医疗器械产品无菌检验操作规程.doc

医疗器械产品无菌检查操作规程

1 目的
通过无菌检查，保证灭菌后产品可以达成无菌的规定。
2 合用范围
合用于灭菌后医疗器械产品（列举）的无菌检查。
3 检查依据
本厂产品注册标准（编号）
EN1174-1996 医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估
《中国药典》（2023年版）
GB14233.2-2023 医用输液、输血、注射器具检查方法第二部分：生物实验方法
GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准
4 仪器、设备
百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪（器）、电子天平、PH计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。
5 无菌检查室的环境规定
5.1 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部百级的单向流空气区域内进行。
5.2 缓冲区与外界环境、无菌检查室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对照室与缓冲区之间空气应保持负压。无菌检查室与室外大气之间静压差应大于10Pa。无菌检查室的室温应保持18～26℃，相对湿度：45～65%。
5.3 无菌检查室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。
5.4 无菌检查过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于30～35℃培养48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。
6 无菌检查前的准备
6.1 器具灭菌、消毒
6.1.1 灭菌：实验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。可经电热干燥箱160℃以上干烤2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。
6.1.2 消毒：凡检查中使用的器材无法灭菌解决的，使用前必须经消毒解决。如无菌检查室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采用消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换，以防止产生耐药菌株。
6.1.3 标记：器具的灭菌、消毒后必须做好标记，标明灭菌、消毒时间和使用有效期。
6.2 人员、物料进入无菌检查室
6.2.1 启动紫外线灯或臭氧发生器进行空间灭菌解决，消毒时间不得少于30min。
6.2.2 物料进入无菌检查室流程
6.2.2.1 脱包：进入无菌检查室的物品若有双重包装的，需将外包装在传递窗/缓冲间拆除后，传入实验室。
6.2.2.2 消毒：进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用合用的方法进行消毒解决，以避免将外包装污染的微生物带入无菌检查室。
6.2.2.3 传递：查看所有进入无菌检查室的器具上的灭菌、消毒标记，是否在有效期内。符合规定的经传递窗传入无菌检查室。
6.2.3 人员进入无菌检查室流程
6.2.3.1 更鞋脱衣：在一更区脱去一般区工作鞋，穿上无菌检查室工作鞋；脱去一般区工作服。
6.2.3.2 洗手：一方面用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水连续冲洗20秒，洗净泡沫。
6.2.3.3 更衣：在二更区按照从上到下的顺序穿戴无菌工作服（涉及衣、帽、口罩等），规定裤子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。
6.2.3.4 手消毒：用消毒液浸泡双手5秒以上或用浸过消毒液的棉球擦拭双手。消毒液可用洗必泰、新洁尔灭、碘伏、75%酒精等。
6.2.3.5 人员进入：经缓冲间进入无菌检查室。
6.2.4 人员进入无菌检查室后，进一步用消毒液擦拭工作台面，戴无菌手套。
7 无菌检查操作规定
7.1 全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。
7.2 使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。
7.3 所有操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。
7.4 使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。
7.5 在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，导致污染。
7.6 操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌解决。可在检查过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡或消毒桶内，或在检查完毕后经传递窗传至一般区，立即用压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟。
8 培养基制备
8.1需气菌、厌气菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基）的制备
8.1.1 所用试剂

酪胨（胰酶水解）15.0g
葡萄糖5.0g
L-胱氨酸0.5g
硫乙醇酸钠0.5g
（或硫乙醇酸）（0.3ml）
酵母浸出粉5.0g
氯化钠2.5g
新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml
琼脂0.75g
水1000ml

8.1.2 制备
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH为7.1±0.2。
8.1.3 硫乙醇酸盐流体培养剂氧化层的颜色规定
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否刚需经100℃水浴加热到粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。
8.2 霉菌培养基（改良马丁培养基）的制备
8.2.1 所用试剂
胨5.0g
酵母浸出粉2.0g
葡萄糖20.0g
磷酸二氢钾1.0g
硫酸镁0.5g
水1000 ml
8.2.2 制备
除葡萄糖外，取上述成分混和，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH为6.4±0.2。
8.3 还可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基，按照使用说明书配制。
8.4 培养基配制后应尽快灭菌，避免微生物繁殖。一般采用高压蒸汽121℃灭菌30分钟。
8.5 制备好的培养基应在2～25℃保存，在3周内使用。
8.6 培养基的无菌性检查
每批配制的培养基均应进行无菌性检查（可与产品无菌检查同步进行）。检查时，每批培养基随机取不少于5支（瓶）培养14天，应无菌生长。
9 稀释液、冲洗液的制备
9.1 0.1%蛋白胨水溶液
取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30分钟后，于4℃保存备用。, 分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30分钟后，于4℃保存备用
9.2 pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液
取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钾7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml。微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30分钟后，于4℃保存备用。
9.3 浸提介质：9g/L无菌氯化钠溶液，可直接从有证单位采购大输液。
10 对照菌液制备
10.1 无菌检查所用的菌株传代次数不得超过5代。
10.2取金黄色葡萄球的普通琼脂斜面培养物，接种一白金耳至营养琼脂培养基内，在30～35℃培养18～24h后备用，同时制备0.9%氯化钠溶液加入在6支小试管内，每支试管内加9.0ml的0.9%氯化钠溶液，在压力锅内经121℃灭菌30min备用。将已配好的金黄色葡萄球菌培养菌液取1.0ml加入第一支小试管内，稀释成浓度1:10的菌液；取第一支试管内1.0m l菌液加入第二支小试管内，稀释成浓度1:100的菌液，同法稀释成浓度1:106（每ml含菌量≤100CFU）即可。
10.3 采用平皿计数法测定活菌数。
11 无菌检查培养温度
硫乙醇酸盐流体培养基，置30～35℃培养。
改良马丁培养基，置23～28℃培养。
12 无菌检查
12.1 如产品注册标准中明确“产品应通过一个确认过的灭菌过程”，则执行12.1项下各项。
12.1.1 放样
每个灭菌批次按已验证的灭菌工艺，在灭菌柜内相应的位置放置适量菌片，灭菌后对菌片进行无菌检查。
12.1.2 菌片贮存
灭菌前、后菌片应按菌片说明书规定条件保存。（REVEN公司菌贮存温度为15～27℃）
12.1.3 接种
启动超净工作台单向层流，在此环境下，分别将灭菌后的菌片成对放入已灭菌的硫乙醇酸盐流体培养基中。同时以未灭菌的菌片作阳性对照，以未接种的硫乙醇酸盐流体培养基和未接种的改良马丁培养基作为阴性对照。
12.1.4 培养
阳性对照管于30～35℃细菌培养箱培养48～72小时。
其余硫乙醇酸盐流体培养基于30～35℃培养7天。
改良马丁培养基于23～28℃培养7天。
12.1.5 结果鉴定
培养后，阳性对照应有菌生长，阴性对照和被检样品未见需气菌、厌气菌和霉菌生长的为合格。
12.2 如产品注册标准中明确产品应进行无菌检查，则执行12.2.1～12.2.5。
12.2.1 抽样
根据各自的产品注册标准和相应产品出厂检查规程的规定，对成品库内的产品进行抽样。一般同一个灭菌批产品检查3～11个单位供试品。
12.2.2 供试液准备
优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养的方法，如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使浸提介质充足洗提供试品的浸提表面，供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2小时内使用。
根据供试品具体特性选择下列方法：
a) 管类器具：按管内表面积每10cm2流过管内腔1ml浸提介质，流量约为10ml/min，收集到无菌的容器内。
b) 容器类器具：按容器内表面积每10cm2加入浸提介质1ml的比例，振摇数次。
c) 实体类器具：实体类器具按表面及每10cm2加入浸提介质1ml，振摇数次。
收集上述冲洗液或浸提介质于无菌容器中。
12.2.3 接种
12.2.3.1 薄膜过滤法：优先采用封闭式薄膜过滤器（集菌器），也可使用开放式薄膜过滤器。滤膜孔经不大于0.45µｍ。滤器和滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌，或直接采用无菌集菌器。
a、如采用封闭式薄膜过滤器，取一副三联式集菌器，将供试液通过集菌仪过滤，使通过每只培养管的量基本均匀。然后通过集菌仪一只加120ml改良马丁培养基，另两只分别加入120ml硫乙醇酸盐培养基（其中一只做阳性对照，内加金黄色葡萄球菌液1ml）。另取一副二联集菌器，用同批的冲洗液或浸提介质120ml通过集菌仪过滤（每只约50ml），同法一只加硫乙醇酸盐培养基120ml，另一只加改良马丁培养基120ml分别作阴性对照。
b、如用一般薄膜过滤器，将供试液过滤后取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中两份作检查，一份作阳性对照。
12.2.3.2 直接接种法：合用于一次性使用注射针、一次性使用静脉输液针（涉及输液器、输血器、注射器配套使用注射针）。
a、敷料供试品：取规定数量，每个包装以无菌操作拆开，于不同部位剪取约120mg或1cm×3cm的供试品，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
b、无菌针头：直接投入含15ml以上硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中。
c、一次性使用的材料：拆散或切成小碎断，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
供试品按规定量分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作阳性对照。
每个容器中培养基的用量应符合：接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，或培养基的装量足以浸没供试品。
每管培养基的最低用量——硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10 ml.
12.2.4 培养、观测
上述含培养基的容器分别置规定温度的恒温培养箱中，除阳性对照管培养48～72小时外，其余管培养14天。培养期间应逐日观测并记录是否有菌生长。
如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生产，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观测是否再出现浑浊或斜面有无菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。
12.2.5 结果判断
培养结束后，阳性对照管应有菌生长，阴性对管应澄清。否则，就判结果无效。
所有供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。
若供试品管中任何1管显浑浊并确证有菌生长判供试品不符合规定。
以一次检出为准，不得复试。
当符合下列至少一个条件时，可判实验结果无效；
1）无菌检查所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的规定；
2）回顾无菌实验过程，发现有也许引起微生物污染的因素；
3）阴性对照管有菌生长；
4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌检查中所使用的物品和（或）无菌操作技术不妥引起的；
13 质量记录
附件：1、《产品无菌检查操作规程》
2、《无菌检查原始记录》
《菌种外购、转种记录》
《培养基制备记录》
《实验中废弃的带菌物品灭菌解决记录》
《实验用稀释液、冲洗液、缓冲液制备记录》
《浓菌液制备使用记录》
《洁净区域净化系统运营记录》