计引物，利用生物学软件设计合成了,2,对引物，引物序列如下,:,第,1,轮扩增引物,:,上游引物,:ygpl 5-TUTUCCTUAUAAUCUUUATA-3;,下游引物,:ygp2 5-CCUAAAUTUUAUATTAUUTG3;,第,2,轮扩增引物,:,上游引物,:ygp3 5-CAUCCACAUCCAUCUACAACr3;,下游引物,:ygp4 5-TTUCTCTUCUUTATCCTUCC-3,。,2.1.4,病毒基因组,RNA,的提取,按,Trizol,试剂使用说明提取,N-DHV,基因组,RNA,，并提取其他几种病毒的,DNA,或,RNA,。,16,-,2.1.5 RT-PCR,反应,2.1.5.1,反转录合成,cDNA,反转录反应按,20L,体系操作，反转录条件为,42,作用,60 min,后，,95 5 min,灭活反应。,2.1.5.2 PCR,反应最适模板用量的确立,分别以,2,4,6,8,10,12L,反转录,cDNA,为模板，保持其他试剂浓度及反应条件不变，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳模板用量。,2.1.5.3 PCR,反应最适引物用量的确立,在,50L PCR,反应体系中分别加入不同用量的引物，上下游引物,(20 mol/L),分别入,0.1,0.3,0.5,0.7,1,1.2L,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳引物用量。,17,-,2.1.5.4 PCR,反应最适退火温度的确立,PCR,反应的退火温度分别取,50,52,54,56,58,，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳退火温度。,2.1.5.5,第,1,轮,PLR,扩增反应,PCR,反应按,50L,体系进行，根据本试验确定的最适模板用量为,10L,，最适引物用量为,0.5L,，最适退火温度为,54,，确定,PCR,反应体系为,:0.5L Ex Taq(5 U/L),、,5 L 10 X Ex Taq Buffer 5L dNTP(2.5mmol/L,）、上下游引物,ygp1,、,ygp2,（,20mo1/L),各,0.5,、,10L cDNA,，加水至,50L,。,PCR,反应条件为,:944 min;94 45s,、,54 45s,、，,72 60s,、,30,个循环,;72 10 min,。,18,-,2.1.5.6,第,2,轮,PCR,扩增反应,PCR,反应按,50L,，体系进行，模板为第,1,轮,PCR,产物,1L,，最适引物用量为,0.5L,，最适退火温度为,5 4,，确定,PCR,反应体系为,:0.5 LEx Taq(5 U/pL),、,5 L 10XEx Taq Buffer 5LdNTP(2.5 mmol/L),、上下游引物,ygp3,、,ygp4(20 mol/L),各,0.5L,，加水至,50L,。,PCR,反应条件同,2.1.5.5,19,-,2.6,扩增产物的检测及鉴定,首先取扩增产物,5L,在,10 g/L,二的琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。然后用,DNA,凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与,pMD18-T,克隆载体于,4,过夜连接，转化感受态菌株,DH5,。挑取单个的转化菌落，加,LB,溶液培养,12 h,后用质粒提取试剂盒抽提质粒,DNA,，利用,EcoR,/Hind,双酶切鉴定，阳性的克隆送生工公司进行测序鉴定。将测序结果与,N-D H V,毒株序列进行同源性比较,。,2.7 PCR,特异性试验,分别提取,N-DHV,、,DHV-,NDV,IBDV,、健康鸭肝组织的,RNA,DEV,、,DPV,的,DNA,，用己建立的方法进行扩增。,20,-,2.8 PCR,敏感性试验,N-DHV,标准毒株提取,RNA,后定量，然后,10,倍梯度稀释提取的病毒基因组,RNA,，使其分别相当于含有,10,、,1,、,0.1 L,、,10,、,1,、,0.1,、,0.01pg RNA,的含量，分别进行,RT-PCR,检测，确定其敏感性。在第,2,轮,PCR,中，利用上而不同的病毒,RNA,浓度进行的,RT-PL R,产物,1 L,为模板，进行巢式,PCR,检测，反应程序不变，确定巢式,PCR,的敏感性。,2.9 PCR,重复性试验,用建立的巢式,RT-PCR,检测方法，对,N-DHV,、,DHV-I,、,NDV,、,IBDV,、,DEV,、,DPV,、健康鸭肝组织及检测为新型鸭病毒性肝炎阳性病料,3,份和阴性病料,3,份，重复检测,3,次，以验证本方法的重复性和稳定性。,21,-,2.10,初步应用,临床样品检测,取疑似送检病料,21,份，利用建立的,RT-PCR,检测方法进行检测，对扩增产物全部进行测序鉴定，并利用生物学软件进行序列分析。,22,-,3.,实验结果,3.1,扩增产物的检测及鉴定,3.1.1,扩增产物的检测,PCR,扩增产物经过,10g/L,二琼脂糖凝胶电泳，第,1,2,轮扩增产物在位于,706,、,502 bp,处可见特异性,DNA,扩增条带，与预期大小相符。,M,：,DL2000 DNA Markcr,1,、,4,：是,2,对引物的空白对照,2,：第,1,轮扩增的,PCR,产物,3,：第,2,轮扩增的,PCR,产物,23,-,3.1.2,克隆载体的酶切鉴定,扩增产物连接到,pMD18-T,克隆载体上，根据病毒基因组的序列结构，利用,EcoR,和,Hind,进行双酶切鉴定。,M,：,DL200CDNA Markcr,1,2,：第,1,2,轮扩增产物重组质粒的,EcoR,和,Hind,的双酶切产物,24,-,3.1.3,扩增产物的测序鉴定,挑取双酶切鉴定正确的阳性菌液送生工公司测序。,DNA,测序结果表明，插入到,T,载体的基因片段的核普酸序列为,N-DHV,。,3.2,特异性试验结果,利用设计的第,1,轮引物对,N-DHV,扩增出了,706 bp,的目的基因片段，而,DHV-,、,NDV,IBDV,、健康鸭肝组织、,DEV,DPV,均未扩增出目的片段,(,图,3),。取,PCR,产物各,1 L,为模板，利用第,2,轮引物进行巢式,PCR,检测，结果,N-D H V,出现,502bp,的扩增产物，而,D H V-,、,NDV,、,IBDV,、健康鸭肝组织、,DEVDPV,均未扩增出目的片段,(,图,4),。,25,-,第,1,轮扩增的特异性试验,M,：,DL2000 DNAMarKer,1:N-DHV,2:DHV-,3:NDV,4:IBDV,5:,健康鸭的肝组织,6.DEV,7.DPV,（图,3,）,第,2,轮扩增的特异性试验,M.:DL2000 DNAMarker,1:N-DHV;,2:DHV-;,3:NDV,4:IBDV,5.,健康鸭肝组织,6.DEV,7.DPV,（图,4,）,26,-,3.3,敏感性试验结果,2,种引物敏感性试验的,PCR,产物取,5L,经,10 g/L,二琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约,706,502 bp,附近出现特异性条带，与各自的预期产物大小相符。从结果可以看出第,1,轮引物的,RT-PCR,检测灵敏度可以达到,10 pg RNA,，而第,2,轮引物的,RT-PCR,检测灵敏度可以达到,0.1 p RNA,。,27,-,第,1,轮扩增的敏感性试验,M,：,DL2000 DNAMarKer,17,：,10,、,1,0.1L,、,10,、,1,、,0.1,、,0.01pg RNA,第,2,轮扩增的敏感性试验,M,：,DL2000 DNAMarKer,17,：,10,、,1,0.1L,、,10,、,1,、,0.1,、,0.01pg RNA,28,-,3.4,重复性试验结果,经过,3,次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定可靠的。,3.5,临床样品检测结果,用建立的,N-DHV,巢式,RT-PCR,检测方法，共检测了,21,份在不同地采集的鸭病料。检出阳性样品,3,份，对阳性样品,PCR,产物全部进行克隆与序列分析，结果均为,N-DHV,。,29,-,4.,讨论,由于,N-DHV,在自然条件下感染成年鸭后，感染者可长期带毒和排毒而不出现临床症状，在这些情况下，病鸭组织中病毒含量较低，而且组织样品中因含有大量的蛋白和脂类等可能会影响,PCR,扩增，将反转录产物直接用于,PCR,扩增很难见到扩增片段。巢氏,PCR(nested PCR),是,PCR,的一种改良模式，是指利用,2,对,PLR,引物进行,2,轮,PCR,扩增反应。首先对靶,DNA,进行第,1,步扩增，然后从第,1,次反应产物中取出少量作为反应模板进行第,2,次扩增，第,2,次,PCR,引物与第,1,次反应产物的序列互补，第,2,次,PCR,扩增的产物即为目的产物。,30,-,由于巢式,PCR,反应有,2,次,PCR,扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性,;,又有,2,对,PCR,引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。巢式,RT-PCR,技术通过反转录产物的,PCR,和巢式,PCR,的,2,次扩增，首次反应产物的转移有助于稀释掉那些最初可能存在于样品中的抑制物，大大提高了检测的灵敏度，避免了样品检测过程中的假阴性问题。巢式,RT-PCR,技术具有敏感性高、特异性强、快速高效等特点，为鸭病毒型肝炎的早期诊断提供了新的模式。,本试验参考,UenBank,中己发表,DHV-I,和几株,N-DHV,的基因组序列，经过多重序列 比对分析。选取,DHV-I,与,N-DHV,序列变化差异明显区设计合成,2,对新型鸭病毒性肝炎的特异性引物，建立了,N-DHV,检测的巢式,RT-PCR,检测方法，,31,-,该方法只对,N-DHV,能够特异性地扩增出,706 bp,和,502 bp,的目的片段，而对,NDV,、,IBDV,、,DEV,、,DPV,的扩增结果均为阴性，具有良好的特异性，该方法第,1,次扩增的敏感性为,10 pg,，第,2,次扩增的敏感性达到,0.1Pg,，敏感性提高了,100,倍，具有良好的敏感性。在,21,份临床样品的检测过程中，利用第,1,轮,RT-PCR,检测出阳性样品,2,份，而利用巢式,RT-PLR,检测时可以检出阳性样品,3,份，将所有阳性样品的,PCR,产物进行测序后，序列分析结果显示均是,N-D H V,，说明建立的巢式,RT-PLR,检测方法更为敏感、特异，可以用于原始病料中,N-DHV,的快速低含量检测，显示出了良好的应用前景。因此，本研究建立的巢式,RT-PCR,方法将为国内新型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查等提供一种简单快速的分子生物学诊断方法。,32,-,鸭 病 毒 性 肝 炎 与 鸭 瘟,鸭病毒性肝炎是引起雏鸭传播迅速和高度致死的传染病，病原为鸭肝炎病毒。鸭病毒性肝炎有,3,种血清型，在我国流行的主要为,I,型,。,一般多发于,1,5,周龄的雏鸭,对成年鸭没有影响。,对氯仿、乙醚、胰蛋白酶和,pH,值,3,的环境均有抵抗力。在,56,加热,60,分钟仍可存活，但加热至,62,，,30,分钟即被灭活。病毒在,1%,福尔马林或,2%,氢氧化钠中,2,小时、在,2%,漂白粉溶液中,3,小时、,0.2%,福尔马林,37,，,30,分钟均可使病毒灭活。,鸭瘟是由鸭瘟病毒引起的急性、高度死亡率的传染病，又称为鸭病毒性肠炎，俗称“大头瘟”鸭瘟病毒是疱疹病毒，病毒粒子呈球形。,病毒对外界抵抗力不强,。病毒对乙醚和氯仿敏感。病毒在,pH,值,7,9,时，经,6,小时不减低毒力，在,pH,值,3,和,11,时，病毒迅速灭活。各,种年龄和品种的鸭均可感染，但鸭瘟流行时，成年鸭发病和死亡较严重，,1,月龄以下的雏鸭发病较少。,本病于全年各季均可发生，但以春夏之交和秋季最易流行。本病主要通过消化道传播，也可通过交配、眼结膜和呼吸道而传播。,33,-,