生化实验.pptx

生物化学实验生物化学实验生物化学课程组生物化学课程组BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006实验室守则实验室守则一、安全卫生一、安全卫生一、安全卫生一、安全卫生l l所有进入实验室的人员都有监督实验室安全、卫生、仪器所有进入实验室的人员都有监督实验室安全、卫生、仪器所有进入实验室的人员都有监督实验室安全、卫生、仪器所有进入实验室的人员都有监督实验室安全、卫生、仪器操作和维护的义务。操作和维护的义务。操作和维护的义务。操作和维护的义务。l l在测定完成后，使用者须做好实验室的清洁工作，将公用在测定完成后，使用者须做好实验室的清洁工作，将公用在测定完成后，使用者须做好实验室的清洁工作，将公用在测定完成后，使用者须做好实验室的清洁工作，将公用物品归还原位物品归还原位物品归还原位物品归还原位,立即将所使用过的试验台、实验用品等清立即将所使用过的试验台、实验用品等清立即将所使用过的试验台、实验用品等清立即将所使用过的试验台、实验用品等清洗干净，清除垃圾，并及时归还所借物品。洗干净，清除垃圾，并及时归还所借物品。洗干净，清除垃圾，并及时归还所借物品。洗干净，清除垃圾，并及时归还所借物品。l l实验室安全卫生实行值日生制，值日生在每天使用完实验实验室安全卫生实行值日生制，值日生在每天使用完实验实验室安全卫生实行值日生制，值日生在每天使用完实验实验室安全卫生实行值日生制，值日生在每天使用完实验室后进行检查，必须保持实验室内环境整洁，走道畅通，室后进行检查，必须保持实验室内环境整洁，走道畅通，室后进行检查，必须保持实验室内环境整洁，走道畅通，室后进行检查，必须保持实验室内环境整洁，走道畅通，设备器材摆放整齐。设备器材摆放整齐。设备器材摆放整齐。设备器材摆放整齐。l l禁止在实验室吸烟、吃东西、乱抛纸屑杂物。禁止在实验室吸烟、吃东西、乱抛纸屑杂物。禁止在实验室吸烟、吃东西、乱抛纸屑杂物。禁止在实验室吸烟、吃东西、乱抛纸屑杂物。l l最后一个离开实验室的人一定要关好水、电、门和窗。最后一个离开实验室的人一定要关好水、电、门和窗。最后一个离开实验室的人一定要关好水、电、门和窗。最后一个离开实验室的人一定要关好水、电、门和窗。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006二、仪器使用二、仪器使用l l严禁在实验台的插孔上使用功率大的电器。严禁在实验台的插孔上使用功率大的电器。严禁在实验台的插孔上使用功率大的电器。严禁在实验台的插孔上使用功率大的电器。l l对于功率大的电器，如烘箱、马福炉等，请严格对于功率大的电器，如烘箱、马福炉等，请严格对于功率大的电器，如烘箱、马福炉等，请严格对于功率大的电器，如烘箱、马福炉等，请严格按照要求操作，每天应在晚上十点前关闭。按照要求操作，每天应在晚上十点前关闭。按照要求操作，每天应在晚上十点前关闭。按照要求操作，每天应在晚上十点前关闭。l l烘箱是不锈钢体的，不能将未洗干净的物品放进烘箱是不锈钢体的，不能将未洗干净的物品放进烘箱是不锈钢体的，不能将未洗干净的物品放进烘箱是不锈钢体的，不能将未洗干净的物品放进烘箱。不能用不干净的抹布擦烘箱。烘箱。不能用不干净的抹布擦烘箱。烘箱。不能用不干净的抹布擦烘箱。烘箱。不能用不干净的抹布擦烘箱。l l使用离心机，离心管一定要称重平衡后，对称放使用离心机，离心管一定要称重平衡后，对称放使用离心机，离心管一定要称重平衡后，对称放使用离心机，离心管一定要称重平衡后，对称放置。置。置。置。l l天平，特别是万分之一的天平不得任意搬动。使天平，特别是万分之一的天平不得任意搬动。使天平，特别是万分之一的天平不得任意搬动。使天平，特别是万分之一的天平不得任意搬动。使用完毕后应立即清扫天平，以免化学试剂腐蚀天用完毕后应立即清扫天平，以免化学试剂腐蚀天用完毕后应立即清扫天平，以免化学试剂腐蚀天用完毕后应立即清扫天平，以免化学试剂腐蚀天平。平。平。平。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006l l不能用实验室的分样器、加样枪加强酸或强碱，以免腐不能用实验室的分样器、加样枪加强酸或强碱，以免腐不能用实验室的分样器、加样枪加强酸或强碱，以免腐不能用实验室的分样器、加样枪加强酸或强碱，以免腐蚀。蚀。蚀。蚀。l l气瓶内气体不能用尽，必须留有剩余压力气瓶内气体不能用尽，必须留有剩余压力气瓶内气体不能用尽，必须留有剩余压力气瓶内气体不能用尽，必须留有剩余压力(如氧气不少于如氧气不少于如氧气不少于如氧气不少于2Kg/m2)2Kg/m2)。l l有毒或有腐蚀性气体的实验必须在通风橱内进行。有毒或有腐蚀性气体的实验必须在通风橱内进行。有毒或有腐蚀性气体的实验必须在通风橱内进行。有毒或有腐蚀性气体的实验必须在通风橱内进行。l l实验后的废渣、废液，要倒在废渣箱和废液缸中，不准实验后的废渣、废液，要倒在废渣箱和废液缸中，不准实验后的废渣、废液，要倒在废渣箱和废液缸中，不准实验后的废渣、废液，要倒在废渣箱和废液缸中，不准随便倾倒或倒入水池中。随便倾倒或倒入水池中。随便倾倒或倒入水池中。随便倾倒或倒入水池中。l l超净台使用注意事项：保持干净，紫外灯的使用时需遮超净台使用注意事项：保持干净，紫外灯的使用时需遮超净台使用注意事项：保持干净，紫外灯的使用时需遮超净台使用注意事项：保持干净，紫外灯的使用时需遮盖前面板。盖前面板。盖前面板。盖前面板。l l冰箱：不得放危险品，或相邻能起化学反应的药品。冰箱：不得放危险品，或相邻能起化学反应的药品。冰箱：不得放危险品，或相邻能起化学反应的药品。冰箱：不得放危险品，或相邻能起化学反应的药品。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006三、实验数据及其处理三、实验数据及其处理l l所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，如样品应有样品名称、存放时间、存放人。配制如样品应有样品名称、存放时间、存放人。配制如样品应有样品名称、存放时间、存放人。配制如样品应有样品名称、存放时间、存放人。配制的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人等。等。等。等。l l必须进行至少三次平行实验，以求得标准偏差。必须进行至少三次平行实验，以求得标准偏差。必须进行至少三次平行实验，以求得标准偏差。必须进行至少三次平行实验，以求得标准偏差。数据图须标有误差棒。数据图须标有误差棒。数据图须标有误差棒。数据图须标有误差棒。l l实验中，必须如实地记录各种实验数据。实验后，实验中，必须如实地记录各种实验数据。实验后，实验中，必须如实地记录各种实验数据。实验后，实验中，必须如实地记录各种实验数据。实验后，二星期内完成实验结果整理，正确处理实验数据，二星期内完成实验结果整理，正确处理实验数据，二星期内完成实验结果整理，正确处理实验数据，二星期内完成实验结果整理，正确处理实验数据，不得更改原始数据。不得更改原始数据。不得更改原始数据。不得更改原始数据。实验一实验一糖类的定量测定糖类的定量测定生物化学课程组生物化学课程组BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006一、实验目的一、实验目的香菇，又称香蕈、冬菇，是一种生长在木材香菇，又称香蕈、冬菇，是一种生长在木材上的真菌类，它含有大量的氨基酸等对人体上的真菌类，它含有大量的氨基酸等对人体有益的营养物质，还含有很多的多糖。香菇有益的营养物质，还含有很多的多糖。香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和功能和刺激干扰素形成等功能。本实验学习水溶性刺激干扰素形成等功能。本实验学习水溶性糖类的定量测定方法。糖类的定量测定方法。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006二、实验原理二、实验原理香菇的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和香菇的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和香菇的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和香菇的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚硫酸法测定可溶性糖的原理是：糖在寡聚糖。苯酚硫酸法测定可溶性糖的原理是：糖在寡聚糖。苯酚硫酸法测定可溶性糖的原理是：糖在寡聚糖。苯酚硫酸法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在苯酚缩合成一种橙红色化合物，在苯酚缩合成一种橙红色化合物，在苯酚缩合成一种橙红色化合物，在1010100mg/l100mg/l范范范范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm485nm波波波波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定的影响，并且产生的颜色稳定的影响，并且产生的颜色稳定的影响，并且产生的颜色稳定160min160min以上。以上。以上。以上。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006三、实验仪器及试剂三、实验仪器及试剂1 1仪器：分光光度计、电炉、铝锅、仪器：分光光度计、电炉、铝锅、仪器：分光光度计、电炉、铝锅、仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL20mL刻度试刻度试刻度试刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。2 2试剂：试剂：试剂：试剂：l l（1 1）2g/L2g/L蒽酮试剂：称取蒽酮试剂：称取蒽酮试剂：称取蒽酮试剂：称取2g2g蒽酮（蒽酮（蒽酮（蒽酮（ARAR）溶于）溶于）溶于）溶于1000ml1000ml的的的的浓硫酸中，当日配置使用。浓硫酸中，当日配置使用。浓硫酸中，当日配置使用。浓硫酸中，当日配置使用。l l（2 2）1 1葡萄糖标准液：将分析纯葡萄糖在葡萄糖标准液：将分析纯葡萄糖在葡萄糖标准液：将分析纯葡萄糖在葡萄糖标准液：将分析纯葡萄糖在8080下烘至恒下烘至恒下烘至恒下烘至恒重，精确称取重，精确称取重，精确称取重，精确称取1.000g1.000g。加少量水溶解，移入。加少量水溶解，移入。加少量水溶解，移入。加少量水溶解，移入100mL100mL容量容量容量容量瓶中，加入瓶中，加入瓶中，加入瓶中，加入0.5mL0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。l l（3 3）100ug/ml100ug/ml糖标准液：精确吸取糖标准液：精确吸取糖标准液：精确吸取糖标准液：精确吸取1 1葡萄糖标准液葡萄糖标准液葡萄糖标准液葡萄糖标准液1mL1mL加入加入加入加入100mL100mL容量瓶中，加水定容。容量瓶中，加水定容。容量瓶中，加水定容。容量瓶中，加水定容。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006四、实验步骤四、实验步骤1 1标准曲线的制作：标准曲线的制作：标准曲线的制作：标准曲线的制作：取取取取20mL20mL刻度试管刻度试管刻度试管刻度试管1111支，从支，从支，从支，从0 01010分别编号，按表分别编号，按表分别编号，按表分别编号，按表27271 1加入溶液和水，加标准加入溶液和水，加标准加入溶液和水，加标准加入溶液和水，加标准糖液糖液糖液糖液0.00.0、0.100.10、0.200.20、0.400.40、0.600.60、0.800.80、1.201.20、1.601.60，用水补足至，用水补足至，用水补足至，用水补足至2ml.2ml.然后向试管内加入然后向试管内加入然后向试管内加入然后向试管内加入8.00mL8.00mL蒽蒽蒽蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸浴重新煮沸起，准确煮沸浴重新煮沸起，准确煮沸浴重新煮沸起，准确煮沸1010分钟取出，用自来水冷分钟取出，用自来水冷分钟取出，用自来水冷分钟取出，用自来水冷却，室温放置却，室温放置却，室温放置却，室温放置1010分钟左右，于分钟左右，于分钟左右，于分钟左右，于620nm620nm比色。以糖含比色。以糖含比色。以糖含比色。以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。出标准直线方程。出标准直线方程。出标准直线方程。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof20062可溶性糖的提取：可溶性糖的提取：取干或新鲜香菇子实体，取干或新鲜香菇子实体，擦净表面污物，剪碎混匀，称取擦净表面污物，剪碎混匀，称取1.0g，用，用80-90热水热水30ml，在，在80-90恒温水浴锅中提取恒温水浴锅中提取30分钟，分钟，4000rpm离心离心10分钟。收集上清，分钟。收集上清，沉淀重复提取一次，合并两次上清，用循环沉淀重复提取一次，合并两次上清，用循环水真空泵抽滤除去漂浮物。吸取滤液水真空泵抽滤除去漂浮物。吸取滤液1.0ml稀稀释至释至100ml，得待测样液。，得待测样液。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof20063 3测定：吸取测定：吸取测定：吸取测定：吸取2.0mL2.0mL样品液于试管中（重复样品液于试管中（重复样品液于试管中（重复样品液于试管中（重复2 2次），次），次），次），向试管内加入向试管内加入向试管内加入向试管内加入8.00mL8.00mL蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸1010分钟取出，用自来水冷却，室温放置分钟取出，用自来水冷却，室温放置分钟取出，用自来水冷却，室温放置分钟取出，用自来水冷却，室温放置1010分钟左右，分钟左右，分钟左右，分钟左右，于于于于620nm620nm比色。由标准线性方程求出糖的量，按下比色。由标准线性方程求出糖的量，按下比色。由标准线性方程求出糖的量，按下比色。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。式计算测试样品中糖含量。式计算测试样品中糖含量。式计算测试样品中糖含量。糖的含量（糖的含量（糖的含量（糖的含量（CnVCnV）/（WW）式中：式中：式中：式中：C C一标准方程求得糖量（一标准方程求得糖量（一标准方程求得糖量（一标准方程求得糖量（ugug）；）；）；）；一吸取样品一吸取样品一吸取样品一吸取样品液体积（液体积（液体积（液体积（mLmL）；）；）；）；V V提取液量（提取液量（提取液量（提取液量（mLmL）；）；）；）；n n一稀释倍一稀释倍一稀释倍一稀释倍数；数；数；数；WW一（一（一（一（g g）BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006五、思考题五、思考题1、简述苯酚法与蒽酮法测定可溶性糖、简述苯酚法与蒽酮法测定可溶性糖的基本原理。的基本原理。2、干扰可溶性糖测定的主要因素有哪、干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些？怎样避免？些？怎样避免？实验二实验二纸层析法分析氨基酸纸层析法分析氨基酸生物化学课程组生物化学课程组BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006一、实验目的一、实验目的1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法掌握纸上层析的一般原理和操作方法;2.了解氨基酸的特征性颜色反应了解氨基酸的特征性颜色反应;3.学会分析未知样品的氨基酸成分。学会分析未知样品的氨基酸成分。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006二、实验原理二、实验原理纸上层析是一种比较简单的色层层析法，这种方法所依据的纸上层析是一种比较简单的色层层析法，这种方法所依据的纸上层析是一种比较简单的色层层析法，这种方法所依据的纸上层析是一种比较简单的色层层析法，这种方法所依据的原理就是利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不原理就是利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不原理就是利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不原理就是利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同而达到分离的目的。实验是在特制的滤纸上进行。滤纸可同而达到分离的目的。实验是在特制的滤纸上进行。滤纸可同而达到分离的目的。实验是在特制的滤纸上进行。滤纸可同而达到分离的目的。实验是在特制的滤纸上进行。滤纸可视作惰性载体，吸附在滤纸上的水作为固定相，而有机溶剂视作惰性载体，吸附在滤纸上的水作为固定相，而有机溶剂视作惰性载体，吸附在滤纸上的水作为固定相，而有机溶剂视作惰性载体，吸附在滤纸上的水作为固定相，而有机溶剂作流动相。将要分离的混合物点在滤纸的一端，随着展开剂作流动相。将要分离的混合物点在滤纸的一端，随着展开剂作流动相。将要分离的混合物点在滤纸的一端，随着展开剂作流动相。将要分离的混合物点在滤纸的一端，随着展开剂的移动，由于各组分在两相中的分配系数不同，各组分就以的移动，由于各组分在两相中的分配系数不同，各组分就以的移动，由于各组分在两相中的分配系数不同，各组分就以的移动，由于各组分在两相中的分配系数不同，各组分就以不同速度在滤纸上随展开剂移动。展开剂停止移动，各组分不同速度在滤纸上随展开剂移动。展开剂停止移动，各组分不同速度在滤纸上随展开剂移动。展开剂停止移动，各组分不同速度在滤纸上随展开剂移动。展开剂停止移动，各组分就停留在滤纸的不同位置上。若各组分无色，可根据其性质。就停留在滤纸的不同位置上。若各组分无色，可根据其性质。就停留在滤纸的不同位置上。若各组分无色，可根据其性质。就停留在滤纸的不同位置上。若各组分无色，可根据其性质。喷上显色剂，以观察斑点的位置。喷上显色剂，以观察斑点的位置。喷上显色剂，以观察斑点的位置。喷上显色剂，以观察斑点的位置。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006用用用用RfRf值表示各组分的移动值表示各组分的移动值表示各组分的移动值表示各组分的移动率：率：率：率：a a为溶剂移动的距离，为溶剂移动的距离，为溶剂移动的距离，为溶剂移动的距离，b b为各组移动的距离。为各组移动的距离。为各组移动的距离。为各组移动的距离。Rf=a/bRf=a/b各组分的各组分的各组分的各组分的RfRf值随实验条件值随实验条件值随实验条件值随实验条件而变化，因此在鉴定时常而变化，因此在鉴定时常而变化，因此在鉴定时常而变化，因此在鉴定时常常采用标准样品对照。此常采用标准样品对照。此常采用标准样品对照。此常采用标准样品对照。此法一般适用于微量有机物法一般适用于微量有机物法一般适用于微量有机物法一般适用于微量有机物质（质（质（质（5-5005-500微克）的定性微克）的定性微克）的定性微克）的定性分析，分离出来的色点也分析，分离出来的色点也分析，分离出来的色点也分析，分离出来的色点也能用比色方法定量。能用比色方法定量。能用比色方法定量。能用比色方法定量。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006三、实验仪器及试剂三、实验仪器及试剂1、仪器：色谱缸（或带木塞和挂钩的试剂瓶）、仪器：色谱缸（或带木塞和挂钩的试剂瓶）、直尺、铅笔、新华一号滤纸量筒、喷雾器、直尺、铅笔、新华一号滤纸量筒、喷雾器、点样毛细管。点样毛细管。2、试剂：、试剂：1.0g/L天冬氨酸、天冬氨酸、1.0g/L蛋氨酸蛋氨酸1.0g/L亮氨酸、展开剂（正丁醇亮氨酸、展开剂（正丁醇:甲酸甲酸:水水=15:3:2）、）、0.1%茚三铜丙酮溶液。茚三铜丙酮溶液。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006四、实验步骤四、实验步骤1、点样、点样l l取取取取12151215厘米层析滤纸一张，在距下端厘米层析滤纸一张，在距下端厘米层析滤纸一张，在距下端厘米层析滤纸一张，在距下端1.5cm1.5cm处处处处用铅笔轻轻画一条与下端平行的直线，作为原点用铅笔轻轻画一条与下端平行的直线，作为原点用铅笔轻轻画一条与下端平行的直线，作为原点用铅笔轻轻画一条与下端平行的直线，作为原点线；距原点线线；距原点线线；距原点线线；距原点线1010厘米处再画一平行线，作为溶剂厘米处再画一平行线，作为溶剂厘米处再画一平行线，作为溶剂厘米处再画一平行线，作为溶剂前沿线。在原点线上用铅笔每隔前沿线。在原点线上用铅笔每隔前沿线。在原点线上用铅笔每隔前沿线。在原点线上用铅笔每隔2.3cm2.3cm处画一小处画一小处画一小处画一小圆圈，做为点样的位置。圆圈，做为点样的位置。圆圈，做为点样的位置。圆圈，做为点样的位置。l l用毛细管点样：每种用毛细管点样：每种用毛细管点样：每种用毛细管点样：每种5-20ul5-20ul为宜。点样的斑点直为宜。点样的斑点直为宜。点样的斑点直为宜。点样的斑点直径不要超过径不要超过径不要超过径不要超过0.3cm0.3cm。在整个操作过程中，手和其。在整个操作过程中，手和其。在整个操作过程中，手和其。在整个操作过程中，手和其它物质不要接触滤纸的层析部分（即展开相流经它物质不要接触滤纸的层析部分（即展开相流经它物质不要接触滤纸的层析部分（即展开相流经它物质不要接触滤纸的层析部分（即展开相流经的部分）。的部分）。的部分）。的部分）。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof20062、展开、展开l l将滤纸缝线成筒状，竖直放入层析缸中，先使滤将滤纸缝线成筒状，竖直放入层析缸中，先使滤将滤纸缝线成筒状，竖直放入层析缸中，先使滤将滤纸缝线成筒状，竖直放入层析缸中，先使滤纸不接触展开剂。在展开剂（正丁醇：甲酸：水纸不接触展开剂。在展开剂（正丁醇：甲酸：水纸不接触展开剂。在展开剂（正丁醇：甲酸：水纸不接触展开剂。在展开剂（正丁醇：甲酸：水=15=15：3 3：2 2）的蒸气中饱和）的蒸气中饱和）的蒸气中饱和）的蒸气中饱和2020分钟。然后使滤纸分钟。然后使滤纸分钟。然后使滤纸分钟。然后使滤纸浸入展开剂约浸入展开剂约浸入展开剂约浸入展开剂约1cm1cm。展开剂沿纸而上升，当达到。展开剂沿纸而上升，当达到。展开剂沿纸而上升，当达到。展开剂沿纸而上升，当达到前沿线时，取出滤纸，拆线，立即用铅笔划出溶前沿线时，取出滤纸，拆线，立即用铅笔划出溶前沿线时，取出滤纸，拆线，立即用铅笔划出溶前沿线时，取出滤纸，拆线，立即用铅笔划出溶剂前沿位置，晾干。剂前沿位置，晾干。剂前沿位置，晾干。剂前沿位置，晾干。3、显色、显色l l将滤纸干燥，向滤纸均匀喷洒将滤纸干燥，向滤纸均匀喷洒将滤纸干燥，向滤纸均匀喷洒将滤纸干燥，向滤纸均匀喷洒0.1%0.1%茚三酮的丙酮茚三酮的丙酮茚三酮的丙酮茚三酮的丙酮溶液，干燥后，电吹风吹干，用铅笔描出斑点形溶液，干燥后，电吹风吹干，用铅笔描出斑点形溶液，干燥后，电吹风吹干，用铅笔描出斑点形溶液，干燥后，电吹风吹干，用铅笔描出斑点形状。用尺测算各斑点的状。用尺测算各斑点的状。用尺测算各斑点的状。用尺测算各斑点的RfRf值，判断混合物中含有值，判断混合物中含有值，判断混合物中含有值，判断混合物中含有什么氨基酸。什么氨基酸。什么氨基酸。什么氨基酸。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006五、五、思考题思考题（1）纸层析法的特征和用途是什么？）纸层析法的特征和用途是什么？（2）影响）影响Rf值大小的因素有哪些？值大小的因素有哪些？（3）展开前为什么需要一个饱和过程？）展开前为什么需要一个饱和过程？实验三实验三氨基酸含量的测定氨基酸含量的测定生物化学课程组生物化学课程组BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006一、目的一、目的学习茚三酮比色法测定氨基酸学习茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理，学会具体的操作含量的原理，学会具体的操作方法，了解本方法的应用。方法，了解本方法的应用。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006二、原理二、原理氨基酸在一定氨基酸在一定PH范围内能与茚三酮范围内能与茚三酮溶液生成紫色化合物。该化合物颜溶液生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定可通过测定570nm处的光密度，测处的光密度，测定氨基酸的含量。定氨基酸的含量。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006三、三、实验仪器及试剂实验仪器及试剂（1 1）标准氨基酸溶液：配制成）标准氨基酸溶液：配制成）标准氨基酸溶液：配制成）标准氨基酸溶液：配制成200ug/mL200ug/mL溶液。溶液。溶液。溶液。（2 2）pH8.04pH8.04磷酸缓冲液：称磷酸二氢钾磷酸缓冲液：称磷酸二氢钾磷酸缓冲液：称磷酸二氢钾磷酸缓冲液：称磷酸二氢钾4.53504.5350克克克克定容定容定容定容500ml500ml；称磷酸氢二钠；称磷酸氢二钠；称磷酸氢二钠；称磷酸氢二钠11.938011.9380克定容克定容克定容克定容500ml.500ml.取取取取磷酸二氢钾磷酸二氢钾磷酸二氢钾磷酸二氢钾10ml10ml和磷酸氢二钠和磷酸氢二钠和磷酸氢二钠和磷酸氢二钠190ml190ml混合即混合即混合即混合即pH8.04pH8.04磷酸缓冲液。磷酸缓冲液。磷酸缓冲液。磷酸缓冲液。（3 3）0.2%0.2%茚三酮显色液：称取茚三酮显色液：称取茚三酮显色液：称取茚三酮显色液：称取1g1g茚三酮溶于茚三酮溶于茚三酮溶于茚三酮溶于35ml35ml热水，加入热水，加入热水，加入热水，加入40mgSnCl2.H2O40mgSnCl2.H2O搅拌过滤，滤液于冷搅拌过滤，滤液于冷搅拌过滤，滤液于冷搅拌过滤，滤液于冷暗处过夜，定容暗处过夜，定容暗处过夜，定容暗处过夜，定容50ml50ml。（4 4）样品液：每毫升含）样品液：每毫升含）样品液：每毫升含）样品液：每毫升含0.50.550g50g氨基酸。氨基酸。氨基酸。氨基酸。（5 5）分光光度计、水浴锅。）分光光度计、水浴锅。）分光光度计、水浴锅。）分光光度计、水浴锅。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006四、操作步骤四、操作步骤1 1、标准曲线的制作、标准曲线的制作、标准曲线的制作、标准曲线的制作l l分别取标准氨基酸溶液分别取标准氨基酸溶液分别取标准氨基酸溶液分别取标准氨基酸溶液0 0，0.4,0.8,1.0,1.2,1.6mL0.4,0.8,1.0,1.2,1.6mL于比色于比色于比色于比色管中，用水补足至管中，用水补足至管中，用水补足至管中，用水补足至4mL4mL。各加入。各加入。各加入。各加入1mL1mL缓冲液；再加入缓冲液；再加入缓冲液；再加入缓冲液；再加入1mL1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100100沸水沸水沸水沸水浴中加热浴中加热浴中加热浴中加热15min15min，冷却定容，冷却定容，冷却定容，冷却定容25ml25ml。放置。放置。放置。放置15min15min后，用分后，用分后，用分后，用分光光度计测定光光度计测定光光度计测定光光度计测定OD570nmOD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定反应呈黄色，应测定反应呈黄色，应测定反应呈黄色，应测定OD440nmOD440nm）。以）。以）。以）。以OD570nmOD570nm为纵坐为纵坐为纵坐为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。2 2、氨基酸样品的测定、氨基酸样品的测定、氨基酸样品的测定、氨基酸样品的测定l l取样品液取样品液取样品液取样品液1mL1mL，加入水，加入水，加入水，加入水3ml3ml，缓冲液，缓冲液，缓冲液，缓冲液1mL1mL和茚三酮显色液和茚三酮显色液和茚三酮显色液和茚三酮显色液1mL1mL，混匀后于，混匀后于，混匀后于，混匀后于100100沸水浴中加热沸水浴中加热沸水浴中加热沸水浴中加热15min15min，冷却定容，冷却定容，冷却定容，冷却定容25ml25ml。放置。放置。放置。放置15min15min后，摇匀后测定后，摇匀后测定后，摇匀后测定后，摇匀后测定OD570nmOD570nm。将样品测。将样品测。将样品测。将样品测定的定的定的定的OD570nmOD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。量。量。量。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006五、五、结果计算结果计算氨基酸含量（氨基酸含量（mmol/L）=OD570nm对应标准曲线查得值对应标准曲线查得值/1000BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006六、思考题六、思考题1茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定？的定性鉴定？实验四实验四蛋白质的两性性质蛋白质的两性性质及等电点的测定及等电点的测定生物化学课程组生物化学课程组BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006一、目的要求一、目的要求（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。电点与蛋白质分子聚沉的关系。（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。法。BiochemistrytheLogicofBiologicalPhenomenaMadebyZhangLinweifortheBioengineeringprogramintheSpringof2006二、实验原理二、实验原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除基团除基团除基团除NN端端端端氨基与氨基与氨基与氨基与CC端端端端羧基外，还有肽羧基外，还有肽羧基外，还有肽羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的