1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,分光光度法原理介绍,酶抑制率法(分光光度法),蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第1页,吸光光度法:,基于物质对光选择性吸收而建立分析方法,包含目测比色法和,分光光度法,。,不一样物质因为结构不一样,所吸收光
2、波长及吸收程度不一样,这就是,物质对光选择性吸收,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第2页,当一束强度为I,0,平行单色光经过一均匀吸收介质时,因为吸光物质分子与光子作用,一部分光子被吸收,一部分光子透过介质。设透过光强度为I,t,,则,透光率,T定义为 T=I,t,/I,0,,而lgT称为,吸光度,A,即,lgT=lgI,0,/I,t,入射光 I,0,透射光 I,t,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第3页,测量某物质对不一样波长单色光吸收程度,以波长(,),为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制吸光度随波长改变可
3、得一曲线,此曲线即为,吸收光谱,。,不一样浓度同一物质,它最大吸收波长是不变,但吸光度随浓度增大而增大。,在最大吸收波优点测量吸光度,其灵敏度最高。,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第4页,有色溶液对某一波长光吸收强度与有色物质浓度c及吸光溶液液层厚度b成正比,称为光吸收定律或朗伯比尔定律,其数学表示式为,A=,bc,1.0,0.5,0,A,C,A,100,50,0,T%,T,式中:,b为液层厚度,单位为cm;c为浓度,单位为mol.L-1;,为摩尔吸光系数,单位为L.mol-1.cm-1。,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光
4、度法专家讲座,第5页,光电比色法,分光光度法(紫外-可见分光光度法)UV-VIS,Ultraviolet,Visual Spectroscopy,0.575,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,I,0,I,t,参比,样品,入射光 I,0,透射光 I,t,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第6页,原理,在一定条件下,有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功效有抑制作用,其抑制率与农药浓度呈正比。正常情况下,酶催化神经传导代谢产物(乙酰胆碱)水解,其水解产物与显色剂反应,产生黄色物质,用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间改变值,计算出抑制率,经过抑制率
5、能够判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在。,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第7页,原理,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第8页,试剂,pH8.0缓冲溶液 分别取11.9g无水磷酸氢二钾与.g磷酸二氢钾,用1000mL蒸馏水溶解。,显色剂 分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸氢钠,用20mL缓冲溶液溶解,4,冰箱中保留。,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第9页,试剂,底物:取25.0mg硫代乙酰胆碱,加3.0mL蒸馏水溶解,摇
6、匀后置4冰箱中保留备用。,乙酰胆碱酯酶 依据酶活性情况,用缓冲溶液溶解,3min吸光度改变,A,0,值应控制在0.3以上。摇匀后置4冰箱中保留备用。,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第10页,分析步骤,样品处理:选取有代表性蔬菜样品,冲洗掉表面泥土,剪成1cm左右见方碎片,取样品1g,放入烧杯或提取瓶中,加入5mL缓冲溶液,振荡12min,倒出提取液,静置35min,待用。,对照溶液测试:先于试管中加入2.5mL缓冲溶液,再加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂,摇匀后于37,放置15min以上(每批样品控制时间应一致)。加入0.lmL底物摇匀,此时检液
7、开始显色反应,应马上放入仪器比色池中,统计反应3 min吸光度改变值,A,0,样品溶液测试:先于试管中加入2.5mL样品提取液,其它操作与对照溶液测试相同,统计反应3min吸光度改变值,A,t,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第11页,结果计算,抑制率(%)=(A,0,-A,t,)/A,0,100,式中:,A,0,对照溶液反应3min吸光度改变值;,A,t,样品溶液反应3min吸光度改变值;,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第12页,结果判定,结果以酶被抑制程度(抑制率)表示。,当蔬菜样品提取液对酶抑制率50%
8、时,表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在,样品为阳性结果。,阳性结果样品需要重复检验2次以上。,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第13页,酶抑制率法对部分农药检出限,农药名称,检出限mg/kg,农药名称,检出限mg/kg,敌敌畏,0.1,氧化乐果,0.8,对硫磷,1,甲基异柳磷,5,辛硫磷,0.3,灭多威,0.1,甲胺磷,2,丁硫克百威,0.05,马拉硫磷,4,敌百虫,0.2,乐果,3,呋南丹,0.05,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第14页,说明,葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁
9、液中,含有对酶有影响植物次生物质,轻易产生假阳性。处理这类样品时,可采取整株(体)蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高蔬菜,也可采取整株(体)蔬菜浸提方法,降低色素干扰。,当温度条件低于37 C,酶反应速度随之放慢,加入酶液和显色剂后放置反应时间应相对延长,延长时间确实定,应以胆碱酯酶空白对照测试3min吸光度改变D A0值在0.3以上,即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照溶液3min吸光度改变D A0值0.3 原因:一是酶活性不够,二是温度太低。,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第15页,THANK YOU,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法分光光度法专家讲座,第16页,