生化实验04淀粉酶活性测定陈桃.pptx

NRERE直链淀粉直链淀粉支链淀粉或糖原分支点的结构支链淀粉或糖原分支点的结构RENRE(16)分支点分支点支链淀粉或糖原分子示意图支链淀粉或糖原分子示意图直链淀粉的螺旋结构直链淀粉的螺旋结构0.8nm1.4nm6个残基个残基1.重要的重要的多糖多糖-淀粉淀粉第1页/共15页支链淀粉的分枝结构支链淀粉的分枝结构开始分枝的残基开始分枝的残基非还原端非还原端残基残基两个葡萄糖单位之两个葡萄糖单位之间的间的1，6-糖苷键糖苷键两个葡萄糖单位之两个葡萄糖单位之间的间的1，4-糖苷键糖苷键第2页/共15页 a-a-淀粉酶淀粉酶 -淀粉酶淀粉酶 切切-1,4-1,4-糖苷键糖苷键 淀粉的淀粉的 水解水解 麦芽糖酶麦芽糖酶 酶促酶促 脱支酶脱支酶 切切-1,6-1,6-糖苷键糖苷键 降解降解 异麦芽糖酶异麦芽糖酶 磷酸解磷酸解:淀粉磷酸化酶淀粉磷酸化酶2 2、淀粉的酶促降解、淀粉的酶促降解第3页/共15页3.淀粉的酶促水解淀粉的酶促水解淀粉酶淀粉酶 淀粉酶淀粉酶：在淀粉在淀粉分子内部分子内部任意水解任意水解-1-1，4 4糖苷键。产物为麦芽糖苷键。产物为麦芽糖，麦芽三糖，糊精等糖，麦芽三糖，糊精等还原糖（内切酶）还原糖（内切酶）淀淀粉粉酶酶:从从非非还还原原端端开开始始，水水解解，4 4糖糖苷苷键键，依依次次水水解解下下一一个个麦麦芽芽糖糖单单位位（外外切酶）切酶）淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶极限糊精极限糊精第4页/共15页-淀粉酶淀粉酶-淀粉酶淀粉酶可跨越分枝点可跨越分枝点 不能跨越分枝点不能跨越分枝点内切酶（随机切）内切酶（随机切）端解酶（非还原端两两相切）端解酶（非还原端两两相切）产物糊精分子量小产物糊精分子量小糊精分子量大（极限糊精）糊精分子量大（极限糊精）耐耐70 15min,70 15min,不耐酸不耐酸 耐耐pH=3.3 pH=3.3 酸性酸性,不耐高温不耐高温 分布分布发芽种子发芽种子休眠种子休眠种子-淀粉酶和淀粉酶和-淀粉酶的异同点：淀粉酶的异同点：相同点：相同点：都作用于都作用于-1,4糖苷键，产物都是麦芽糖糖苷键，产物都是麦芽糖不同点：不同点：第5页/共15页实验04第6页/共15页一、目的一、目的二、原理二、原理淀粉-淀粉酶（内切酶）-淀粉酶（外切酶）麦芽糖等寡聚糖麦芽糖3，5-二硝基水杨酸3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）淀粉酶的作用机制及产物显色原理：D-麦芽糖麦芽糖第7页/共15页淀粉酶活性大小的表示方法：淀粉酶活性的大小与产生的还原糖的量成正比。以单位质量样品单位时间生成的还原糖的量表示。测定-淀粉酶和-淀粉酶：-淀粉酶不耐酸，-淀粉酶不耐热，本实验采用70。C保温15min钝化-淀粉酶而测出-淀粉酶。总活力减去-淀粉酶活力则为-淀粉酶活力。第8页/共15页三、材料、仪器设备及试剂三、材料、仪器设备及试剂材料：萌发的小麦种子（芽长1cm）仪器设备：分光光度计、恒温水浴、刻度试管、容量瓶试剂：1、标准麦芽糖溶液（1mg/mL）2、3，5-二硝基水杨酸（含NaOH）3、1%淀粉溶液第9页/共15页四、实验步骤四、实验步骤2、酶液制备 称取1g萌发的小麦种子 加少量蒸馏水 研磨 转入100 mL容量瓶 定容 放置15min 过滤 淀粉酶原液（酶液）取酶液 10 mL于50 mL容量瓶，用蒸馏水定容 至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液（酶液）1、麦芽糖标准曲线的制作 A540=0.264x-0.052 (x为mg麦芽糖）第10页/共15页3、酶活力的测定取取4 4支干净的具塞刻度试管，编号，按下表操作支干净的具塞刻度试管，编号，按下表操作：摇匀，沸水浴中摇匀，沸水浴中5min5min，取出流水冷却，加蒸馏水至，取出流水冷却，加蒸馏水至20mL20mL。摇匀，摇匀，540nm540nm比色测定。比色测定。操作项目 管号 -1 -2-1 -2 -1 -2-1 -2淀粉酶原液（酶液）/mL 1.0 1.0 0 0钝化-淀粉酶 置70 0C水浴中15min，取出后流水冷却淀粉酶稀释液（酶液）/mL 0 0 1.0 1.03，5-二硝基水杨酸/mL 2.0 0 2.0 0预保温 40 0C恒温水浴中保温10min 1%淀粉溶液/mL（40。C）1.0 1.0 1.0 1.0保温 40 0C恒温水浴中保温5min 3，5-二硝基水杨酸/mL 0 2.0 0 2.0 第11页/共15页空白管：2 mL蒸馏水+2 mL3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，定容至20 mL第12页/共15页五、实验数据五、实验数据VT=VS=W=A-1=A-2=A1=A-2-A-1 x1=A-1=A-2=A2=A-2-A-1 x2=第13页/共15页六、结果计算六、结果计算 X1 VT-淀粉酶活力mg/(g.min)=W VS t X2 VT N(+)-淀粉酶活力mg/(g.min)=W VS t-淀粉酶活力=(+)-淀粉酶活力-淀粉酶活力第14页/共15页七、分析讨论七、分析讨论注意事项：1、三个水浴温度的不同，不能混淆。2、实验步骤较复杂，理解之后动手操作。第15页/共15页