细胞培养标准操作程序SOP.doc

细胞培养标准操作程序（SOP）
1．目的：
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并对的执行细胞培养的基本操作环节，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．合用范围：
合用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：
3.1  培养液、PBS、胰蛋白酶的配制
3.1.1  1000ml培养液的配制
1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充足搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充足搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已具有。
4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水        溶解 
配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水      溶解  
取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充足搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。
注意：
（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
     一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗
     水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
 3.1.2  PBS（平衡盐溶液）的配制
 NaCl 8g
 KCl 0.2g              ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ml
 Na2HPO4*H2O 1.56g
 KH2PO4 0.2g
 （1） 无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!） 
 （2） Na2HPO4*H2O 1.56g 则Na2HPO4*12 H2O需3.4888g
 （3） 如欲配制500ml，以上成分减半即可
 3.1.3  0.25%胰蛋白酶的配制
   胰蛋白酶粉          2.5g
   EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.3g
   NaCl                     8.0g
           KCl                        0.4g                             `      +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML 
 NaHCO3              0.5g
   Glucose(葡萄糖) 1.0g
   酚红                       0.06g
（1）配出来的PH值为7.6，在PH值7.6～7.8范围内，故不需调PH值。
（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。
（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可

3.2  细胞复苏
1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。
2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中（一滴约为50ul）。
3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融）
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管所有吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培养瓶放入CO2培养箱。（注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇摆几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
 注意：
（1）入细胞室前观测CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力不低于0.1mPa！
（2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达成20％。
（3）离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。
（4）滴管使用注意事项：
   a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。
   b.培养基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！
   c. FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,由于血清对胰酶活性有克制作用。
   d．胰酶和PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，但是最佳分开
（5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡因素：冻存时间太长（如2年以上），技术但是关（如吹打太剧烈）、细胞传代数太多等。
（6）关于PBS（平衡盐溶液）:
   a. PBS溶液配好后要高压灭菌后才干用；PBS高压时其瓶塞一定要插针头。
   b. PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。PBS虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。
   c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。
   d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入2～3ml PBS（防止培养瓶干燥），培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即可再用。
（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！

3.3  细胞换液
1、倒置显微镜下观测细胞生长状态：
a.移动细胞培养瓶时，观测到呈漂浮状态的细胞为死细胞；
b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处在对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
c.生长状态不良的细胞: 细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。
d.只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。
2、紫外线照台30min，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基，FBS（胎牛血清）可不温。实验开始时打开照明灯和抽风机，用75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上，从左到右顺序为：吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管。从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台的左边。
3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（注意不要把胶盖烧焦），滴管（前端90%部位）灼烧。细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸干净。注意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内，避免产气愤泡，且不要伸入瓶内太多，防止导致污染；滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）！
4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶（25c㎡）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS 10滴加入到培养瓶中。（使FBS浓度为10％）
5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回CO2培养箱中。
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
 注意:
（1）在打开培养基、FBS（胎牛血清）、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。
（2）镊子每次使用前均需灼烧。装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。
（3）滴管在第一次使用前也需灼烧。注意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加。已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！
（4）培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。
（5）培养液以没过细胞为宜。
（6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不规定天天换液，容易增长污染机会。

3.4  细胞计数
1、原理：
（1）计算细胞数目用血球计数盘计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
               细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
2、计数方法：
(1) 75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。
(2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体，从中吸取13ul至盖玻片边沿（注意不要溢出，不要有气泡）。
(3) 观测计数：压线的记左不记右，记上不记下；成团的细胞只记为1个；先用低倍镜（红色，4×）找出大位置，再用中倍镜（黄色，10×）进行计数。
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104
(4) 计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布（或干棉签）擦一遍。

3.5  细胞传代
1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。
2、取灭菌试管1支，配完全培养基（含10%FBS）3ml（培养基:FBS=54滴：6滴）。
3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。
4、胰酶消化：加入约1ml（20滴）胰酶到培养瓶里消化。胰酶铺平培养瓶底为佳。倒置显微镜下观测培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培养瓶放入CO2培养箱让残存的胰酶继续消化，（在37℃胰酶消化效果最佳）。
5、每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观测，当观测到细胞变圆，透亮，细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基3ml加入到培养瓶中终止消化。
6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培养瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽略（可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。吹打时尽量避免产气愤泡，因其对细胞有伤害；需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害。新学者可固定每个角落涉及斜坡处吹打5次，靠近瓶口端处的角落也要吹到），把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。
7、取一滴细胞悬液进行计数（此环节是为了积累培养细胞的经验，观测多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此环节可以省略。如需进一步进行铺板则一定要计数！）
8、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等，一般按照1：5比例进行传代。先用滴管吹打混匀3ml（60滴）细胞悬液，取12滴细胞悬液到培养瓶中，补足完全培养基（培养基:FBS=9:1）使液体总体积达成4ml，平放到CO2培养箱中继续培养。
9、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。 
注意：
（1）对于难消化的细胞（如Bxpc-3胰腺癌细胞）在用胰酶消化前，先用1～2ml（即20～40滴，或1～2滴管）4 ℃PBS冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此环节。
（2）一定要防止细胞过消化！因过消化，使细胞成团，不均匀，且对细胞伤害很大，影响细胞贴壁和导致生长状态差等。
* 过消化特性：
a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落，胰酶里出现很多悬浮物，为掉下来的细胞。
b.培养瓶底板上自身为白茫茫（细胞贴壁生长），而过消化后细胞脱壁掉下来，则可见培养瓶底板有一片片空隙。
（3）过消化的解决：不吸出胰酶，立刻加入3ml完全培养基终止消化后一并收集入试管中，通过800 rpm 离心3min，弃去上清（失活的胰酶、培养基、FBS）。细胞沉淀（白色沉淀物）在试管底，用手指轻弹打散细胞，重新加入适量完全培养基，混匀后放入培养瓶中继续培养。
（4）在加入未经37℃温育的胰酶（指仅为室温）消化细胞时，即使细胞已经变圆，且透亮，用完全培养基终止消化后仍很难吹打下来。那是由于胰酶的温度不适宜；而应当把残留有胰酶作用的培养瓶放到CO2培养箱中，放置5min,让胰酶在其最佳温度(37℃)下消化细胞。
（5）把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时，每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体，以防止细胞成团不均，影响在培养瓶中生长。
（6）用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害，故应轻柔吹打并尽量减少气泡产生。
（7）吹打结束使细胞尽量分离成单个细胞为宜。
（8）完全培养基为具有10％FBS（胎牛血清）的培养液（基）。
（9）小牛血清使用范围：5～20%，10%最常用。血清可控制细胞生长速度，若想减慢细胞生长速度可减少血清浓度，反之亦然。对于刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，则血清用20%。
（10）一般25c㎡培养瓶需培养液5ml，通常需90滴培养基+10滴胎牛血清（FBS），一滴液体体积为50ul,即20滴为1ml。
（11）一般细胞生长铺至瓶底约80%，则可传代或用来做实验，否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化，不易用于后续实验。

3.6  细胞铺板（如12孔板）
1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。
2、在灭菌试管1中配完全培养基3ml（培养基:FBS=54滴：6滴）
3、消化同前，注意防止过消化。吹打混匀计数，如为：8.0×10 5个/ml
4、稀释细胞悬液：根据经验，细胞密度0.8×10 5个/ml较合理，因每孔需加培养液1ml，共需12ml,分2次，每次6ml（因试管体积有限，6ml即120滴），则配制细胞悬液： 8.0×10 5个/ml ×x ml = 0.8×10 5个/ml × 6ml，x=0.6ml 
即   细胞原液： 0.6ml×20滴/ml=12滴
完全培养基： 6ml-0.6ml=5.4ml （5.4×20滴=108滴）
97滴培养基+ 11滴FBS
故取12滴细胞悬液、108滴完全培养液加入试管中。用吸细胞液的滴管吹打混匀细胞悬液。
5、在超净工作台里打开细胞板，铺板，注意无菌操作。每孔1ml(20滴)，分4次滴加，每次5滴，按顺序依次滴入。注意：每次从试管中吸细胞悬液时都应吹打以使细胞均匀！
6、继续稀释细胞悬液6ml，操作同前。
7、加完之后，小心平稳地将培养板放入培养箱内，静置5min后，在显微镜下观测细胞是否铺均匀，如不均匀，将影响后续实验，则需在细胞板内吹打混匀细胞：因孔内细胞悬液1ml，采用700ul枪吹打（不能用滴管，会刮花底面），可以轻轻抵着底面往各个方向吹打。
注意：小心吹打，最佳不要起气泡，否则会导致细胞不均，且影响观测。吹打后放倒置显微镜下观测，若不够均匀，继续吹打。将细胞板拿出操作台时需盖板盖，避免污染。
8、吹打完毕后，小心将细胞板放CO2培养箱培养。（注意：拿细胞板避免晃动，最佳直拿直放，不要推动移动，否则细胞容易成团。）
9、清洁操作台面，用75%酒精喷洒操作台，擦台。
 注意：（1）若铺96孔板，则需在96孔板周边一圈孔中加入PBS，防止干燥。
              （2）各种不同规格板的铺板细胞数量：  
板型
细胞密度（孔）
体积/孔
需细胞数
吹打加样枪头
6孔板
  0.6～0.8×10 5个/ml
 2ml 
 4×10 4
1ml
12孔板
0.6～0.8×10 5个/ml
1ml 
6～8×10 4
700ul
24孔板
0.8～1.0×10 5个/ml
0.5ml
4～5×10 4
300ul
96孔板 
 1.0×10 5个/ml  
 0.1ml  
   1×10 4 
50ul

3.7  细胞冻存
1、冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观测细胞生长情形。欲冷冻保存之细胞应在生长良好（log phase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
2、依细胞传代培养之操作，收集培养之细胞于试管中，取少量细胞悬浮液，计数细胞浓度，一般冻存细胞浓度约1～5×106 cells/ml，依细胞种类而异。
3、用试管塞塞住试管，配平，800 rpm 离心3min，去除上清液，加入适量完全培养液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀。
4、吸取16滴细胞悬液到冻存管中，再加入2滴FBS，2滴DMSO（二甲基亚砜，为细胞冻存保护剂），使FBS浓度为20%，DMSO浓度为10%。盖紧冻存管盖，在壁上标记好冻存细胞名称、冻存年月日。
5、把冻存管放到-70℃冰箱程序降温盒中24小时（勿超过1周），然后转移到-196℃液氮罐中长期保存。
 注意：
（1） 注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
（2）冷冻保存之细胞浓度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherent tumor lines：5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。
（3）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不拟定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
（4）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，且能以较快的速度渗透到细胞内，故冻存细胞时使用室温下的DMSO，在冻存的细胞复温后，应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO对细胞产生毒性。