SN∕T 3498-2013 温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉犘 犾 犲 狊 犻 狅 犿 狅 狀 犪 狊 狊 犺 犻 犵 犲 犾 犾 狅 犻 犱 犲 狊犳 狉 狅 犿犌 犪 狉 狉 犪 狉 狌 犳 犪 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国四川出入境检验检疫局、 四川农业大学、 中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。本标准主要起草人： 余华、 杨光友、 王昱、 严玉宝、 李应国、 岳川、 刘洋洋、 陈世界、 周岷江、 胡娟、崔鹏博。犛 犖犜 温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范范围本标准规定了温泉鱼类志贺邻单胞菌病的检疫技术规范。本标准适用于温泉鱼类志贺邻单胞菌病的临床诊断和分离鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法临床诊断 临床症状鱼群出现厌食或不吃食； 病鱼静止不动或阵发性乱游、 乱窜， 或在池边摩擦， 最后衰竭而死； 鱼体出现体色异常， 呈现黑色； 死鱼有较明显的出血症状。 病理变化病鱼鳍条基部及鱼体两侧轻度充血， 体表侧线两侧出现白斑或溃疡斑， 随着病情的加重， 斑的颜色逐渐变深， 严重病情时斑的颜色呈现黑色； 鳃盖周围有出血点或出血斑； 鳃、 肝、 肾的颜色均较淡， 呈现灰白色； 肝脏出现出血点， 胆囊肿大； 腹腔内积有腹水， 腹水呈淡黄色透明或红色浑浊； 肠道出血或肠壁变透明， 可见肠内容物。疫病的详细描述参见附录。分离鉴定 设备和器械 生物安全柜。 普通光学显微镜。 高压灭菌锅。 恒温培养箱（ ） 。 解剖器械。 全自动生化鉴定系统。 培养基和试剂以下所用的试剂， 除特别注明者外均为分析纯试剂； 水为符合 规定的二级水。 普通营养琼脂平板， 制备见附录的 。犛 犖犜 革兰氏染色液， 配制见 。 培养基， 配制见 。 试剂， 配制见 。 市售触酶试剂。 市售氧化酶试剂。 糖发酵试验管， 配制见 。 诊断纸片， 制作见 。 市售生化鉴定管（ 具体名称见附录） 。 类志贺邻单胞菌的分离和鉴定 样品采集挑选 尾濒死的或带有上述症状的温泉鱼， 使用无菌水冲洗体表后， 用 的酒精棉球擦拭体表， 无菌操作解剖发病温泉鱼， 采用接种环从病鱼出血点或出血斑处、 肝脏、 脾脏和肾脏蘸取渗出物。 分离和纯化接种环划线接种到普通营养琼脂平板培养基， 恒温培养 。挑取数个可疑单菌落， 划线培养于普通营养琼脂平板上， 恒温纯化培养 。类志贺邻单胞菌于普通营养琼脂平板的纯菌落生长良好， 形成边缘整齐、 表面湿润、 中央隆起、 光滑、 半透明、 灰白色至淡黄色的圆形菌落。 鉴定 染色镜检挑取疑似菌落涂片到干净的玻璃载玻片， 在酒精灯火焰上方固定， 滴加结晶紫染色液， 染 ， 水洗； 滴加革兰氏碘液， 作用 ， 水洗； 滴加 乙醇脱色， 约 （ 或将乙醇滴满整个涂片， 立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片， 脱色 水洗； 滴加沙黄复染液， 复染 ； 水洗， 风干， 镜检。志贺邻单胞菌为革兰氏阴性直杆菌， 两端圆润， 染色呈红色。 初步生化试验 氧化酶试验挑取少许单菌落涂抹于无菌的白色的滤纸片上， 滴加盐酸四甲基对苯二胺（ 或商品化） 氧化酶试剂于菌落之上， 呈深紫色到暗绿色为阳性， 否则为阴性。 触酶试验挑取少许单菌落涂抹于干净的载玻片上， 滴加 滴 过氧乙酸（ 或商品化） 触酶试剂， 出现大量气泡者为阳性， 否则为阴性。 运动性和吲哚试验取氧化酶、 触酶阳性菌落穿刺接种 培养基， 培养 ， 观察。细菌沿穿刺线向两侧扩增者为具运动性， 否则为不具运动性； 往管中加入数滴三氯甲烷（ 此时不要与火接触） ， 后再向管中加数滴 试剂， 出现红色者为吲哚阳性， 否则为阴性。 糖发酵试验挑取吲哚阳性， 有运动活性的可疑菌落少许。分别接种葡萄糖、 麦芽糖发酵管（ 见 ） 。 培犛 犖犜 养 。凡试验管颜色从紫色变为黄色， 表明细菌可发酵该种糖类， 则判为阳性。 犗 敏感性试验挑取发酵葡萄糖、 麦芽糖的可疑菌落接种营养肉汤， 培养 。用无菌玻棒将待检菌菌悬液均匀涂布于营养琼脂平板上， 将 诊断纸片贴于平板上， 置 孵育 ， 观察结果。出现抑菌圈者表示敏感， 无抑菌圈者为耐药。 确认试验将上述试验结果均为阳性的菌株， 接种到营养琼脂平板（ 或斜面） 。 培养 后， 取适量利用全自动生化鉴定仪（ 或同类设备） 进行鉴定。操作方法参照仪器说明书。若无全自动生化鉴定仪， 则对照附录依次进行生化试验。 结果判定结果判定如下：）若确认试验采用全自动生化鉴定仪（ 或同类设备） ， 结果以生化鉴定仪的检测报告为准；）若确认试验采用生化鉴定管进行附录中的生化鉴定项目， 至少符合星号（） 标示的全部生化特征， 则为类志贺邻单胞菌阳性， 否则为类志贺邻单胞菌阴性；）若非星号（） 标示的生化项目只是部分符合， 则判定为可疑， 进行重复试验仍为可疑， 则进行基因测序或用全自动生化鉴定仪检测加以确认。综合判定如果出现典型临床症状和病理变化， 且分离出类志贺邻单胞菌， 则诊断为“ 温泉鱼类志贺邻单胞菌病” 。若临床症状、 病理变化不显著， 但分离出类志贺邻单胞菌， 则报告为“ 检出类志贺邻单胞菌” 。否则为阴性。犛 犖犜 附录犃（ 资料性附录）疫病概述温泉鱼学名淡红墨头鱼（犌 犪 狉 狉 犪 狉 狌 犳 犪） ， 又名“ 小鱼医生” ， 为鲤科（ ） 、 墨头鱼属（犌 犪 狉 狉 犪） 的鱼类。其身长 ， 适应水温为 ， 而 的热水比较理想。其最大的特点是喜欢以浮游生物或动物身体上的附着生物为食。该鱼种是从土耳其引进的热带鱼种， 把该鱼放在温泉浴池里， 让其啄食人的死皮和一些皮肤上的细菌， 可以治疗皮肤病， 因此被誉为治疗诸如牛皮癣等皮肤病的法宝。温泉鱼类志贺邻单胞菌病， 是由类志贺邻单胞菌（犘 犾 犲 狊 犻 狅 犿 狅 狀 犪 狊 狊 犺 犻 犵 犲 犾 犾 狅 犻 犱 犲 狊） 引起的一种温泉鱼细菌性败血症。类志贺邻单胞菌为肠杆菌科邻单胞菌属唯一记录亚种， 为革兰阴性直杆菌， 短圆状， 长 ， 宽 ， 兼性厌氧， 无芽孢， 通常具运动性。菌落呈灰白色、 不溶血， 中等大小。可成双或短链状排列， 有根根极端鞭毛， 运动活跃。氧化酶和触酶阳性， 硝酸盐还原阳性， 发酵葡萄糖和其他一些糖类产酸不产气。生长温度范围广， 可在 生长， 在的 中可生长， 范围为 ， 绝大多数菌株对 敏感。类志贺邻单胞菌是感染性腹泻及食物中毒的病原体。主要存在于自然界的水体和土壤中， 也见于鱼和其他水生动物以及各种哺乳动物和人类的肠道， 可以引发人类的腹泻、 食物中毒和哺乳动物等疾病。其感染主要与食入生的海产品有关， 流行季节以夏季为主， 症状表现为短期的水样腹泻或病程较长的痢疾样腹泻， 感染人群无年龄差别。也多见于机体抵抗力下降的人群， 主要引起败血症和脑膜炎， 感染几率低， 但死亡率很高。温泉鱼类志贺邻单胞菌病的典型临床症状是， 温泉鱼鱼群出现厌食或不吃食； 病鱼静止不动或阵发性乱游、 乱窜， 或在池边摩擦， 最后衰竭而死； 鱼体出现体色异常， 呈现黑色； 死鱼有较明显的出血症状等。温泉鱼类志贺邻单胞菌病的典型病理变化是， 温泉鱼病鱼鳍条基部及鱼体两侧轻度充血， 体表侧线两侧出现白斑或溃疡斑， 随着病情的加重， 斑的颜色逐渐变深， 严重病情时斑的颜色呈现黑色； 鳃盖周围有出血点或出血斑； 鳃、 肝、 肾的颜色均较淡， 呈现灰白色； 肝脏出现出血点， 胆囊肿大； 腹腔内积有腹水，腹水呈淡黄色透明或红色浑浊； 肠道出血或肠壁变透明， 可见肠内容物等。犛 犖犜 附录犅（ 规范性附录）培养基和试剂的制备犅 营养琼脂平板分别称取蛋白胨 ， 牛肉膏 ， 氯化钠 ， 琼脂 ， 蒸馏水 ， 调节 ， 灭菌 备用。犅 草酸铁结晶紫染液犅 甲液结晶紫 溶于 乙醇 。犅 乙液草酸氨 溶于蒸馏水 。使用前将甲液和乙液混合。犅 革兰氏碘液碘（） 碘化钾 蒸馏水 。犅 复红酒精染液碱性复红 乙醇 犅 犛 犐 犕 培养基胰胨 ， 多价胨， 硫酸铁铵 ， 硫代硫酸钠 ， 琼脂 ， 值 。制法： 称取本品 ， 加热溶解于 蒸馏水中， 分装试管， 高压灭菌 备用。犅 犓 狅 狏 犪 犮 狊试剂对二甲基氨基苯甲醛 犛 犖犜 戊醇 浓盐酸 犅 糖发酵试验管先配蛋白胨水（ 蛋白胨 ， 蒸馏水 ， 调 至 ， 分装， 每瓶 ） 。每 蛋白胨水中分别加入葡萄糖 、 麦芽糖 ， 充分溶解， 分装试管， 高压灭菌 。犅 犗 试纸片取， 二氨基 ， 二异丙醇喋啶 ， 溶于 乙醇 二乙基乙醚（ 体积比为） 中。把 大小的滤纸片浸入该溶液后取出， 在空气中晾干， 备用。犛 犖犜 附录犆（ 规范性附录）温泉鱼类志贺邻单胞菌主要生理生化反应特征表犆 温泉鱼类志贺邻单胞菌主要生理生化反应特征项目反应类型项目反应类型葡萄糖色氨酸脱氨酶麦芽糖 丁醇 酮（ 甲基乙酰甲醇）触酶明胶氧化酶甘露醇吲哚肌醇 山梨糖醇 半乳糖苷酶鼠李糖精氨酸双水解酶蔗糖赖氨酸脱羧酶蜜二糖鸟氨酸脱羧酶苦杏仁甙西蒙斯柠檬酸（） 阿拉伯糖硫化氢 溶血素（ 牛红细胞）尿素酶注：为阳性；为阴性。标记的生理生化反应项目应同时符合。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元