五发酵动力学.pptx

研究目的研究目的：v进行最佳发酵工艺条件的优选和控制，如发酵过程中菌体浓度、基质浓度、温度、pH值、溶解氧等工艺参数；v根据发酵动力学模型来设计程序，模拟最合适的工艺流程和发酵工艺参数，使生产控制达到自动化和最佳化；v为试验工厂数据的放大和分批发酵过渡到连续发酵提供理论依据。第1页/共85页v第一节第一节 微生物生长代谢过程中的质量平衡微生物生长代谢过程中的质量平衡v一、微生物反应一、微生物反应(生长代谢生长代谢)过程中的碳平衡过程中的碳平衡v微生物反应通式：微生物反应通式：v 碳源氮源碳源氮源O2菌体产物菌体产物CO2+H2Ov微生物代谢的化学分子反应可表示为：微生物代谢的化学分子反应可表示为：vCHmOn+aNH3+bO2YcCHxOyNz+YcpCHuOvNwv +(1-Yc-Ycp)CO2+dH2OvYc：是与碳相关的菌体得率，：是与碳相关的菌体得率，vYcp：是与碳相关的代调产物的得率。：是与碳相关的代调产物的得率。第2页/共85页v根据反应平衡原理有：根据反应平衡原理有：vaYcz+Ycpwvb(1-Yc-Ycp+m/4-n/2)+(Ycp/4)v (2v+3w-u)+(Yc/4)(2y+3z-x)vdm/2+(Ycp/2)(3w-u)+(Yc/2)(3z-x)10-2式式第3页/共85页v1 1、最低培养基与完全培养基、最低培养基与完全培养基v (1)(1)二者的概念；二者的概念；v最低培养基：最低培养基：培养基是由单一碳源葡萄糖与无培养基是由单一碳源葡萄糖与无机盐组成机盐组成，葡萄糖在微生物生长过程即作为生葡萄糖在微生物生长过程即作为生长所需能源长所需能源，又作为构成菌体的材料又作为构成菌体的材料v完全培养基：完全培养基：在培养基内不但含有碳源和无机在培养基内不但含有碳源和无机盐盐，还含有构成菌体所需的材料还含有构成菌体所需的材料，如酵母膏等如酵母膏等v (2)(2)微生物对两种培养基的用途不同。微生物对两种培养基的用途不同。第4页/共85页第5页/共85页第6页/共85页v2 2、代谢过程中基质和产物之间的、代谢过程中基质和产物之间的C C素平衡素平衡v根据基质的变化情况可建立如下平衡关系：根据基质的变化情况可建立如下平衡关系：v C CS S=C=CX X+C+CP P+C+CCOCO2 2 如果用如果用1 1、2 2、3 3、4 4表示基质、菌体、表示基质、菌体、COCO2 2、产物中碳的含量、产物中碳的含量(g(g碳碳/mol)/mol)则，上述平衡也可表示为：则，上述平衡也可表示为：第7页/共85页（微生物的基质消耗比速）微生物的基质消耗比速）（微生物的生长比速）微生物的生长比速）（微生物的微生物的COCO2 2生成比速）生成比速）（微生物的产物生成比速）（微生物的产物生成比速）若定义：若定义：则，上式可简化为：则，上式可简化为：第8页/共85页v由上式可以判断代谢途径：由上式可以判断代谢途径：此值此值接近接近1 1，说明估计途径基本正确；，说明估计途径基本正确；小于小于0.60.6，则途径有误差。，则途径有误差。第9页/共85页v3 3、微生物生长过程中的主要基质、微生物生长过程中的主要基质碳平衡碳平衡v 在以糖为碳源的生长过程中，消耗的碳在以糖为碳源的生长过程中，消耗的碳(S)(S)主要主要用来：用来：v(1)(1)满足菌体生长满足菌体生长(个体增加个体增加)的需要，的需要，(S)(S)G G；v(2)(2)维持菌体生存维持菌体生存(能量能量)的消耗，的消耗，(S)(S)m m ；v(3)(3)转变为代谢产物所消耗，转变为代谢产物所消耗，(S)(S)P P ；v则可表示为：则可表示为：第10页/共85页若用若用YG 表示用于微生物生长的部分碳源对菌体的得率表示用于微生物生长的部分碳源对菌体的得率常数；常数；m 表示微生物的碳源维持常数；表示微生物的碳源维持常数；YP 表示用于微生物产物合成部分碳源对代谢产物表示用于微生物产物合成部分碳源对代谢产物的得率常数；的得率常数；则有则有第11页/共85页v所以：所以：-式（式（10-7）在以细胞为目的产物的发酵生产中，如果在以细胞为目的产物的发酵生产中，如果忽略忽略代谢产物代谢产物的量，则有：的量，则有：第12页/共85页m m(h(h-1-1)Y YG G1 1v用用对对作图，得直线，可作图，得直线，可求得维持常数求得维持常数m m，用于微生物生长的用于微生物生长的碳源对菌体的得率常数碳源对菌体的得率常数Y YG G的的倒数。如下图所示：倒数。如下图所示：第13页/共85页v若定义若定义YX/S为基质对菌体的得率，即：为基质对菌体的得率，即：则：则：而：而：第14页/共85页v即有：即有：用用-1-1对对 作图，也得直线。作图，也得直线。Y YG G1 1斜率斜率m m-1-1第15页/共85页v4 4、细胞物质生产过程中碳源的化学平衡、细胞物质生产过程中碳源的化学平衡v YG 越接近越接近YX/S，说明碳源转化为菌体的效率，说明碳源转化为菌体的效率越高。越高。v 注意理解注意理解YX/S与与YG的区别的区别v5、微生物生长过程中进行碳衡算的意义、微生物生长过程中进行碳衡算的意义(1)为提高生产水平提供依据。为提高生产水平提供依据。(2)为建立发酵动力学模型奠定基础。为建立发酵动力学模型奠定基础。(3)为探求为探求X的代谢调控方式打下基础。的代谢调控方式打下基础。第16页/共85页v二、生长代谢过程中的二、生长代谢过程中的ATPATP循环与氧平衡循环与氧平衡v1 1、ATPATP循环循环合成代谢合成代谢分解代谢分解代谢维持代谢维持代谢ATPATPADPADP繁殖繁殖第17页/共85页第18页/共85页v2 2、ATPATP的产生的产生生物氧化生物氧化v 底物水平磷酸化底物水平磷酸化(获得能量少获得能量少)v 电子传递水平磷酸化电子传递水平磷酸化(获得能量多获得能量多)第19页/共85页底物水平磷酸化底物水平磷酸化第20页/共85页H2OPi底物水平磷酸化底物水平磷酸化第21页/共85页NADHNADH呼吸链呼吸链H2O12O2O2-MH2还原型代还原型代 谢底物谢底物FMNFMNH2CoQH2CoQNAD+NADH+H+2Fe2+2Fe3+细胞色素细胞色素b-c-c1-aa3 Fe S2H+M氧化型代氧化型代 谢底物谢底物FADHFADH2 2呼吸链呼吸链FADFADH2琥珀酸琥珀酸 Fe S2Fe2+2Fe3+细胞色素细胞色素b-c1-c-aa3CoQH2CoQ12O2O2-2H+H2O延胡索酸延胡索酸第22页/共85页v3 3、微生物生长代谢过程中的、微生物生长代谢过程中的氧平衡氧平衡v 根据单一碳源培养基内，可建立下列平衡：根据单一碳源培养基内，可建立下列平衡：v A(-S)=B(X)+C(P)+(OA(-S)=B(X)+C(P)+(O2 2)v式中：式中：A A、B B、C C 分别为对应物质完全氧化时的需氧分别为对应物质完全氧化时的需氧量量.OO2 2 为微生物生长代谢的耗氧量为微生物生长代谢的耗氧量v由此可得到由此可得到M M培养时氧平衡式为培养时氧平衡式为（假设没有产物生成）：即：即：-式（式（10-10）第23页/共85页O O2 2单位时间内维持生命活动的耗氧：单位时间内维持生命活动的耗氧：m m0 0XtXt生长菌体的耗氧：生长菌体的耗氧：X/YX/YGOGOY YGOGO用于菌体生长的氧对菌体的得率用于菌体生长的氧对菌体的得率则有：则有：O O2 2 m m0 0XtXtX/YX/YGO GO-（10-1110-11）根据定义并结合根据定义并结合10-11式，有：式，有：-式（式（10-12）X 第24页/共85页m m0 0(h(h-1-1)Y YGOGO1 1 当：由实验求得微生物的某一生长比速当：由实验求得微生物的某一生长比速对对其所对应的其所对应的耗氧比速耗氧比速QoQo2 2作图时，可得到一直线作图时，可得到一直线(如下图所示如下图所示)，可确定相应的参数，可确定相应的参数m mo o和和1/Y1/YGOGO。第25页/共85页-式（式（10-7）-式（式（10-13）同时，前面可知同时，前面可知第26页/共85页由（由（10-1310-13）和（）和（10-710-7）式可得）式可得有：有：第27页/共85页v第二节第二节 微生物生长数学模型的建立微生物生长数学模型的建立v 酶反应服从米氏方程：酶反应服从米氏方程：第28页/共85页v 微生物葡萄糖的比消耗速率与限制性底物浓度的关微生物葡萄糖的比消耗速率与限制性底物浓度的关系也类似于米氏方程，即：系也类似于米氏方程，即：式中：式中：maxmax葡萄糖最大的消耗比速；葡萄糖最大的消耗比速；K KS S饱和常数；饱和常数；式式(1)(1)v研究发现：研究发现：v 微生物连续培养过程以葡萄糖作为限制性基质，其微生物连续培养过程以葡萄糖作为限制性基质，其浓度的倒数浓度的倒数1/S1/S与葡萄糖比消耗速率的倒数与葡萄糖比消耗速率的倒数1/1/呈呈线性关系；葡萄糖浓度线性关系；葡萄糖浓度SS与其比消耗速率与其比消耗速率v v的关系呈的关系呈饱和曲线饱和曲线。第29页/共85页v由基质消耗对细胞得率由基质消耗对细胞得率Y YX/SX/S定义：定义：有：有：v根据根据的的定义有定义有：第30页/共85页v该式就是该式就是MonodMonod方程，方程，v式中：式中：vmaxmax：最大比生长速率：最大比生长速率(h(h-1-1)。vK KS S：为饱和常数，表示菌体对基质的亲和力的大小。：为饱和常数，表示菌体对基质的亲和力的大小。vSS：限制性基质浓度：限制性基质浓度第31页/共85页vMonodMonod式的生物学意义：式的生物学意义：v1 1、maxmax、K KS S：v (1)(1)特定特定M M，确定培养条件，确定培养条件，maxmax、K KS S是定值，体是定值，体现现M M的特性的特性;v (2)(2)不同不同M M，maxmax、K KS S不同，但：不同，但：maxmax变化小，而变化小，而K KS S变化大。变化大。v (3)(3)同种同种M M，在不同，在不同S S中，中，maxmax、K KS S值不同。值不同。K KS S,亲和力亲和力，M M对基质越不敏感；反之亲和力大，敏感。对基质越不敏感；反之亲和力大，敏感。v（4 4）K KS S数值上等于生长比速达到最大生长比速一半数值上等于生长比速达到最大生长比速一半时的基质浓度时的基质浓度第32页/共85页 KS越大，表示微生物对营养物质的吸引亲和力越小，反之越大。对于许多微生物来说，KS值是很小的，一般为0.1120mg/l或0.013.0mmol/l，这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。第33页/共85页v2 2、S S浓度变化对浓度变化对的影响的影响v(1)S(1)S很小很小(SK(SK(SKS S)时，时，K KS SSS,SS,=maxmax。第34页/共85页限制性基质浓度与微生物生长比速之间的关系限制性基质浓度与微生物生长比速之间的关系第35页/共85页斜率斜率Monod方程式双倒数图方程式双倒数图第36页/共85页v微生物生长的发酵过程，同样存在抑制作用。微生物生长的发酵过程，同样存在抑制作用。v竞争性抑制：竞争性抑制：非竞争性抑制：非竞争性抑制：第37页/共85页v第三节第三节 微生物发酵动力学微生物发酵动力学v一般说来，一般说来，M M生长培养和发酵方式有生长培养和发酵方式有分批发酵：分批发酵：底物一次装入罐内，在适宜条件下接种进行反应，经过一定时间后将全部反应系取出。连续发酵：连续发酵：反应开始后，一方面把底物连续地供给到反应器中，另一方面又把反应液连续不断地取出，使反应条件不随时间变化。补料发酵补料发酵:是指先将一定量底物装入罐内，在适宜条件下接种使反应开始。反应过程中，将特定的限制性底物送入反应器，以控制罐内限制性底物浓度保持一定，反应终止取出反应体系。第38页/共85页一、一、微生物分批发酵生长动力学微生物分批发酵生长动力学1、分批发酵的不同阶段：、分批发酵的不同阶段：时间菌体浓度延迟期指数生长期减速期静止期衰亡期延迟期：指数生长期:减速期:静止期：衰亡期:第39页/共85页(1)停滞期停滞期v停滞期是微生物细胞适应新环境的过程。v接种物的生理状态和浓度影响停滞期的长短。解决途径：解决途径：v一是尽量选择处于指数生长期的种子一是尽量选择处于指数生长期的种子。v二二是是扩扩大大接接种种量量。但但是是，如如果果要要扩扩大大接接种种量量，又又往往往往需需要要多多级级扩扩大大制制种种，这这不不仅仅增增加加了了发发酵酵的的复复杂杂程程度度，又又容容易造成杂菌污染，故而应从多方面考虑。易造成杂菌污染，故而应从多方面考虑。第40页/共85页(2)对数生长期对数生长期v处于对数生长期的微生物细胞的生长速率大大加快，单位时间内细胞的数目或质量的增加维持稳定，并达到最大值。v此时，如以细胞数目或生物质量的对数值对培养时图，将得一直线，该直线的斜率就等于。第41页/共85页v 细细胞胞浓浓度度增增长长一一倍倍所所需需时时间间称称为为倍倍增增时时间间(doubling time)或增代时间或增代时间(generation time)，v 微微生生物物细细胞胞的的倍倍增增时时间间较较短短。细细菌菌一一般般为为0.25-1h，酵母菌约为酵母菌约为1.15-2h;霉菌约为霉菌约为2-6.9h；v 动动植植物物细细胞胞的的倍倍增增时时间间较较长长，如如哺哺乳乳动动物物细细胞胞的的td一一般为般为15-100h；植物细胞约为植物细胞约为24-74h。第42页/共85页例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l)6 33 64 153 221(h-1)0.06 0.24 0.43 0.66 0.70求在该培养条件下，求大肠杆菌的max，Ks和td?解：将数据整理：S/100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221第43页/共85页max，1.11(h-1);Ks97.6 mg/Ltdln2/max0.624 h第44页/共85页微生物的最大比生长速率在工业上的意义微生物的最大比生长速率在工业上的意义v为为保保证证工工业业发发酵酵的的正正常常周周期期，要要尽尽可可能能地地使使微微生生物物的比生长速率接近其最大值。的比生长速率接近其最大值。v最最大大比比生生长长速速率率不不仅仅与与微微生生物物本本身身的的性性质质有有关关，也也与所消耗的底物以及培养的方式有关。与所消耗的底物以及培养的方式有关。v限限制制微微生生物物生生长长代代谢谢的的并并不不是是发发酵酵液液中中营营养养物物质质的的浓度，而是营养物质进入细胞的速度。浓度，而是营养物质进入细胞的速度。第45页/共85页(3)稳定期稳定期v在在细细胞胞生生长长代代谢谢过过程程中中，培培养养基基中中的的底底物物不不断断被被消消耗耗，一一些些对对微微生生物物生生长长代代谢谢有有害害的的物物质质在在不不断断积积累累。受受此此影影响响，微微生生物物的的生生长长速速率率和和比比生生长长速速率率就就会会逐逐渐渐下下降降，直至完全停止，这时就进入稳定期。直至完全停止，这时就进入稳定期。v处处于于稳稳定定期期的的生生物物量量增增加加十十分分缓缓慢慢或或基基本本不不变变；但但微微生生物物细细胞胞的的代代谢谢还还在在旺旺盛盛地地进进行行着着，细细胞胞的的组组成成物物质质还在不断变化。还在不断变化。v微微生生物物的的很很多多代代谢谢产产物物，尤尤其其是是次次级级代代谢谢产产物物，是是在在进入稳定期后才大量合成和分泌的。进入稳定期后才大量合成和分泌的。第46页/共85页(4)衰亡期衰亡期v在衰亡期，细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽，不能再维持细胞的生长和代谢，因而细胞开始死亡。v在发酵工业生产中在进进入入衰衰亡亡期期之之前前应及时将发酵液放罐处理。第47页/共85页v2 2、微生物生长速度的动力学方程、微生物生长速度的动力学方程v 比生长速率受限制性基质浓度的影响。二者之间的比生长速率受限制性基质浓度的影响。二者之间的关系由关系由MonodMonod式描述：式描述：当存在当存在多种限制性营养基质多种限制性营养基质时，方程可改为时，方程可改为:如果所有营养物过量，也无抑制性因素时，细胞生如果所有营养物过量，也无抑制性因素时，细胞生长可处于对数生长期，可达到长可处于对数生长期，可达到=maxmax。第48页/共85页v二、营养利用和产物生成动力学二、营养利用和产物生成动力学v1.1.反应速度方程式的推导反应速度方程式的推导 F,SF,S0 0,X,X0 0V,S,XV,S,X，P PF,S,X,PF,S,X,PF,FF,F：基质流量：基质流量(L/h)(L/h)；X X：细胞浓度细胞浓度(g(g菌体菌体/L)/L)；V V：发酵液体积发酵液体积(L);(L);S S0 0：流入基质浓度流入基质浓度(g(g基质基质/L)/L)S S：流出基质浓度流出基质浓度(g(g基质基质/L)/L)Y YX/SX/S：基质的菌体得率基质的菌体得率(g(g菌体菌体/g/g基质基质)Y YP/SP/S：基质的产物得率基质的产物得率(g(g产物产物/g/g基质基质)Q QP P：比产物生成速率比产物生成速率(g(g产物产物/g/g菌体菌体.h).h)P P：发酵液中产物浓度发酵液中产物浓度(g(g产物产物/L);/L);第49页/共85页v 根据体系物料平衡原理有：根据体系物料平衡原理有：v(1)(1)菌体增长：菌体增长：(2)(2)限制性基质消耗限制性基质消耗v（3 3）产物生成）产物生成第50页/共85页v菌体浓度变化：菌体浓度变化：产物浓度变化：产物浓度变化：对于分批发酵，对于分批发酵，F F，F F0 0，考虑产物不分解，考虑产物不分解，则分批发酵动力学为：则分批发酵动力学为：第51页/共85页v二、补料分批培养二、补料分批培养间歇补料操作间歇补料操作连续补料操作连续补料操作按操作方式按操作方式v高底物浓度的优缺点高底物浓度的优缺点v提提高高底底物物浓浓度度可可以以延延长长微微生生物物的的指指数数生生长长期期，从从而而提提高高发发酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度；酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度；v但但过过高高的的底底物物浓浓度度往往往往会会引引起起一一系系列列的的不不利利影影响响，如如底底物物抑制、粘度升高引起的抑制、粘度升高引起的传质效率传质效率降低等。降低等。v尤为严重的是，微生物的许多次级代谢产物的产生，都受尤为严重的是，微生物的许多次级代谢产物的产生，都受高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解产物高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解产物的的抑制抑制。第52页/共85页1 1、单一补料分批培养、单一补料分批培养所谓分批补料培养技术，就是指在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。v特点特点v由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，分批补料系统不再是一个封闭的系统。v分批补料系统不向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。第53页/共85页流加发酵反应器中细胞、基质和产物总量的变化速率：第54页/共85页v细胞总量的变化率细胞总量的变化率v如果进行恒速流量为如果进行恒速流量为F，则，则设v同理可得基质和产物浓度的变化率同理可得基质和产物浓度的变化率第55页/共85页v随着培养基的流加，随着培养基的流加，细胞细胞浓度逐渐增大，浓度逐渐增大，限制性限制性基质基质浓度逐渐减小，最后浓度逐渐减小，最后限制性基质浓度趋向零限制性基质浓度趋向零，而而细胞浓度则趋于定值细胞浓度则趋于定值,dS/dt=0，dX/dt 0,进入进入拟稳态拟稳态。这时。这时D。v连续补料分批培养数属半恒稳状态（拟稳态），与恒连续补料分批培养数属半恒稳状态（拟稳态），与恒稳状态稳状态D D不同。在半恒稳状态下有：不同。在半恒稳状态下有：v因培养液体积在逐渐增大，所以因培养液体积在逐渐增大，所以稀释率和比生长稀释率和比生长速率渐渐减小速率渐渐减小。第56页/共85页2、补料分批培养应用：以某些很容易被微生物利用的物质（如葡萄糖）作为碳以某些很容易被微生物利用的物质（如葡萄糖）作为碳源时，其某些分解代谢物会使细胞某些酶的合成受到阻遏；源时，其某些分解代谢物会使细胞某些酶的合成受到阻遏；采用补料的手段将葡萄糖逐渐加入反应器中，使发酵液采用补料的手段将葡萄糖逐渐加入反应器中，使发酵液中的葡萄糖保持在低水平，避免分解代谢物的积累，从而中的葡萄糖保持在低水平，避免分解代谢物的积累，从而可以有效去阻遏。可以有效去阻遏。1）细胞的高密度培养 一般培养基中的营养物质浓度有一定的限度，过高的底一般培养基中的营养物质浓度有一定的限度，过高的底物浓度会抑制菌体的生长；物浓度会抑制菌体的生长；采用补料的方法将高浓度的营养物质逐渐加入反应器，采用补料的方法将高浓度的营养物质逐渐加入反应器，可使发酵液中的菌体浓度达到很高的程度，如大肠杆菌浓可使发酵液中的菌体浓度达到很高的程度，如大肠杆菌浓度可达度可达145g/L145g/L。2）发生底物抑制的过程一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生产产生抑制。物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生产产生抑制。3）分解代谢物阻遏4）营养缺陷型菌株的培养 一些营养缺陷型菌株可以积累某种有用产物，如氨基一些营养缺陷型菌株可以积累某种有用产物，如氨基酸、核苷、核苷酸等，利用这些菌株进行生产时须补酸、核苷、核苷酸等，利用这些菌株进行生产时须补充其不能合成的物质供生产所需；充其不能合成的物质供生产所需；但这些物质过量存在时，可能产生反馈抑制或阻遏作但这些物质过量存在时，可能产生反馈抑制或阻遏作用，影响产物的合成。用，影响产物的合成。采用补料的方法可将这些物质保持在低浓度水平，有采用补料的方法可将这些物质保持在低浓度水平，有助于提高产物的生产。助于提高产物的生产。5）前体的补充 在一些发酵过程中，加入前体可使产物的生产大大增在一些发酵过程中，加入前体可使产物的生产大大增加；加；但许多前体对菌体有毒性；但许多前体对菌体有毒性；通过补料加入前体既满足产物合成的需要，又不使前通过补料加入前体既满足产物合成的需要，又不使前体大量积累而产生抑制作用。体大量积累而产生抑制作用。第57页/共85页v(一一)连续培养设备类型连续培养设备类型均匀混合反应器均匀混合反应器恒化器恒化器恒浊器恒浊器连续培养设备连续培养设备活塞流反应器活塞流反应器v 1 1均匀混合的生物反应器均匀混合的生物反应器 v在在这这种种反反应应器器中中，培培养养基基经经搅搅拌拌而而混混合合均均匀匀，反反应应器器中中的的各各部部分培养基间分培养基间不存在浓度梯度不存在浓度梯度。v操操作作：对对数数期期后后期期，以以一一定定的的速速度度流流进进新新鲜鲜培培养养基基，同同时时以以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡。溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡。v三、连续培养三、连续培养第58页/共85页v(1)恒恒化化器器 是一种使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。v称为外控制式的连续培养装置，通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的稳态连续培养。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却保持稳定菌体密度的菌体。v在恒化器中，一方面菌体密度会随时间增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。第59页/共85页第60页/共85页v(2)(2)恒恒浊浊器器 是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。v可称为内控制式的连续培养装置，当培养基的流速低于微生物生长速度时，菌体密度增高，这时通过光电控制系统的调节，可促使培养液流速加快，反之亦然，并以此来达到恒密度的目的。因此，这类培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的。v在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。在生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。第61页/共85页群体生长速率与临界底物浓度的关系第62页/共85页v恒浊器与恒化器的比较恒浊器与恒化器的比较装置装置控制控制对象对象培养基培养基培养基流速培养基流速恒浊器恒浊器菌体密度（内控制）菌体密度（内控制）无限制生长无限制生长因子因子不恒定不恒定恒化器恒化器培养基流速（外控制）培养基流速（外控制）有限制生长有限制生长因子因子恒定恒定第63页/共85页v 2，活塞流反应器v这是一种不均一的管状反应器，培养基由反应器的一端流入，而从另一端流出。v在这种反应器中，没有返混现象，因而，反应器内的培养基呈极化状态，在其不同的部位，营养物的成分、细胞数目、传质效果、氧供应和生产量都不相同。v对于这类反应器，在其入口处，加入物料的同时也必须加入微生物细胞。通常是在反应器的出口处装一支路，使细胞返回，也可以来自另一连续培养装置(种子供应系统)。第64页/共85页管道非均匀混合连续发酵第65页/共85页连续培养的优点：连续培养的优点：1 1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量。免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量。2 2）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；3 3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。第66页/共85页v连续培养在生产上的应用还很有限的原因连续培养在生产上的应用还很有限的原因v许许多多方方法法只只能能连连续续运运转转20一一200小小时时，而而工工业业系系统统则则要要求求必须能稳定运行必须能稳定运行500一一1000小时以上；小时以上；v工业生产规模长时间保持工业生产规模长时间保持无菌状态无菌状态有一定困难；有一定困难；v连连续续培培养养所所用用培培养养基基的的组组成成要要保保持持相相对对稳稳定定，这这样样才才能能取取得得最最大大产产量量，而而工工业业培培养养基基的的组组成成成成分分，如如玉玉米米浆浆、蛋蛋白白胨胨和淀粉等，在批与批之间有时会出现较大变化；和淀粉等，在批与批之间有时会出现较大变化；v当当使使用用高高产产菌菌株株进进行行生生产产时时，回回复复突突变变可可能能发发生生。在在连连续续培培养养过过程程中中，回回复复突突变变的的菌菌株株有有可可能能会会取取代代生生产产菌菌株株而而成成为为优势菌株。优势菌株。v对对于于某某些些原原材材料料价价格格昂昂贵贵的的产产品品，由由于于连连续续发发酵酵对对基基质质利利用率较低用率较低，往往造成生产成本的增加。，往往造成生产成本的增加。第67页/共85页（二）连续发酵动力学（二）连续发酵动力学v物料衡算物料衡算v积累速率流入速率积累速率流入速率-流出速率流出速率-反应消耗速率反应消耗速率vS：限制性底物浓度（g/L）vX：菌体浓度（g/L）vP：产物浓度（g/L）vV：培养液体积（L）vF：培养基体积流率（L/h）v假定：培养假定：培养(发酵发酵)是在理想状态下进行。是在理想状态下进行。v(1)(1)物料进罐就混合均匀；物料进罐就混合均匀；v(2)(2)罐内无菌体死亡；罐内无菌体死亡；F,SF,S0 0,X,X0 0V,S,X,PV,S,X,PF,S,X,PF,S,X,P第68页/共85页v1 1、细胞衡算：、细胞衡算：v 对于连续发酵系统，细胞平衡为：对于连续发酵系统，细胞平衡为：在流加新鲜培养基和忽略细胞死亡的情况下，在流加新鲜培养基和忽略细胞死亡的情况下，则有：则有：流量与培养液体积之比称为流量与培养液体积之比称为稀释率稀释率，用，用D(1/时间时间)表示：表示：第69页/共85页v要使连续系统稳定运行，必有：要使连续系统稳定运行，必有：v 是一个表示是一个表示M M性质的参数；性质的参数；v D是一个操作参数；是一个操作参数；v 单罐连续培养：在一定范围内，人为调节培养基的单罐连续培养：在一定范围内，人为调节培养基的流加速率，可以使细胞按所希望的比生长速率来生长。流加速率，可以使细胞按所希望的比生长速率来生长。第70页/共85页v2 2、限制性基质物料平衡、限制性基质物料平衡稳定状态时，系统内：稳定状态时，系统内：在这种情况下，细胞浓度为：在这种情况下，细胞浓度为：+第71页/共85页v2 2、限制性基质物料平衡、限制性基质物料平衡细胞浓度为：细胞浓度为：由由MonodMonod式可知：式可知：第72页/共85页v3 3、产物衡算、产物衡算恒稳状态时：恒稳状态时：则有：则有：第73页/共85页vDc：流出液中的基质浓度与流入液流中的基质浓度相流出液中的基质浓度与流入液流中的基质浓度相等时的最小稀释率（等时的最小稀释率（S=S0）。）。v此时可能达到的比生长速率此时可能达到的比生长速率，当当D Dc 时时，稀释率超出临界稀释率，细胞的生长速，稀释率超出临界稀释率，细胞的生长速率跟不上稀释速率，反应器中的细胞浓度不断降低，率跟不上稀释速率，反应器中的细胞浓度不断降低，最后细胞从反应器中被洗出最后细胞从反应器中被洗出(wash out)。当当D Dx增加s下降A B下降BKs，则，则第77页/共85页vD与与X、S、DX的关系如图所示的关系如图所示:XDXSD D第78页/共85页（三）连续培养与分批培养的比较（三）连续培养与分批培养的比较v 假定分批培养的指数生长期延续到限制性基质耗尽，则分假定分批培养的指数生长期延续到限制性基质耗尽，则分批培养的生产周期批培养的生产周期v其中其中 X0 细胞初始浓度细胞初始浓度 v XF 细胞最大细胞浓度细胞最大细胞浓度v tB 分批培养一个生产周期所需时间；分批培养一个生产周期所需时间；v tL 延迟期所占用时间；延迟期所占用时间；v tR 放出培养液所用时间；放出培养液所用时间；v tP 清洗反应器，重新加入培养基、灭菌、冷却等操清洗反应器，重新加入培养基、灭菌、冷却等操作所需时间。作所需时间。第79页/共85页v分批培养分批培养的细胞生产率的细胞生产率v连续培养连续培养中、可忽略辅助操作等时间中、可忽略辅助操作等时间v连续培养连续培养PCC与批式培养与批式培养PBC之比之比vv 可见细胞的比可见细胞的比生长速率生长速率越大，越大，辅助操作时间辅助操作时间越长，连续越长，连续培养的优势就越大。培养的优势就越大。第80页/共85页v(四四)带有细胞再循环的单级恒化器带有细胞再循环的单级恒化器F FF FcXcX，S S，P P(1+(1+)F)F浓缩的细胞浓缩的细胞流入基质流入基质F,SF,S0 0连续离心机连续离心机V,X,S,PV,X,S,PF,F,1-1-(c-1)X,(c-1)X,S,P S,P流出液体的流出液体的循环比为循环比为，菌体分离器菌体分离器浓缩率为浓缩率为c(1)第81页/共85页v设：流出液体的设：流出液体的循环比为循环比为，菌体分离器，菌体分离器浓缩浓缩率为率为c(1)，根据质量守恒定律，则，根据质量守恒定律，则X和和S的物料的物料衡算分别为：衡算分别为：第82页/共85页由式由式(A)(A)有：有：由式由式(B)(B)有：有：当系统处于拟稳态时：当系统处于拟稳态时：第83页/共85页v若令若令(1+-c)=K，则：则：在这种情况下，临界稀释速率在这种情况下，临界稀释速率D Dc c同时，结合式同时，结合式(C)和和Monod方程，有：方程，有：第84页/共85页v纤维素酶固态发酵动力学的研究第85页/共85页