实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座.pptx

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目标要求,1.证实试验室环境与人体表明存在微生物。,2.体会无菌操作主要性。,3.观察不一样类群微生物菌落形态特征。,4.无菌操作，将分离经典菌落划线培养于固体斜面。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第1页,原理,经过培养方法使 肉眼看不见单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在一起肉眼可见菌落。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第2页,操作步骤,1.做好标识,2.不一样品采集,3.平板倒扣37,或室温培养,a,b,c,d,请注意无菌操作,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第3页,思索题,体会,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第4页,试验汇报,依据p8表格填写试验汇报。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第5页,试验4 显微镜使用及细菌简单染色法,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第6页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第7页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第8页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第9页,p43,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第10页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第11页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第12页,6.双眼同时睁开观察，降低眼睛疲劳，且可同时画图和统计。,7.可不佩戴眼睛操作，注意不要压破载玻片，不触碰样品处,8.双眼聚焦于同一个视野。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第13页,油镜使用,待后面演示,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第14页,简单染色法是只用一个染料使细菌着色以显示其形态方法难于区分细菌细胞构,造。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第15页,用于生物染色染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料离子带正电荷，能和带负电荷物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性溶液中时常带负电荷，所以通常采取碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料离子带负电荷，能与带正电荷物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，所以易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前二者结合物又称复合染料如伊红美蓝、伊红天青等。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第16页,三、试验材料,奥林巴斯普通光学显微镜（复式显微镜）,同学们分离纯化培养不一样菌株,草酸铵结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液,载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第17页,（一）、制作细菌观察片（单染色）,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第18页,（1）涂片在洁净无脂载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少许菌体与水滴充分混匀，用另外一个载玻片向一侧推菌悬液滴一次，涂成薄膜，涂布面积约11.5cm,2,。,（2）干燥将涂片于室温中自然干燥。,（3）固定手执载片端，使涂菌一面向上，将载片经过微火23次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，不然细菌形态毁坏。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第19页,（4）染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。,（5）水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下水中无染色液颜色为止。,（6）干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体。,（7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将经典部位移至视野中央，再用油镜观察。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第20页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第21页,一,二甲苯有毒，同学请注意安全，且会腐蚀镜头，不宜使用过多,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第22页,注意事项,1载玻片要洁净无脂，不然菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多（1小黄豆），挑菌量宜适中，菌膜宜薄，切忌过厚（不要往返涂抹）。,2在染色过程中，不可使染液干涸。,3.无菌操作，接种环一定要冷却后再取菌。,4.涂片干燥后加热固定，加热时间不宜过长（3-6次）,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第23页,问题和思索,1涂片在染色前为何要先进行固定?固定时应注意什么问题?,2制片为何要完全干燥后才能用油镜观察？,3.,使用油镜时，为何必须用香柏油？,4.,镜检标本时，为何先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第24页,五、试验汇报,(一)绘图（细菌形态图）P46,(二)单染色法操作关键点。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第25页,试验4 革兰氏染色法荚膜染色,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第26页,一、试验目标,目标：,1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术;,2.学习革兰氏染色法以及荚膜染色法；,3.掌握染色原理。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第27页,二、原理,革兰氏染色法法可将全部细菌区分为革兰氏阳性菌(G,)和革兰氏阴性菌(G,)两大类，是细菌学上是惯用判别染色法。该染色法所以能将细菌分为G,菌和G,菌，是由这两类菌细胞壁结构和成份不一样所决定。G,菌细胞壁中含有较多易被乙醇溶解类脂质，而且肽聚糖层较薄(10nm,2-3层)、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁通透性，使初染结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G,菌细胞壁中肽聚糖层厚（20-80nm，15-50层）且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，所以细菌仍保留初染时颜色。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第28页,金黄色葡萄球菌革兰氏染色图,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第29页,大肠杆菌革兰氏染色图,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第30页,革兰氏染色实际意义,(1)判别细菌:用此染色法可将全部细菌分为两大类,这么可将致病菌范围缩小,然后再深入判定.(2)选择药品:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差异,因而反抗菌素等药品敏感度不一.比如大多数阳性菌对青霉素敏感，大多数阴性菌对,青霉素,不敏感(,脑膜炎球菌,等除外),可供临床实践中选取抗菌药品参考.,(3)与致病性关系:大多数,革兰氏阳性菌,致病物质主要为,外毒素,;而大多数,革兰氏阴性菌,致病物质主要为,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第31页,荚膜是包围在细菌细胞外一层粘液状或胶质状物质，含水量大，其它成份多为多糖、多肽或糖蛋白。,细菌荚膜染色原理是因为荚膜和染料间亲和力弱，不易着色，且易被水洗去，通常采取负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。因为荚膜含水量在90以上，固染色时普通不加热固定，以免荚膜皱缩变形。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第32页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第33页,荚膜功效：抗吞噬作用：荚膜因其亲水性及其空间占位、屏障作用，可有效抵抗宿主吞噬细胞吞噬作用。粘附作用：荚膜多糖可使细菌彼此间粘链，也可粘附于组织细胞或无生命物体表面，是引发感染主要原因。抗有害物质损伤作用：处于细菌细胞最外层，荚膜如同盔甲可有效保护菌体免受或少受各种杀菌、抑菌物质损伤，如溶菌酶、补体等。抗干燥作用：荚膜多糖为高度水合分子，含水量在95%以上，可帮助细菌抵抗干燥对生存威胁。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第34页,形成条件：荚膜形成与环境条件亲密相关。普通在动物体内或含有血清或糖培养基中轻易形成荚膜，在普通培养基上或连续传代则易消失。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第35页,三、试验材料,革兰氏染色：,（1）黄色葡萄球菌(,Staphylococcus aureus,)、大,肠杆菌（,E.coli,）斜面；,（2）革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、,95乙醇、石炭酸复红液等)、,（3）香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种,环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第36页,四、试验步骤,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第37页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第38页,菌体适中，玻璃涂成薄膜，不宜太厚，用后接种环用火焰灭菌。,制作涂片,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第39页,晾干，易于染色,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第40页,固定，强度适中，不宜烫手,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第41页,初染,1-2min，全部染色过程染液不可干涸,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第42页,水洗至无色,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第43页,媒染,先冲去残留水，媒染1min，水洗并沥干,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第44页,脱色,脱色至流出液为无色，普通20-30s-1min，水洗并沥干。,整个过程不要靠近火焰。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第45页,复染,1-2min，全部染色过程染液不可干涸,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第46页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第47页,water,水洗，晾干，镜检。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第48页,注意事项,1、染料防止干涸，酒精脱色务必避开火焰。,2、老龄菌易被染成红色（细胞通透性出现改变），造成假阳性。普通选取生长活跃菌体进行染色。（18h-32h）,3、涂片过厚或菌悬液过浓，造成细胞大量堆积，轻易造成脱色不完全，造成假阳性。染色结果以分散良好细菌染色结果为准。,4、酒精脱色不够造成假阳性，脱色过渡造成假阴性。,5、控制好染色区域，确保整个染色过程及最终镜检在同一个区域进行，可用铅笔标识。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第49页,思索题,可用什么方法证实革兰氏染色是成功？（混合涂片）,革兰氏染色中，哪一个步骤能够省去而不影响最终止果？在什么情况下能够采取？,革兰氏染色哪一步最关键？,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第50页,五、试验内容及结果,大肠菌、金黄葡萄球菌革兰氏染色，绘图，并统计染色结果（颜色，G,+,或G,-,）及放大倍数（包含物镜及目镜）。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第51页,荚膜染色,试验材料,：,(l)生技术班同学培养一株细菌（SJJM）,(2)石炭酸复红染色液、黑色液（墨汁）。,(3)载玻片、接种环、洗瓶。,(4)显微镜。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第52页,试验步骤,1制片：在,洁净,载玻片一端滴一滴无菌水，取少许细菌在水滴中制成悬液。取,一小滴,新配好黑色素溶液（也可用墨汁）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整边缘与菌悬液以30度角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄一层，风干。2,固定：,用纯甲醇固定1分钟，马上倾去甲醇，自然晾干。3染色：加结晶紫/番红/碱性复红/甲基紫染液数滴于涂片上，染1-2min，以细水流适当冲洗，吸去水后自然晾干。4.油镜观察结果。,先用低倍镜再高倍镜观察。,结果：背景黑色，菌体紫色或红色，荚膜呈一清楚透明圈。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第53页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第54页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第55页,注意事项,1、玻片洁净无油脂。,2、墨水使用量适中，关键是涂片要薄。,3、整个过程不加热，固定使用甲醇，甲醇有较强毒性，对人体神经系统和血液系统影响最大，请同学使用过程尤其留心。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第56页,思索题,1、荚膜染色，为何不能热固定？,2、荚膜负染法，荚膜为何不着色而菌体着色？,3、在荚膜Anthony氏染色法中，硫酸铜溶液作用是什么？,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第57页,试验内容及结果,菌株,SJJM 荚膜染色，,绘图，统计染色结果（菌体及荚膜形态）及放大倍数（包含物镜及目镜）。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第58页,球菌：SJJM菌株光学显微镜图（简单染色）,放大倍数：1000倍,存在其它问题：细菌形态不规则，菌体有缺口，各种形态细菌混杂而未标注。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第59页,试验5 细菌芽孢和鞭毛染色,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第60页,一、试验目标,目标：,1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术;,2.学习并掌握细菌芽孢和鞭毛染色方法及染色原理；,3.了解细菌芽孢和鞭毛形态特征。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第61页,细菌芽孢染色,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第62页,芽孢是菌种分类判定主要指标，在菌落形态上也有其相关特征。形成芽孢细菌菌落表面普通为粗糙不透明，常展现褶皱,枯草芽孢杆菌菌落,1 背景知识,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第63页,有些细菌（多为,杆菌,）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成一个抗逆性很强,圆形、椭圆形或圆柱形,休眠体。,1个细菌细胞只形成1个芽孢，有在,中部,，有在,偏端,，有在,顶端,。,在有些细菌中，,芽孢直径小于菌体直径,，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，,芽孢直径大于菌体直径,，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌。,产芽孢细菌,多为杆菌,，在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽孢，球菌中只有芽孢八叠菌（Sporosarcina）属产芽孢。弧菌中只有芽孢弧菌属(Sporovibrio)产芽孢。,1背景知识,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第64页,芽孢形成过程,DNA浓缩,形成束状,质膜内陷,前芽孢双,层膜形成,合成DPA,芽孢,裂解,皮层,合成,孢衣,合成,1背景知识,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第65页,芽 孢 结 构,1背景知识,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第66页,2染色 原 理,染色特征：,芽孢壁比营养细胞细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。一旦着色，又难以被水洗脱。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第67页,处理方法：,普通采取碱性染料并在,微火上加热,，或,延长染色时间,，使菌体和芽孢都同时染上色后，再用,脱色剂,冲洗，脱去菌体颜色，但仍保留芽孢颜色。并用另一个对比鲜明染料使菌体着色,（复染），,如此能够在显微镜下显著区分芽孢和营养体形态。,通常，,芽孢染色采取弱碱性染料孔雀绿在加热条件下进行。染色完成，用蒸馏水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结协力较差，所以易被水冲洗掉，而进入芽孢孔雀绿却难于溶出。水洗后，再用一个呈红色碱性染料复染，使菌体和芽孢展现不一样颜色。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第68页,3 实 验 材 料,仪器及器材：,显微镜、酒精灯、试管夹、,接种环,载玻片、镊子、洗瓶、吸水纸、擦净纸。,试剂：5%,孔雀石绿、0.5%番红复染液、,香柏油、二甲苯,菌种：,LB斜面上培养2448小时枯草芽孢杆菌和SGLL菌株斜面。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第69页,4 染色步骤,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第70页,菌悬液、涂片、干燥、固定,3-5滴,充分水洗,充分水洗,染色结果：,芽孢,绿色,，菌体,红色,。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第71页,16h,48h,16-48h之间,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第72页,枯草杆菌石炭酸复红染色图片,枯草杆菌吕氏美蓝,染色图片,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第73页,5 注意事项,1.选取菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢囊为宜，取菌适中。,2.涂片要薄，且固定时温度控制好；,3.加热染色要用微火，加热过程中要及时补充染液，切勿让染液干涸；,4.染色时间掌握；,5.水洗时水流不能急，不能冲有菌一边；6.,孔雀石绿,有高度毒性.,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第74页,思索题,芽孢染色为何要加热？,为何经孔雀绿染色后，水洗再复染红色染液只能染上菌体？,用革兰氏染色能否看到芽孢？,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第75页,6 试验汇报,绘制芽孢染色图。对染色结果进行简单分析描述。,注意芽孢在菌体内位置、大小和形状；,注意芽孢颜色和菌体颜色。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第76页,细菌鞭毛染色,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第77页,1 背景知识,鞭毛(flagellum,复flagella),生长在一些细菌体表长丝状、波状弯曲蛋白质从属物称为鞭毛，其数目为一至数十条，含有运动功效。鞭毛长约1520mm，直径为0.010.02mm，鞭毛细长透明。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第78页,鞭毛是细菌运动“器官”，细菌是否含有鞭毛以及鞭毛着生位置是细菌一项主要形态特征。,大多数球菌无鞭毛，有些杆菌生有鞭毛，螺旋菌都生有鞭毛。,幼龄菌运动活泼，老龄菌运动性差或失去鞭毛不能运动。（水制片观察-泳动或旋转，减弱光照强度）,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第79页,观察和判断细菌鞭毛方法：,电子显微镜直接观察,光学显微镜下观察：鞭毛染色和水制片,依据培养特征判断：半固体穿刺、菌落（菌苔）形态,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第80页,细菌鞭毛(flagellum)电镜照片（引自“Foundations of Microbiology）,侧生、端生、周生,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第81页,2 染色原 理,鞭毛染色特征：,细菌鞭毛细长透明，直径普通为1020nm，其宽度在普通光学显微镜波长检验范围之外，只有用电子显微镜才能直接观察到。不过，如采取特殊染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。,处理方法：,鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色，便可到达普通光学显微镜辨析范围以内。惯用媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。,菌龄选择：,鞭毛菌只有在一定群体和个体发育阶段才产生鞭毛。普通外界条件适宜时，菌龄年轻培养体易产生鞭毛，菌龄老培养体鞭毛轻易脱落。菌落或菌苔尽可能取边缘部分菌体。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第82页,3 实 验 材 料,仪器及器材：,Motic显微镜、酒精灯、,接种环、,载玻片、盖玻片、镊子、洗瓶装蒸馏水、吸水纸、擦净纸。,菌种：,在LB斜面上培养1836小时SG2和SJxyz菌株.,试剂：,硝酸银染色液（新鲜配制）、香柏油、,二甲苯。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第83页,4 实 验 内 容,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第84页,细菌运动性观察（选做）,水制片,1.制片用滴管取菌悬液一小滴，置于洁净载玻片中央，以倾斜法加上盖玻片（勿使产生气泡）,2.镜检将载玻片置显微镜下，用低倍镜、高倍镜观察细菌运动情况。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第85页,鞭毛染色,硝酸银法：,清洗玻片菌液制备及制片滴加A液，染810min,蒸馏水,充分洗净A液用3-5滴B液涤去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上微热至冒气，约维持0.51min（加热时应随时补充蒸发掉染料，不可使玻片出现干涸区用,蒸馏水洗,，自然干燥镜检,染色结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。,轻轻沾洗下菌体，,成菌悬液，倾斜让菌悬液,从玻片一侧流向另一侧，,由流过水痕形成菌薄膜,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第86页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第87页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第88页,5 注意事项,1菌龄，挑取菌苔边缘幼龄菌体。,2所用玻片要选择光滑无划痕，洁净无油脂。3染色液一定要新鲜，尤其是硝酸银染色法中更是如此，A染液和B染液最好都现用现配。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第89页,4取菌后接种环在载片上蒸馏水中,轻轻,沾洗下菌体即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开，将载片稍倾斜，使菌液,自然滑落,形成水膜，不然鞭毛易脱落，造成染色失败。,5.鞭毛染色玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，,不能热固定,，这是因为加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。,6.染色后用,蒸馏水,（自来水效果差）冲洗时一定要充分，不然背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响试验效果。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第90页,6 思索题,、菌种培养时间与鞭毛染色有什么关系？、你在显微镜下看到鞭毛是否为原来大小,、鞭毛涂片与芽孢涂片有何区分？为何？,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第91页,7 试验汇报,绘制鞭毛染色图，并对试验结果进行分析描述,注意显微镜下检验鞭毛染成什么颜色和形状、比较菌种鞭毛着生位置、数目,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第92页,革兰氏染色效果良好,荚膜染色效果差-无荚膜或荚膜不显著，黑色素染液涂片厚度及次序（制作方案）,绘图进步较大，但菌体百分比尚需注意,放大倍数仍有些人犯错,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第93页,球菌：SJJM菌株光学显微镜图（简单染色）,放大倍数：1000倍,存在其它问题：细菌形态不规则，菌体有缺口，各种形态细菌混杂而未标注。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第94页,试验八 酵母菌形态观察、大小测定和计数,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第95页,酵母菌的形态观察,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第96页,背景知识,酵母菌是一个通俗名称，普通泛指能发酵糖类各种单细胞真菌。酵母菌能发酵糖类产能，其生境普通为高糖、偏酸。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第97页,一 试验目标,1.观察酵母形态及出芽生殖方式,2.学习区分酵母菌死活细胞判别方法,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第98页,背景知识,宏观,菌落特征,：和细菌菌落极为相同，表面,湿润、粘稠,，与培养基结合不紧密，易挑起。但比细菌,菌落大而厚,，颜色比较单一，大多乳白色、只有少数为红色、黑色等，不一样种类菌落在形态、质地和边缘特征上均表现不一样。菌落,光滑或起皱,，平整或突起，边缘圆整或有不规则毛状物。菌落特征可作为酵母菌菌落判定依据之一。,（总之，,酵母菌细胞较细菌细胞大10倍左右，表现在菌落形态上就有酵母菌菌落直径较大、菌落隆起显著等特点）,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第99页,细胞结构,微观：酵母菌是单细胞真核微生物，细胞核和细胞质有显著分化，,个体直径比细菌大几倍甚至几十倍，大小约1-55-30微米。最长可达100微米。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第100页,酵母菌形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等各种。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第101页,酵母菌繁殖方式为无性繁殖和有性繁殖两种。正常情况下以无性繁殖为主，无性繁殖主要方式是出芽方式，有是分裂繁殖；酵母菌有性繁殖形成子囊和子囊孢子。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第102页,成熟酵母菌细胞，先长出一个小芽，芽体细胞长到一定程度，脱离母细胞继续生长，尔后形成新个体。有多边出芽、两端出芽、和三边出芽。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第103页,芽痕-蒂痕（啤酒酵母）,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第104页,依据酿酒酵母细胞表面留下芽痕数目，就可确定某细胞曾产生过芽体数，因而也可用于测定该细胞年纪。在任何酵母群体中，50细胞是由最近一代细胞分裂所产生，故在其表面仅有一个蒂痕而无芽痕；在其余50细胞中，25含有一个芽痕，12.5含有两个芽痕，而12.5则含有两个以上芽痕。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第105页,二 染色原理,因为细胞个体大，采取涂片方法制片有可能损伤细胞，普通经过,美兰染液水浸片法,或水-碘液浸片法来观察酵母形态和出芽生殖方式。,美蓝是一个,无毒性染料,，是,活体染料,一个，是碱性染料。它特征是,氧化态呈蓝色,，,还原态呈无色,。用美蓝对酵母活细胞进行染色时，因为细胞,新陈代谢作用,，细胞内含有较强,还原能力,，能使美蓝由蓝色氧化型变为无色还原型。,所以，含有还原能力酵母活细胞是无色、而死细胞或新陈代谢微弱衰老细胞呈蓝色和淡蓝色，借此即可对酵母细胞进行死活判定。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第106页,三、试验材料：,1.菌种 啤酒酵母斜面,2.染液 吕氏碱性美蓝液,3.器材及用具 接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸管、镊子、显微镜、恒温培养箱。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第107页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第108页,酿酒酵母菌细胞形态多为卵圆形，在高倍镜下清楚可见，并可观察到其细胞内液泡及颗粒状内含物，但观察不到细胞核。,芽殖形态为：在较大母细胞上生长着较小子细胞，二者间呈藕节状连接。细胞呈无色为活细胞，呈蓝色为死细胞或衰老细胞。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第109页,注意事项,制备菌悬液时，不要猛烈涂抹，以免破坏细胞。,水制片，染料或蒸馏水不宜过多或过少，不然在盖上盖玻片时，菌液轻易溢出或产生气泡，影响观察。,盖玻片不宜平着放下，应倾斜慢放，防止产生大量气泡。,注意区分出芽与酵母菌重合情况。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第110页,五、试验结果,图示酿酒酵母菌细胞、芽殖形态。对试验进行简单分析、描述。统计死、活细胞大致百分比P75。,思索题：,1.在显微镜下，酵母菌有哪些突出形态特征区分于普通细菌。,2.吕氏碱性美蓝染液浓度及作用时间不一样，对酵母菌死细胞数量计数有什么影响，试分析其原因。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第111页,微生物细胞大小的测定,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第112页,一.试验目标,学习测微技术，测量酵母细胞,直径,（宽度）和长度。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第113页,二.试验原理,微生物细胞大小是微生物主要形态特征之一。因为菌体很小，只能在显微镜下来测量。光学显微镜中，用来测量细胞大小工含有,目镜测微尺和镜台测微尺,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第114页,目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成,50等分,，或把10 mm长度刻成,100等分,。测量时，将其放在接目镜中隔板上(此处恰好与物镜放大中间像重合)来测量经显微镜放大后细胞物象。因为在显微镜不一样接目镜和接物镜系统下，放大倍数不一样，目镜测微尺每格所表示长度随显微镜放大倍数而改变。所以在,使用前，须用镜台测微尺来校正目镜测微尺。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第115页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第116页,镜台测微尺形如载玻片，在中央圆形盖片下，有一长为,1mm,刻度，准确等分为,100格,，每格长,10m,。故用已知长度台尺校正目尺，即可求出目尺一格长度。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第117页,三.试验器材,1.菌种酵母菌悬液,2.器材目镜测微尺、镜台测微尺、显微镜、盖玻片、无菌滴管、双层瓶、擦镜纸等。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第118页,四 试验步骤,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第119页,1.将目镜测微尺装入目镜内，刻度朝下，并将镜台测微尺置载物台上。,2.用低倍镜观察到镜台测微尺刻度。,3.换用高倍镜测量，先用镜台测微尺标定。计算出目镜测微尺每格长度。移动镜台测微尺和转动目镜测微尺，,使二者刻度平行,，并使,两尺第一条线重合,。,向右寻找另外相重合直线,，统计两重合刻度间目镜测微尺和镜台测微尺格数，由公式算出目镜测微尺每格长度。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第120页,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第121页,五,.,试验汇报,将试验结果统计于，表中,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第122页,注意事项,光线调整，不宜太亮，以免找不到台尺,菌体不一样生长阶段细胞大小改变大，以对数生长久菌体材料为宜，但直径相对稳定。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第123页,试验完成注意事项,台尺回收，交于老师；,清理显微镜物镜及台面卫生，显微镜按编号放回厨子,上交前两次试验试验汇报（给学习委员）,此次预习汇报签字,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第124页,作业点平（芽孢、鞭毛染色）,芽孢脱落,芽孢大小，是相对于菌体而言,芽孢未染上颜色原因时间及温度,鞭毛脱落或无（染色浅）-时间、温度,鞭毛是否周生或侧生或端生分辨不清,鞭毛颜色相对于细菌而言，较浅,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第125页,画图要求,1.含有高度科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，,百分比要正确，要求真实感，,立体感，精美而美观。,2.图面要力争,整齐,，,铅笔,要保持尖锐,，尽可能少用橡皮。,3.绘图大小要适宜，位置略偏左，,右边留着注图,。,4.绘图线条要,光滑、匀称,，,点点,要大小一致。,5.绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用,直尺,画出，间隔要均匀，且普通多向右边引出，图注部分靠近时可用折线，但注图线之间,不能交叉,，图注要尽可能排列整齐。,6.绘图完成后在图下方注明图名及放大倍数,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第126页,微生物的显微直接计数,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第127页,一、目标要求,了解血球计数板结构和原理,学会用血球计数器测定酵母菌细胞数,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第128页,二、基本原理,-,计数,用血细胞计数板计数是一个惯用微生物计数方法。该计数板是一块特制载玻片，由四条槽组成三个平台，中间较宽平台被一短横槽隔成两半，每一边平台上各刻有一个方格网，每个方格框共分为九个大方格，中间大方格即为计数室。,因为计数室容积是一定（0.1mm3），所以能够依据在显微镜下观察到微生物数目来换算成单位体积内微生物总数目。,1 2 3 4,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第129页,不可用油镜,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第130页,9个大格,计数室宽1mm,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第131页,25中格16小格 16中格 25小格,计数时，先数五个中方格总菌数，求得每个中方格平均值，,再乘以25或16，得出大方格总菌数，再换算成1ml菌液中总菌数。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第132页,三、材料与器材,1、材料,酵母菌悬液（自己制备）,2、器材,血球计数板、显微镜、盖玻片、滴管等。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第133页,四、操作步骤,1 稀释,将酵母菌悬液进行适当稀释。,2 镜检计数室,在加样前，先对计数板计数室进行镜检。（清洗，晾干）,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第134页,3 加样品,将清洁干燥血球计数板盖上盖玻,片，再用洁净细口滴管将稀释,均匀,酵母,菌液滴入（不宜过多或过少，从一侧沟,槽慢慢滴入，让其自然漫过计数室，至对侧沟槽充满菌液为止,），,静置,5-10min即可计数。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第135页,4 显微镜计数,先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成,高倍镜（40倍）,进行计数。（有显微镜40倍物镜不佳，到时需要协调使用）,5.清洗,清洗计数板：用水柱冲洗血球计数板，吹干。镜检，确认无残留物。计数板干燥后装回盒子，交回试验室老师，以备后用。,清洗显微镜物镜并整理好台面卫生。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第136页,注意事项:,制备菌悬液，防止刮取到培养基；,取样时先要,混匀,菌液;,加样时计数室不可有气泡产生；,加样量适中；,调整显微镜光线强弱适当；,计数板上刻度精细，清洗勿用刷子或硬物，也不可用酒精灯火焰烘烤。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第137页,对于,出芽,酵母菌，芽体到达母细胞大小二分之一时，即可作为两个菌体计算。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第138页,数上不数下，数左不数右,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第139页,五、思索题,1、用血球计数板计数时，哪些步骤易造成,误差？,2、血球计数板测定原理是什么？它有哪些优点及缺点？p52,3、用两种不一样规格计数板测同一样品,时，其结果一样？,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第140页,六、试验汇报,1 ml菌液中总菌数=A/5,25,10,4,B,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第141页,试验 9 水细菌学检验 1.水中细菌总数测定,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第142页,一、目标要求,（1）学习并掌握水体中细菌总数检验方法、检验原理、数据处理和汇报方法。,（2）强化水体细菌总数检验卫生意义知识。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第143页,背景知识,水中细菌总数往往同水体受有机物污染程度呈正相关。所以，它是评价水质污染程度个主要指标之一。,细菌总数越大，说明水体被污染得越严重。,因为重金属及一些其它有毒物质对细菌有杀灭或抑制作用，在总细菌数少水样中并不能排除这些物质污染。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第144页,良好饮用水 细菌总数应小于100CFU/mL(colony forming units),而大于500CFU/mL则不宜饮用。,我国饮用水卫生标准（GB5749-85）要求每毫升水样细菌总数37培养24小时不得大于100CFU。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第145页,二、基本原理,本试验应用平板计数技术（稀释混合平板法、稀释涂布平板法）测定水中细菌总数。因为水中细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件要求差异很大，不可能找到一个培养基在一个条件下，使水中全部细菌均能生长繁殖，所以，以一定培养基平板上生长出来菌落，计算出来水中细菌总数仅是一个近似值。当前普通是采取普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第146页,三、试验材料,1.水样采取：,（1）自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。,（2）池水、河水或湖水应取距水面1015cm深层水样，先将灭菌带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好马上检验，不然需放入冰箱中保留。,2.其它试验材料,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水；,灭菌三角烧瓶，灭菌带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，EP离心管及架子，培养箱等,实验室环境和人体表面微生物的检查分离专家讲座,第147页,四 试验步骤（,稀释涂布平板法）,1）自来水,（a）用灭菌吸管