蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,蛋白质结构与功效,第,一,章,Structure and Function of Protein,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第1页,学习要求,掌握：生物化学、生物大分子和分子生物学概念。蛋白质元素组成及其特点；蛋白质基本组成单位-氨基酸种类、基本结构及主要特点；蛋白质分子结构；蛋白质结构与功效关系；蛋白质主要理化性质及其应用；蛋白质分离纯化方法及其基本原理。,熟悉：当代生物化学研究主要内容。各种氨基酸结构；蛋白质分类。,了解：生物化学发展简史、生物化学与医学关系。多肽链氨基酸序列分析；蛋白质空间结构测定。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第2页,什么是蛋白质?,蛋白质(protein),是由许多氨基酸(amino acids)经过肽键(peptide bond)相连形成高分子含氮化合物。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第3页,蛋白质研究历史,1833年，从麦芽中分离淀粉酶；随即从胃液中分离到类似胃蛋白酶物质。,1864年，血红蛋白被分离并结晶。,19世纪末，证实蛋白质由氨基酸组成，并合成了各种短肽。,20世纪初，发觉蛋白质二级结构；完成胰岛素一级结构测定。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第4页,20世纪中叶，各种蛋白质分析技术相继建立，促进了蛋白质研究快速发展；,1962年，确定了血红蛋白四级结构。,20世纪90年代，功效基因组与蛋白质组研究地展开。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第5页,蛋白质生物学主要性,分布广：,全部器官、组织都含有蛋白质；细胞各个部分都含有蛋白质。,含量高：,蛋白质是细胞内最丰富有机分子，占人体干重45，一些组织含量更高，比如脾、肺及横纹肌等高达80。,1.蛋白质是生物体主要组成成份,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第6页,作为生物催化剂（酶）,代谢调整作用,免疫保护作用,物质转运和存放,运动与支持作用,参加细胞间信息传递,2.蛋白质含有主要生物学功效,3.氧化供能,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第7页,蛋白质分子组成,The Molecular Component of Protein,第一节,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第8页,组成蛋白质元素,主要有,C、H、O、N,和,S,。,有些蛋白质含有少许磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘,。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第9页,各种蛋白质含氮量很靠近，平均为,16,。,因为体内含氮物质以蛋白质为主，所以，只要测定生物样品中含氮量，就能够依据以下公式推算出蛋白质大致含量：,100克样品中蛋白质含量(g,%,),=每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,蛋白质元素组成特点,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第10页,一、组成人体蛋白质20种氨基酸均属于L-,-氨基酸,存在自然界中氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质氨基酸仅有,20,种，且均属,L-氨基酸,（甘氨酸除外）。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第11页,H,甘氨酸,CH,3,丙氨酸,L-氨基酸通式,R,C,+,N,H,3,C,O,O,-,H,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第12页,非极性脂肪族氨基酸,极性中性氨基酸,芳香族氨基酸,酸性氨基酸,碱性氨基酸,二、氨基酸,可依据侧链结构和理化性质进行分类,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第13页,(一)侧链含烃链氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第14页,(二)侧链有极性但不带电荷氨基酸是极性中性氨基酸,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第15页,(三)侧链含芳香基团氨基酸是芳香族氨基酸,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第16页,(四)侧链含负性解离基团氨基酸是酸性氨基酸,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第17页,(五)侧链含正性解离基团氨基酸属于碱性氨基酸,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第18页,几个特殊氨基酸,脯氨酸,（亚氨基酸）,CH,2,CHCOO,-,NH,2,+,CH,2,CH,2,CH,2,CHCOO,-,NH,2,+,CH,2,CH,2,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第19页,半胱氨酸,+,胱氨酸,二硫键,-,H,H,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,S,+,NH,3,S,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,S,+,NH,3,S,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,SH,+,NH,3,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,SH,+,NH,3,HS,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,HS,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第20页,三、20种氨基酸含有共同或特异理化性质,两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液酸碱度。,等电点(isoelectric point,pI),在某一pH溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液,pH值,称为该氨基酸,等电点,。,（一）氨基酸含有两性解离性质,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第21页,pH=,pI,+OH,-,pH,pI,+H,+,+OH,-,+H,+,pH,pI,氨基酸兼性离子,阳离子,阴离子,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第22页,（二）含共轭双键氨基酸含有紫外吸收性质,色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在,280 nm,附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液,280nm,光吸收值是分析溶液中蛋白质含量快速简便方法。,芳香族氨基酸紫外吸收,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第23页,（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成,蓝紫色,化合物，其最大吸收峰在570nm处。,因为此吸收峰值与氨基酸含量存在正比关系，所以可作为氨基酸定量分析方法。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第24页,四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成 多肽链,肽键(,peptide bond,),是由一个氨基酸,-羧基与另一个氨基酸,-氨基脱水缩合而形成化学键。,（一）,氨基酸经过肽键连接而形成肽,(peptide),蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第25页,+,-,H,OH,甘氨酰甘氨酸,肽键,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第26页,肽是由氨基酸经过肽键缩合而形成化合物。,两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,肽链中氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为,氨基酸残基(residue),。,由十个以内氨基酸相连而成肽称为,寡肽(oligopeptide),，由更多氨基酸相连形成肽称,多肽(polypeptide),。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第27页,N 末端：多肽链中有,游离,-氨基,一端,C 末端：多肽链中有,游离,-羧基,一端,多肽链有两端,及其方向性,：,多肽链(polypeptide chain),是指许多氨基酸之间以肽键连接而成一个结构。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第28页,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第29页,（二）,体内存在各种主要生物活性肽,1.谷胱甘肽,(glutathione,GSH),蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第30页,GSH,过氧化物酶,H,2,O,2,2GSH,2H,2,O,GSSG,GSH,还原酶,NADPH,+,H,+,NADP,+,GSH,与,GSSG,间转换,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第31页,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第32页,蛋白质分子结构,The Molecular Structure of Protein,第二节,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第33页,蛋白质分子结构包含:,高级结构,一级结构(primary structure),二级结构(secondary structure),三级结构(tertiary structure),四级结构(quaternary structure),蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第34页,定义:,蛋白质一级结构,指在蛋白质分子从N-端至C-端,氨基酸排列次序,。,一、,蛋白质一级结构,主要化学键,:,肽键,，有些蛋白质还包含二硫键。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第35页,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学,功效基础,，,但不是决定蛋白质空间构象,唯一原因,。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第36页,二、,蛋白质二级结构,蛋白质分子中某一段肽链局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子相对空间位置，并不包括氨基酸残基侧链构象,。,定义:,主要化学键,：,氢键,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第37页,（一）参加肽键形成6个原子在同一平面上,参加肽键6个原子C,1,、C、O、N、H、C,2,位于同一平面，C,1,和C,2,在平面上所处位置为反式(trans)构型，此同一平面上6个原子组成了所谓,肽单元,(,peptide unit),。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第38页,（一）参加肽键形成6个原子在同一平面上,参加肽键6个原子C,1,、C、O、N、H、C,2,位于同一平面，C,1,和C,2,在平面上所处位置为反式(trans)构型，此同一平面上6个原子组成了所谓,肽单元,(,peptide unit),。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第39页,-螺旋,(,-helix),-折叠,(,-pleated sheet),-转角,(,-turn),无规卷曲,(random coil),（二）-螺旋结构是常见蛋白质二级结构,蛋白质二级结构,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第40页,-螺旋,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第41页,（三）,-折叠使多肽链形成片层结构,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第42页,（四）,-转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在,-转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性那部分肽链结构。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第43页,（五）模体,是含有特殊功效超二级结构,在许多蛋白质分子中，可发觉二个或三个含有二级结构肽段，在空间上相互靠近，形成一个,有规则二级结构组合，被称为,超二级结构,。,二级结构组合形式有3种：，。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第44页,二个或三个含有二级结构肽段，在空间上相互靠近，形成一个特殊空间构象，称为,模体,(motif),。,模体是含有特殊功效超二级结构。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第45页,钙结合蛋白中结合钙离子模体,锌指结构,-螺旋-转角（或环）-螺旋模体,链-转角-链模体,链-转角-螺旋-转角-链模体,模体常见形式,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第46页,（六）氨基酸残基侧链对二级结构形成影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础。一段肽链其氨基酸残基侧链适合形成,-螺旋或-折叠，它就会出现对应二级结构。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第47页,三、,蛋白质三级结构,疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力,等。,主要化学键:,整条肽链中全部氨基酸残基相对空间位置。即肽链中全部原子在三维空间排布位置。,定义:,（一）三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基相对空间位置,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第48页,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第49页,肌红蛋白(Mb),N 端,C端,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第50页,纤连蛋白分子结构域,（二）结构域,是三级结构层次上局部折叠区,分子量较大蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密区域，并各行其功效，称为,结构域(,domain,),。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第51页,（三）分子伴侣,参加蛋白质折叠,分子伴侣,(chaperon),经过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠整天然构象或形成四级结构。,分子伴侣可逆地与未折叠肽段疏水部分结合随即松开，如此重复进行可预防错误聚集发生，使肽链正确折叠。,分子伴侣也可与错误聚集肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键正确形成起了主要作用。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第52页,伴侣蛋白在蛋白质折叠中作用,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第53页,亚基之间结合主要是,氢键和离子键,。,四、,蛋白质,四级结构,蛋白质分子中各亚基空间排布及亚基接触部位布局和相互作用，称为,蛋白质四级结构,。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整三级结构，称为蛋白质,亚基,(subunit),。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第54页,由2个亚基组成蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为,同二聚体(homodimer),，若亚基分子结构不一样，则称之为,异二聚体(heterodimer),。,血红蛋白四级结构,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第55页,五、蛋白质分类,依据蛋白质组成成份:,单纯蛋白质,结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分,依据蛋白质形状:,纤维状蛋白质,球状蛋白质,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第56页,六、蛋白质组学,（一）蛋白质组学基本概念,蛋白质组是指一个细胞或一个生物所表示全部蛋白质，即“一个基因组所表示全套蛋白质”。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第57页,（二）蛋白质组学研究技术平台,蛋白质组学是高通量，高效率研究:,双向电泳分离样品蛋白质,蛋白质点定位、切取,蛋白质点质谱分析,（三）蛋白质组学研究科学意义,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第58页,蛋白质结构与功效关系,The Relation of Structure and Function of Protein,第三节,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第59页,（一）一级结构是空间构象基础,一、蛋白质一级结构,是高级结构与功效基础,牛核糖核酸酶一级结构,二硫键,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第60页,天然状态，有催化活性,尿素、,-巯基乙醇,去除尿素、,-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第61页,（二）一级结构相同蛋白质含有相同高级结构与功效,胰岛素,氨基酸残基序号,A5,A6,A10,B30,人,Thr,Ser,Ile,Thr,猪,Thr,Ser,Ile,Ala,狗,Thr,Ser,Ile,Ala,兔,Thr,Gly,Ile,Ser,牛,Ala,Gly,Val,Ala,羊,Ala,Ser,Val,Ala,马,Thr,Ser,Ile,Ala,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第62页,（三）,氨基酸序列提供主要生物化学信息,一些广泛存在于生物界蛋白质如细胞色素(cytochrome C)，比较它们一级结构，能够帮助了解物种进化间关系。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第63页,（四）主要蛋白质氨基酸序列改变可引发疾病,例：镰刀形红细胞贫血,N-val his leu thr pro,glu,glu C(146),HbS,肽链,HbA,肽 链,N-val his leu thr pro,val,glu C(146),这种由蛋白质分子发生变异所造成疾病，称为“分子病”。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第64页,肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基,血红素结构,二、,蛋白质功效依赖特定空间结构,（一）,血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相同,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第65页,肌红蛋白(,myoglobin,，,Mb,),肌红蛋白是一个只有三级结构单链蛋白质，有8段,-螺旋结构。,血红素分子中两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中两个碱性氨基酸侧链上正电荷相连，加之肽链中F8组氨酸残基还与Fe,2+,形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第66页,血红蛋白(,hemoglobin,，,Hb,),血红蛋白含有4个亚基组成四级结构，,每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧,。,Hb亚基之间经过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水球状蛋白。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第67页,Hb,与,Mb,一样能可逆地与,O,2,结合，,Hb,与,O,2,结合后称为,氧合,Hb,。氧合,Hb,占总,Hb,百分数（称,百分饱和度,）随,O,2,浓度改变而改变。,（二）血红蛋白亚基构象改变可影响亚基与氧结合,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第68页,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)氧解离曲线,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第69页,协同效应(,cooperativity,),一个寡聚体蛋白质一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力现象，称为,协同效应,。,假如是促进作用则称为,正协同效应,(,positive cooperativity,),假如是抑制作用则称为,负协同效应,(,negative cooperativity,),蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第70页,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第71页,O,2,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环小孔中，继而引发肽链位置变动。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第72页,变构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构改变伴随其功效改变，称为,变构效应,。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第73页,（三）蛋白质构象改变,可引发疾病,蛋白质构象疾病,：若蛋白质折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质构象发生改变，仍可影响其功效，严重时可造成疾病发生。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第74页,蛋白质构象改变造成疾病机理,：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀病理改变。,这类疾病包含,：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第75页,疯牛病是由朊病毒蛋白,(prion protein,PrP)引发一组人和动物神经退行性病变。,正常PrP富含-螺旋，称为PrP,c,。,PrP,c,在某种未知蛋白质作用下可转变成全为-折叠PrP,sc,，从而致病。,PrP,c,-螺旋,PrP,sc,-折叠,正常,疯牛病,疯牛病中蛋白质构象改变,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第76页,第四节,蛋白质理化性质,The Physical and Chemical Characters of Protein,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第77页,一、,蛋白质含有两性电离性质,蛋白质分子除两端氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中一些基团，在一定溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液pH称为,蛋白质等电点,。,蛋白质等电点(isoelectric point,pI),蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第78页,二、蛋白质含有胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,颗粒表面电荷,水化膜,蛋白质胶体稳定原因:,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第79页,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷蛋白质,带负电荷蛋白质,在等电点蛋白质,水化膜,+,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷蛋白质,带负电荷蛋白质,不稳定蛋白质颗粒,酸,碱,酸,碱,酸,碱,脱水作用,脱水作用,脱水作用,溶液中蛋白质聚沉,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第80页,三、蛋白质空间结构破坏而引发变性,在一些物理和化学原因作用下，其特定空间构象被破坏，也即有序空间结构变成无序空间结构，从而造成其理化性质改变和生物活性丧失。,蛋白质变性(denaturation),蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第81页,造成变性原因:,如,加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等,。,变性,本质:,破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质一级结构。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第82页,应用举例:,临床医学上，变性原因常被应用来消毒及灭菌。,另外,预防蛋白质变性也是有效保留蛋白质制剂（如疫苗等）必要条件。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第83页,若蛋白质变性程度较轻，去除变性原因后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有构象和功效，称为,复性(renaturation),。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第84页,天然状态，有催化活性,尿素、,-巯基乙醇,去除尿素、,-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第85页,在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。,变性蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性,。,蛋白质变性后絮状物加热可变成比较坚固凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,蛋白质沉淀,蛋白质凝固作用(protein coagulation),蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第86页,四、蛋白质,在紫外光谱区有特征性吸收峰,因为蛋白质分子中含有共轭双键酪氨酸和色氨酸，所以在,280nm,波优点有特征性吸收峰。蛋白质OD280与其浓度呈正比关系，所以可作蛋白质定量测定。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第87页,蛋白质经水解后产生氨基酸也可发生茚三酮反应。,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，展现紫色或红色，此反应称为,双缩脲反应,，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量,茚三酮反应(ninhydrin reaction),双缩脲反应(biuret reaction),蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第88页,第五节,蛋白质分离纯化与结构分析,The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第89页,一、,透析及超滤法可去除蛋白质溶液中小分子化合物,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液目标。,透析(dialysis),超滤法,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开方法,。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第90页,二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是惯用蛋白质沉淀方法,使用,丙酮沉淀,时，必须在04低温下进行，丙酮用量普通10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应马上分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,盐析(salt precipitation),是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，造成蛋白质沉淀。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第91页,免疫沉淀法：,将某一纯化蛋白质免疫动物可取得抗该蛋白特异抗体。利用特异抗体识别对应抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物性质，可从蛋白质混合溶液中分离取得抗原蛋白。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第92页,三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离,蛋白质在高于或低于其pI溶液中为带电颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种经过蛋白质在电场中泳动而到达分离各种蛋白质技术,称为,电泳,(elctrophoresis),。,依据支撑物不一样，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第93页,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,，惯用于蛋白质分子量测定。,等电聚焦电泳,，经过蛋白质等电点差异而分离蛋白质电泳方法。,双向凝胶电泳,是蛋白质组学研究主要技术。,几个主要蛋白质电泳:,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第94页,四、,应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，依据溶液中待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离蛋白质组分在两相中重复分配，并以不一样速度流经固定相而到达分离蛋白质目标。,层析(chromatography)分离蛋白质原理,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第95页,离子交换层析：,利用各蛋白质电荷量及性质不一样进行分离。,凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析,，利用各蛋白质分子大小不一样分离。,蛋白质分离惯用层析方法,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第96页,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第97页,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第98页,五、,利用蛋白质颗粒沉降行为不一样可进行超速离心分离,超速离心法(ultracentrifugation),既能够用来分离纯化蛋白质也能够用作测定蛋白质分子量。,蛋白质在离心场中行为用,沉降系数(sedimentation coefficient,S),表示，沉降系数与蛋白质密度和形状相关。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第99页,因为沉降系数S大致上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称大多数纤维状蛋白质不适用。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第100页,六、应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链氨基酸序列,分析已纯化蛋白质氨基酸残基组成,测定多肽链氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段氨基酸排列次序，普通采取Edman降解法,普通需用数种水解法，并分析出各肽段中氨基酸次序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸次序结果。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第101页,经过核酸来推演蛋白质中氨基酸序列,按照三联密码标准推演出氨基酸序列,分离编码蛋白质基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第102页,七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定,二级结构测定,通常采取,圆二色光谱(,circular dichroism，CD,),测定溶液状态下蛋白质二级结构含量。,-螺旋CD峰有222nm处负峰、208nm处负峰和198 nm处正峰三个成份；而,-折叠CD谱不很固定。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第103页,三级结构测定,X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR),是研究蛋白质三维空间结构最准确方法。,蛋白质的结构和功能专业知识讲解专家讲座,第104页,